Abstrakt

Rośliny od wieków są dla człowieka źródłem substancji leczniczych. Zdobycze dzisiejszej nauki, w tym biotechnologii molekularnej, pozwalają w coraz większym stopniu korzystać z ich ogromnego potencjału. Stały się m.in. obiecującą platformą wykorzystywaną do wytwarzania cennych związków o charakterze biofarmaceutyków. Wśród różnych systemów roślinnych stosowanych do tego celu znajdują się również kultury korzeni włośnikowatych, od pewnego czasu wykorzystywane do produkcji rekombinowanych białek i metabolitów wtórnych. Komórki roślinne pochodzące z gatunków do tego przeznaczonych są poddawane procesowi transformacji genetycznej z wykorzystaniem wybranych szczepów Agrobacterium rhizogenes będących nośnikiem pożądanych genów. Następne etapy prac zmierzają do uzyskania trwałej i wydajnej ekspresji tych genów. Kultury korzeni włośnikowatych wyróżnia wiele cech preferujących je zarówno wobec wielu systemów pro-, jak i eukariotycznych, w tym również innych modeli roślinnych. Ich najważniejszymi zaletami są: relatywnie niskie koszty wytwarzania, łatwość skalowania produkcji związków, typowa dla komórek eukariotycznych obróbka potranslacyjna białek, biologiczne bezpieczeństwo, a w wielu przypadkach również brak konieczności stosowania złożonych technik oczyszczania finalnego produktu. Liczne związki, które z powodzeniem są uzyskiwane za pomocą wspomnianych kultur należą do cennych farmaceutyków. Do grupy tej należą m.in. wybrane cytokiny, antygeny szczepionkowe czy przeciwciała.

Wstęp

Systemy oparte na wykorzystaniu komórek roślinnych coraz częściej stają się atrakcyjną alternatywą wobec wcześniej stosowanych modeli eukariotycznych i bakteryjnych, wykorzystywanych w wytwarzania i pozyskiwaniu różnorodnych biocząsteczek. Do grupy tych związków, obok wielu cennych metabolitów wtórnych, zaliczyć można m.in. rekombinowane białka o cechach farmaceutyków. O zaletach roślin w omawianym kontekście decyduje kilka podstawowych czynników. Przede wszystkim, wyróżnia je szybki przyrost biomasy przy stosunkowo niskich kosztach. System produkcyjny, w zależności od potrzeb, można dość łatwo przeskalować, co w kontekście docelowej produkcji na skalę przemysłową jest bardzo istotne. Kolejnymi walorami układów roślinnych są ich pełne możliwości w zakresie potranslacyjnej modyfikacji (często warunkuje ich aktywność i swoistość), typowej dla wielu białek pochodzenia eukariotycznego. Taki sposób wytwarzania białek eliminuje też ryzyko przenoszenia zwierzęcych bądź ludzkich patogenów, czyniąc produkt bardziej bezpieczny. Zapewnia ponadto możliwość wyboru tkanki/organu, w której pożądany produkt ma być kumulowany. Z komercyjnego punktu widzenia wspomnieć należy również o cennej możliwości obniżenia kosztów produkcji niektórych białek wynikającej z braku konieczności stosowania skomplikowanych i kosztownych procedur ich oczyszczania [77].

Kultury korzeni włośnikowatych, obok wymienionych zalet, mają również swoje ograniczenia w porównaniu np. do kultur zawiesinowych. Wykazują wolniejszy wzrost, wolniejszy też bywa proces powstawania niektórych bia- łek (np. przeciwciał), ale charakteryzuje je cenna, długoterminowa stabilność [59].

Wytwarzanie w komórce roślinnej pożądanego białka, poprzedza wprowadzenie do niej stosownego genu, następnie jego integracja z genomem gospodarza i stabilna ekspresja na zadowalającym poziomie. Miejscem docelowej lokalizacji transgenu po transformacji wykonywanej z wykorzystaniem szczepów Agrobacterium może być genom jądrowy lub chloroplastowy, a ostateczne efekty w postaci wytwarzania białek mogą wynikać z ekspresji trwałej lub alternatywnej ekspresji przejściowej uzyskiwanej zwykle w wyniku agroinfiltracji. Zaletą tego podejścia jest możliwość uzyskania białka znacznie szybciej niż w przypadku ekspresji trwałej. Inna z transformacji polega na zakażeniu rośliny nietransformowanej wirusem roślinnym, do genomu którego wprowadzono gen odpowiadający za ekspresję wybranego białka. Obok podstawowych modeli transformacji, stosuje się też różnego rodzaju modyfikacje wynikające z indywidualnych cech gatunków wybranych do transformacji, rodzaju tkanki oraz właściwości produkowanego w nich białka [5].

Gatunkiem uznawanym za modelowy w omawianych badaniach jest od lat Nicotiana tabacum (tytoń szlachetny) i pokrewny mu Nicotiana benthamiana. Bogata wiedza na ich temat w połączeniu z licznymi zaletami tych gatunków sprawiają, że to właśnie one są często stosowane jako swoista platforma do wytwarzania zróżnicowanych białek terapeutycznych. Tytoń jest też gatunkiem, na którym opracowano skuteczne i efektywne metody transformacji genetycznej, regeneracji roślin jak również metody upraw polowych, szklarniowych, warunki hodowli kultur komórkowych, metody ekspresji obcych białek, uzyskiwano też wysoką wydajność biomasy [45,70,73]. Podobnie jak inne komórki roślinne również te mają zdolność pełnej potranslacyjnej obróbki białek, a cenne związki otrzymywane były zarówno na drodze ekspresji trwałej, jak i przejściowej. W pierwszym przypadku transgen integruje się z genomem jądrowym lub chloroplastowym, w drugim jest wprowadzany do komórki z wektorem poprzez agroinfekcję lub infekcję wirusową i nie wbudowuje się w genom gospodarza. Spektrum rekombinowanych bia- łek otrzymanych w tkankach tytoniu jest bardzo szerokie. Na liście tej znajdują się m.in. liczne przeciwciała, różnorodne cytokiny lub antygeny o charakterze szczepionek [5,6,7,13,36]. Ograniczając się jedynie do ostatniej z wymienionych grup, do bardziej spektakularnych osiągnięć zaliczyć można wyprodukowanie w komórkach tytoniu antygenu powierzchniowego HbsAg wirusa hepatitis B, białka kapsydu wirusa Norwalk (NVCP), hemaglutyniny wirusa odry (MV-H), podjednostki B toksyny Vibrio cholerae (CTB), białka L1 kapsydu HPV11 (wszystkie w wyniku trwałej ekspresji genomu jądrowego); białka L1 otoczki wirusa HPV brodawczaka ludzkiego, białka HEV E2 wirusa zapalenia wątroby typu E, białka powierzchniowe OspA Borellia burgdorferi (ekspresja trwała, genom chloroplastowy); antygenu hemaglutyninowego (AH) wirusa grypy, antygenu wirusa grypy ptasiej H5/HA1, epitopu HPV16 wirusa brodawczaka ludzkiego (wynik ekspresji przej- ściowej z udziałem wektora, infekcja Agrobacterium) czy białka kapsydu rotawirusa, glikoproteiny wirusa wścieklizny, onkoproteiny E7 brodawczaka ludzkiego typu 16 (ekspresja przejściowa wywołana infekcją wirusową) [5].

Powyższe rezultaty uzyskiwano z wykorzystaniem wielu systemów. Jednym z nich jest możliwość tworzenia rekombinowanych białek w kulturach korzeni włośnikowatych (hart root cultures, HR) [80]. Ich potencjał w opisywanym aspekcie został dostrzeżony stosunkowo późno. Wcześniej proces generowania korzeni włośnikowatych był kojarzony głównie ze stratami w uprawach roślin dwuliściennych, powodowanymi infekcjami wywołanymi przez Gram-ujemne bakterie glebowe rodzaju Agrobacterium, a wśród nich najlepiej poznane Agrobacterium rhizogenes. Oprócz genomowego DNA zawierają one cząsteczki megaplazmidów, których wielkość oscyluje w granicach 150-200 tys. pz, choć zdarzają się i takie, które osiągają 800 tys. pz [18]. W ich strukturze zlokalizowano geny decydujące o szczególnych cechach tych bakterii. W procesie agroinfekcji kluczową rolę odgrywają sekwencje obecne w trzech regionach. Są to: T-DNA, w którym są umieszczane transgeny mające docelowo trafić do komórek rośliny, a także geny odpowiedzialne za wywoływanie symptomów choroby, metabolizm auksyn, cytokin oraz syntezę opin. Kolejnym jest region wirulencji z zespołem genów vir, podobnie jak poprzedni zlokalizowany w strukturze plazmidu. Trzeci region istotny dla procesu agroinfekcji to chv, obecny w chromosomie bakteryjnym, odpowiada za przytwierdzenie bakterii do powierzchni rośliny [18,75]. Elementy te nadają komórkom Agrobacterium cechy pozwalające na ich szerokie wykorzystanie w procesach transformacji genetycznej.

Indywidualne cechy gatunków sprawiają, że niektóre z nich wykazują oporność względem transformacji prowadzonej tym sposobem, ponadto nie każdy szczep bakteryjny cechuje porównywalny stopień wirulencji wobec określonego gatunku roślin. Dlatego niezwykle istotnym czynnikiem powodzenia eksperymentu jest interakcja na linii roślina-bakteria i wynikająca z niej kwestia wła- ściwego doboru gatunku i szczepu bakteryjnego, wykorzystywanego do agroinfekcji. Pożądana jest więc jego wysoka wirulencja, a jednocześnie, wywoływany przez nią swoisty szok w komórkach rośliny nie może prowadzić do zaburzeń prawidłowego przebiegu jej procesów życiowych [32].

Szczepy A. rhizogenes w genetycznej transformacji

Podstawą klasyfikacji szczepów A. rhizogenes jest rodzaj kodowanych w  nich opin. Biorąc powyższe pod uwagę, wyróżnia się szczepy: agropinowe (przedstawiciele to m.in.: A4, 15834, 1855, LBA 9402), indukujące wytwarzanie agropiny, mannopiny i kwasu atropinowego; ponadto szczepy mannopinowe oraz kukumopinowe [4]. Opiny to metabolity pojawiające się w komórkach ro- ślinnych w wyniku ekspresji genów otrzymanych po infekcji Agrobacterium. Nie są przyswajane przez roślinę, stanowią natomiast źródło azotu i węgla dla bakterii [75]. Do tej pory brak jednoznacznych danych pozwalających wyjaśnić czy i ewentualnie jaki związek zachodzi między rodzajem wytwarzanej opiny a cechami poszczególnych szczepów bakterii. Wydaje się jednak, że może mieć zwią- zek z poziomem ich zjadliwości [35]. W plazmidach szczepów oktopinowych potwierdzono np. obecność genu wirulencji virF, którego są pozbawione szczepy nopalinowe i w którym upatruje się wpływu na zjadliwości bakterii wobec testowanych gatunków roślin (znacząco wyższa u oktopinowych).

Geny wirulencji mają zasadniczy wpływ na powodzenie procesu transformacji. Szczepy określane jako superwirulentne (zawierają dodatkowe geny vir) transformują rośliny bardziej efektywnie. Ma to szczególne zastosowanie w odniesieniu do roślin jednoliściennych, ogólnie uznawanych za wysoce oporne na transformację z wykorzystaniem Agrobacterium [2,43,85]. Wprowadzenie dodatkowych genów wirulencji, np. do szczepu LBA4404 Agrobacterium tumefaciens pozwoliło na wysoce wydajną transformację Vigna unguiculata, rośliny mało podatnej na transformacje z wykorzystaniem wspomnianej bakterii [61].

Zastosowanie kultur HR

Trzy ostatnie dekady to okres większego zainteresowania możliwościami wykorzystywania Agrobacterium rhizogenes do szerokich zastosowań. Wśród nich wymienia się badania szlaków biosyntezy i procesów fizjologicznych, wytwarzanie cząsteczek pochodzenia roślinnego, metabolitów wtórnych (m.in. alkaloidów, fenoli, terpenów), zastosowanie do procesów fitoremediacji (np. substancji toksycznych i barwników reaktywnych) oraz do tworzenia w nich rekombinowanych białek (np. interferonu, interleukin) [12,33,38]. Kultury korzeni włośnikowatych są też poddawane regeneracji, w efekcie której można otrzymać odmienny fenotyp, np. rośliny o niewielkich rozmiarach. Uchodzą one ponadto za przydatny model do badań genetycznego i biochemicznego podłoża licznych szlaków biochemicznych, systemów wiązania azotu, niedoboru żelaza, toksyczności metali czy badania interakcji patogen-gospodarz [42].

Opisywane kultury są również wykorzystywane w procesach biotransformacji rozumianych jako regioselektywne i stereoswoiste chemiczne przekształcenia, katalizowane za pomocą systemów biologicznych przez ich enzymy. Szeroka gama produktów naturalnych może być biotransformowana i wykorzystywana do tworzenia bibliotek związków analogowych przez enzymy komórek roślinnych. W kulturach tych przeprowadza się wiele różnorodnych reakcji chemicznych, w tym: hydroksylacja, glikozylacja, glukozylacja, uwodornienie, hydroliza, acetylowanie, metylacja, izomeryzacja i estryfikacja. Prowadzą one do nadania pożądanych aktywności cennym biologicznie związkom [3].

Korzenie włośnikowate wyróżnia charakterystyczna budowa, która odróżnia je od korzeni fizjologicznie wystę- pujących w roślinach, a jednocześnie sprawia, że jej cechy umożliwiają wykorzystanie ich do celów omawianych w prezentowanej pracy. Wśród nich wymienić można plagiotropizm, tj. rodzaj ukierunkowanej reakcji na bodźce oraz rozrost korzeni bocznych. Plagiotropizm podczas prowadzenia tych kultur wynika z większego napowietrzenia w pożywce płynnej oraz związaną z tym szybką akumulację biomasy [75]. Istotną przewagą korzeni wło- śnikowatych nad innymi kulturami (np. zawiesinowymi) jest ich wysoka stabilność genetyczna (w innych obserwowana jest np. zmienność somaklonalna), ważna w sytuacjach, kiedy hodowle są prowadzone przez dłuższy czas. Zaletą jest też brak konieczności dodawania do pod- łoża hormonów wzrostu w trakcie hodowli i możliwość jej prowadzenia w ściśle kontrolowanych warunkach, co zapewnia wytwarzanie rekombinowanych białek zgodnie z wymogami GMP (Dobra Praktyka Produkcyjna) [59]. Dużym ułatwieniem podczas procesu produkcyjnego jest także możliwość sekrecji produktu do podłoża. Rezultaty prac Gaume i wsp. wykazały, że zawartość ludzkiej fosfatazy alkalicznej uzyskiwanej w akumulowanej w kulturach korzeni włośnikowatych i korzeniach przybyszowych Nicotiana tabacum była bardzo podobna, za to ilość białka wydzielanego do podłoża w przypadku kultur HR była kilkukrotnie większa [11].

Wytwarzanie rozmaitych związków uzyskiwanych w opisywanych kulturach zwiększa dodatek do podłoża licznych elicytorów, z których kilka wymieniono w tab.1. Należą do nich zarówno związki o charakterze biotycznym, jak i abiotycznym, które indukują wytwarzanie metabolitów wtórnych jako przejaw reakcji obronnej roślin, w wyniku ekspresji genów związanych ze szlakami syntezy produktu [14].

Jednym z kryteriów podziału kultur korzeni włośnikowatych są okoliczności ich powstania, tj. czy wiąże się ono z procesami transformacji genetycznej, czy też nie. Nie transformowane kultury korzeni włośnikowatych mogą służyć m.in. jako bogate źródło związków fitochemicznych. Nie w każdej sytuacji transformacja genetyczna przynosi jednak pożądane rezultaty. Wykazano np., że ilość solaniny, cennego związku indukującego apoptozę komórek nowotworowych, wytwarzana w transformowanych i nietransformowanych korzeniach Solanum nigrum była podobna [55]. Poszczególne części roślin regenerowanych z korzeni transformowanych wyróżniała ponadto niższa akumulacja tego metabolitu niż w przypadku korzeni nietransformowanych [64]. Podobnie sytuacja wyglądała w przypadku transformacji Duboisia z użyciem A. rhizogenes, które wytwarzały mniej skopolaminy i hioscyjaminy niż rośliny nietransformowane [52]. Przykłady te dowodzą, że transformacja z użyciem A. rhizogenes nie zawsze prowadzi do zwiększenia akumulacji pożądanego produktu. Zdecydowana większość opisanych przypadków wskazuje jednak, że korzenie transformowane stają się bardziej wydajne do wytwarzania i pozyskiwania cennej substancji. Przykładem mogą być m.in. kultury Ajuga reptans, w których uzyskano 4-krotnie większe stężenie 20-hydroksyekdysteronu (związek zwiększający retencję azotu w organizmie i przyspieszający tempo syntezy białek) w porównaniu do roślin dzikich [75]. Z kolei Wang i wsp. poprzez infekcję za pomocą A.rhizogenes wprowadzili do Catharantus roseus nowe geny G10H i ORCA3 w celu modyfikacji szlaku syntezy katarantyny, związku, którego pochodne wyróżnia znaczący potencjał przeciwnowotworowy. W transformowanych korzeniach włośnikowatych zanotowano znaczący wzrost jej stężenia, ponad 6,5 razy wyższy wobec kultur niemodyfikowanych [72].

Wyciąg z korzenia dzwonkowca (Codonopsis lanceolata) jest źródłem cennych związków o właściwościach farmakologicznych. Wśród nich są m.in. saponiny, związki o bardzo szerokim zakresie działania i możliwościach aplikacyjnych (aktywność przeciwgrzybicza, przeciwbakteryjna, przeciwzapalna, a także przeciwnowotworowa) [40,68]. Kultury korzeni włośnikowatych tego gatunku wykorzystywano np. do produkcji saponin triterpenoidowych. Transformacja z wykorzystaniem A. rhizogenes (szczep R1000) przyniosła znacząco wyższą syntezę wspomnianych związków w porównaniu do kultur korzeni nietransformowanych. Wobec lancemazydu A, jednego z wyodrębnionych triterpenów, oprócz jego właściwości przeciwzapalnych, wykazano również aktywność przeciwnowotworową [28]. Przykłady te potwierdzają możliwość wykorzystywania transformowanych kultur HR do wytwarzania cennych związków terapeutycznych.

Niekiedy pozytywne efekty przynosi prowadzenie hodowli omawianych kultur w warunkach świetlnych. Klasyczne hodowle są prowadzone w ciemności, co stanowi imitację warunków naturalnych, kiedy korzenie rosną w glebie. Alternatywę wobec tej metody stanowią zielone korzenie włośnikowate, których hodowla jest prowadzona na świetle i może być wykorzystana do produkcji związków syntetyzowanych przez organy zawierające chlorofil. W tym celu wykorzystywane były np. rośliny rodzaju Asteraceae, Solanaceae i Cucurbitaceae czy kultury korzeni włośnikowatych Echinacea purpurea, rośliny bogatej w pochodne kwasu kawowego oraz alkamidów [75]. Na szczególną uwagę zasługuje kwas cykoriowy wykazujący właściwości antywirusowe, inhibuje integrazę HIV-1 oraz replikację tego wirusa. W kulturach HR odnotowano znaczący wzrost akumulacji pochodnych kwasu kawowego w warunkach świetlnych w porównaniu do hodowli prowadzonych w ciemności [1].

Rekombinowane białka otrzymywane w kulturach korzeni włośnikowatych

Wśród licznych i różnorodnych związków produkowanych w systemach HR i znajdujących, bądź mogących znaleźć, zastosowanie w terapii wielu chorób znaczącą pozycję stanowią rekombinowane białka. Można znaleźć wśród nich m.in. przedstawicieli cytokin, przeciwciał, antygenów czy enzymów. Poniżej krótko zaprezentowano wybrane przykłady tego rodzaju cząsteczek, których ekspresję uzyskano w kulturach korzeni włośnikowatych kilku gatunków roślin.

Cytokiny i hormon wzrostu – cytokiny stanowią zróżnicowaną grupę białek biorących udział w takich procesach, jak m.in. proliferacja, różnicowanie i ruch komórek. Zaangażowane są w odpowiedź immunologiczną, hemopoezę, proces gojenia ran czy procesy zapalne, aktywne są także w morfogenezie tkanek [41]. Należą do nich tak cenne związki, jak: interleukiny, hemopoetyny, nadrodzina czą- steczek TNF, interferony [50]. Obecnie, większość cytokin dla przemysłu farmaceutycznego jest wytwarzana w komórkach E.coli. Ograniczeniem tego systemu jest jednak brak możliwości glikozylacji związków, modyfikacji kluczowej dla prawidłowej aktywności wielu białek eukariotycznych. Produkcja cytokin, m.in. w związku z koniecznością ich oczyszczania, jest też dosyć kosztowna, a szansy uniknięcia tych problemów upatruje się w zastosowaniu do tego celu systemów roślinnych [70].

Do cytokin są też zaliczane interferony klasyfikowane w trzy podstawowe typy. Typ I jest reprezentowany przez 16 przedstawicieli, w tym interferony α i β, typ II (interferon γ) oraz typ III (rodzina interferonu λ) [16]. Wszystkie stanowią etap odpowiedzi komórki na infekcje wirusowe. Wyróżnia je zdolność indukowania fagocytozy, wpływ na wytwarzanie przeciwciał przez limfocyty B oraz stymulacja proliferacji komórek. Jako terapeutyk są stosowane w leczeniu osób zakażonych wirusem zapalenia wątroby, wirusem HPV oraz podczas leczenia nowotworów nerki, pęcherza, jajnika. Interferon ludzki z powodzeniem jest wytwarzany w kulturach korzeni włośnikowatych. Matvieieva i wsp. przeprowadzili transformację komórek Cichorium intybus L. oraz Lactuca sativa L. z wykorzystaniem A. rhizogenes i uzyskali trwałą ekspresję ludzkiego interferonu α2b. Ekstrakt pozyskany z korzeni włośnikowatych powstałych w wyniku agroinfekcji wykazywał wysoką aktywność przeciwwirusową wobec wirusa pę- cherzykowego jamy ustnej (Vesicular stomatitis virus, VSV) (1620–5400 IU/g) [38]. Luchakivskaya i wsp. podjęli próbę ekspresji interferonu α2b w komórkach Daucus carota L.

Badania były prowadzone z udziałem kultur zawiesinowych, kalusa oraz korzeni włośnikowatych. Wykazano, że aktywność przeciwwirusowa ma bezpośredni związek z rodzajem wektora stosowanego w transformacji. Jego promotor wyróżniał specyficzność wobec komórek korzenia. Poziom aktywności okazał się znacząco wyższy dla promotora Mll niż w przypadku tradycyjnie wykorzystywanego promotora 35S CaMV. Aktywność interferonu w kulturach zawiesinowych była zbliżona i niemal połowę wyższa niż w kulturze kalusa [34].

Natomiast interleukiny są zaangażowane w regulację odpowiedzi immunologicznej, procesy hematopoetyczne, indukcję proliferacji komórek NK, limfocytów T, B [41]. Wykorzystywane są w leczeniu takich schorzeń, jak: zapalenie kości i stawów, choroba Crohna, łuszczyca, astma czy czerniak [50]. W kulturach korzeni włośnikowatych N. tabaccum uzyskano trwałą ekspresję mysiej interleukiny-12, która może być stosowana w terapiach przeciwnowotworowych, a także jako rodzaj adiuwanta w szczepionkach. Interleukina-12 jest cytokiną prozapalną działającą na limfocyty B i T oraz komórki NK. Potencjalnie może być też stosowana w leczeniu chorych na raka ze względu na silną inhibicję angiogenezy i tumorogenezy. Wyniki badań Liu i wsp. potwierdziły możliwość wytwarzania interleukin za pomocą kultur korzeni włośnikowatych N. tabacum w hodowlach prowadzonych w bioreaktorach, gdzie stosunkowo łatwo zoptymalizować warunki pod ką- tem wytwarzania białek na szeroką skalę [33].

Hormon wzrostu – w kulturach korzeni włośnikowatych N. tabacum uzyskano również ekspresję somatotropiny, hormonu, którego niedobory powodują poważne stany patologiczne, takie jak m.in.: zwolniony wzrost, hipoglikemię czy żółtaczkę [56]. Próba otrzymania tego związku w kulturach korzeni włośnikowatych N. benthamiana z wykorzystaniem wektora 30B-hGH (oparty na strukturze wirusa mozaiki tytoniu), przyniosła pozytywne i trwałe rezultaty. W wyniku transformacji osiągnięto zadowalające rezultaty w postaci uzyskania 3-6 mg/kg hormonu wzrostu w świeżej masie [60].

Przeciwciała – przeciwciała monoklonalne o ściśle okre- ślonej swoistości, polegającej na łączeniu się z epitopem antygenu, są powszechnie wytwarzane w laboratoriach [57]. Ich celem jest wywołanie działania immunosupresyjnego. Stosowne przeciwciała są wykorzystywane w terapii m.in. nowotworu pęcherza [20], trzustki, glejaka, głowy [63], chorób autoimmunologicznych, astmy czy osteoporozy [47]. Pierwszym gatunkiem roślin wykorzystanym do produkcji pełnego przeciwciała (IgG) był tytoń [23]. Od tego czasu (1988 r.) otrzymano w nim przeciwciała monoklonalne kilku klas – IgG, wydzielnicze IgA (sIgA) oraz fragmentaryczne przeciwciała scFv i VHH są projektowane z myślą o zwalczaniu takich chorób, jak: AIDS, wąglik, wścieklizna, próchnica zębów czy licznych postaci nowotworów (raka jelita grubego, płuc, piersi, glejaka). Przeciwciała produkowane w tytoniu mają podobne właściwości jak ich odpowiedniki wytwarzane obecnie w komórkach ssaczych, niemniej wysokie koszty i ograniczona skala ich produkcji, sprawia intensyfikację starań nad opracowaniem nowych technologii produkcji tych białek, w tym również przeniesienia jej właśnie do komórek roślinnych (głównie N. tabacum i N. benthamiana) [23].

Pierwsze doświadczenia z bardziej znaczącą produkcją przeciwciał w kulturach korzeni włośnikowatych sięgają lat 90 XX w. Wongsamuth i Doran wykorzystali do tego celu komórki N. tabaccum, do których z użyciem A. rhizogenes wprowadzono gen kodujący mysie przeciwcia- ła monoklonalne IgG1 i uzyskano w pełni funkcjonalne i stabilne przeciwciało. Obecność w podłożu hodowlanym poliwinylopirolidonu i żelatyny pozwoliła podnieść wydajność do poziomu 43% białka w całkowitej puli białek rozpuszczalnych [78].

Prace Sharpa i Dorana dowiodły, że te same przeciwcia- ła otrzymywane w kulturach włośnikowatych tytoniu są kumulowane w ilości 6,5 razy większej niż w kulturach zawiesinowych. Dodatek antybiotyku bacytracyny do obu tych kultur spowodował stymulację tempa wzrostu biomasy o ponad 50% [58]. Efektywność produkcji również innych białek była pobudzana wprowadzaniem do pod- łoża związków o charakterze stymulatorów oraz takich, które zapewniały ich sekrecję do podłoża. W tytoniu, w wyniku udanej agroinfekcji, wywołano także ekspresję kolejnego z przeciwciał – M12 wykazującego zdolność wiązania witronektyny, białka osocza krwi zaangażowanego w procesy adhezji i migracji komórek. Wpływa ono na hemostazę nowotworu i jego przerzutów. Autorom badań udało się zwiększyć 30-krotnie efekt sekrecji przeciwciał przez dodanie do podłoża KNO3 , 1-naftalenooctowego oraz poliwinylopirolidonu jako środka stabilizującego. Do podłoża wydzielonych zostało ostatecznie 57% przeciwciał z ogólnej puli przeciwciał produkowanych w komórkach (5,9 mg/l) [19].

Antygeny – konsekwencje wirusowego zapalenia wątroby typu B w postaci przewlekłej bywają bardzo poważne, mogą spowodować marskością wątroby, a nawet raka (stosowne statystyki odnotowują 0,5-1 mln zgonów rocznie) [43]. W hodowlach korzeni włośnikowatych ziemniaka opracowano metodę produkcji antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg), a ekspresja tego białka osiągnęła poziom bliski 100 ng/g świeżej masy [67]. Wspomniany antygen udało się także otrzymać w korzeniach włośnikowatych N. tabacum na poziomie 0,01% wszystkich rozpuszczalnych białek [53]. W tytoniu udało się ponadto otrzymać powierzchniowy antygen ochronny, który poddano fuzji z podjednostką B toksyny cholery [30].

Enzymy – wśród nich cholinoesterazy mogą być wykorzystywane w oczyszczaniu organizmu z estrów kwasów fosforowych, co ma znaczenie w terapii osób narażonych na ekspozycję bojowych środków chemicznych oraz pestycydów. W systemach HR N. benthamiana uzyskano ekspresję tego enzymu na poziomie 3,3% wszystkich rozpuszczalnych białek, co stanowiło niemal 3 razy większą produkcję niż uzyskiwana w komórkach osobników rodzicielskich [79]. Innym enzymem, który udało się otrzymać w kulturach korzeni włośnikowatych N. tabacum jest fosfataza alkaliczna. We wspomnianych kulturach udało się wytworzyć 280 µg enzymu/g suchej masy [11].

Aktywator ludzkiego tkankowego plazminogenu to polipeptyd biorący udział w fibrynolizie. Przekształca plazminogen w  plazminę, a  ta rozkłada skrzepy fibryny w naczyniach krwionośnych. Białko to wyprodukowano w kulturach korzeni włośnikowatych Cucumis melo. Skonstruowano do tego celu wektory zawierające zwielokrotniony promotor genu rolD, dzięki czemu osiągnięto zadowalający poziom wytwarzania aktywatora plazminogenu (ok. 0,17 µg/mg) [15].

Kultury HR są dziś przede wszystkim wydajnym układem do otrzymywania szerokiej gamy metabolitów wtórnych o charakterze biofarmaceutyków czemu poświęcono wiele odrębnych artykułów [8,44,62]. Na tym polu biotechnologia roślin notuje najbardziej znaczące dokonania. W tabeli 2 przedstawiono przykłady wybranych związków o cechach biofarmaceutyków, które są wytwarzane w systemach hodowli HR uzyskanych z wykorzystaniem do tego celu szczepów A. rhizogenes.

Podsumowanie

Na tle znaczących efektów związanych z wykorzystaniem kultur HR do wytwarzania cennych metabolitów wtórnych, skalę produkcji rekombinowanych białek terapeutycznych ciągle należy uznać za stosunkowo niewielką. Niemniej przytoczone w pracy przykłady wskazują, że takie możliwości istnieją, a potencjał jakim omawiane systemy dysponują nie został jeszcze w pełni wykorzystany. Świadczy o  tym np. bardzo szerokie spektrum różnorodnych białek, które już udało się wyprodukować dzięki zastosowaniu szczepów Agrobacterium rhizogenes do infekcji roślin. Wśród nich wskazać można: szczepionki (np. antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby), przeciwciała (m.in. IgG1 ), enzymy (fosfataza alkaliczna, cholinoesteraza), interleukiny (IL-12), hormon wzrostu czy ludzki interferon. Wydaje się też, że coraz bardziej znaczący udział w opisywanych badaniach mogą mieć gatunki inne niż najchętniej wykorzystywane do tego celu N. tabacum i N. benthamiana. Zalety i bogate doświadczenia wyniesione z prac prowadzonych na tytoniu nadal czynią go najbardziej atrakcyjnym roślinnym modelem w opisywanych badaniach. Jednak niedawne, i co ważne, udane eksperymenty z innymi gatunkami roślin otwierają szersze niż dotychczas możliwości ich stosowania i wskazują, że poszukiwania idące również w tym kierunku stale są podejmowane. W grupie roślin, w których osiągnięto zadowalające rezultaty ekspresji i sekrecji pożądanych białek można wymienić np.: Cucumis melo (wytworzenie aktywatora ludzkiego plazminogenu tkankowego), Daucus carota (produkcja ludzkiego interferonu α2b), Cichorium intybus użyty do wytwarzania tego samego białka czy Datura metel do produkcji skopolaminy i hyoscjaminy w kulturach HR.

Koncern Pfizer jako pierwszy wprowadził ludzki terapeutyk produkowany w systemie roślinnym na rynek. Enzym taliglukaraza alfa będzie stosowany w terapii zastępczej choroby Gauchera i jest wytwarzany w komórkach Daucus carota. Produkt otrzymał akceptację Agencji Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA). Inne tego typu farmaceutyki są na różnych etapach badań klinicznych [80].

Biorąc pod uwagę przytoczone fakty związane z wykorzystaniem systemów korzeni włośnikowatych do produkcji związków o cechach biofarmaceutyków, a także ogólne zalety przypisywane roślinnym systemom ekspresyjnym, można przypuszczać, że ten kierunek prac badawczych nadal będzie rozwijany, czemu towarzyszyć powinno rosnące zainteresowanie ze strony przemysłu farmaceutycznego.

Przypisy

• 1. Abbasi B.H., Tian C.L., Murch S.J., Saxena P.K., Liu C.Z.: Light-enhancedcaffeic acid derivatives biosynthesis in hairy root culturesof Echinacea purpurea. Plant Cell Rep., 2007; 26: 1367-1372
  Google Scholar
• 2. Azhakanandam K., Mccabe M.S., Power J.B., Lowe K.C., CockingE.C., Davey M.R.: T-DNA transfer, integration, expression and inheritancein rice: effects of plant genotype and Agrobacterium super–virulence. J. Plant Physiol., 2000; 157: 429-439
  Google Scholar
• 3. Banerjee S., Singh S., Ur Rahman L.: Biotransformation studiesusing hairy root cultures – a review. Biotechnol. Adv., 2012; 30: 461-468
  Google Scholar
• 4. Bensaddek L., Villarreal M.L., Fliniaux M.A.: Induction and growthof hairy roots for the production of medicinal compounds. Electron.J. Integr. Biosci., 2008; 3: 2-9
  Google Scholar
• 5. Budzianowski J.: Nowa rola tytoniu – produkcja biofarmaceutyków.Przegl. Lek., 2009; 66: 894-897
  Google Scholar
• 6. Budzianowski J.: Tytoń – producent rekombinowanych interleukin.Przegl. Lek., 2012; 69: 1060-1062
  Google Scholar
• 7. Budzianowski J.: Tytoń – producent rekombinowanych przeciwciałmonoklonalnych. Przegl. Lek., 2011; 68: 981-986
  Google Scholar
• 8. Chandra S., Chandra R.: Engineering secondary metabolite productionin hairy roots. Phytochem. Rev., 2011; 10: 371-395
  Google Scholar
• 9. Condori J., Sivakumar G., Hubstenberger J., Dolan M.C., SobolevV.S., Medina-Bolivar F.: Induced biosynthesis of resveratrol and theprenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 in hairy root culturesof peanut: effects of culture medium and growth stage. PlantPhysiol. Biochem., 2010; 48: 310-318
  Google Scholar
• 10. Gangopadhyay M., Dewanjee S., Bhattacharya S.: Enhancedplumbagin production in elicited Plumbago indica hairy root cultures.J. Biosci. Bioeng., 2011; 111: 706-710
  Google Scholar
• 11. Gaume A., Komarnytsky S., Borisjuk N., Raskin I.: Rhizosecretionof recombinant proteins from plant hairy roots. Plant Cell Rep.,2003; 21: 1188-1193
  Google Scholar
• 12. Georgiev M.I., Agostini E., Ludwig-Müller J., Xu J.: Geneticallytransformed roots: from plant disease to biotechnological resource.Trends Biotechnol., 2012; 30: 528-537
  Google Scholar
• 13. Gils M., Kandzia R., Marillonnet S., Klimyuk V., Gleba Y.: High–yield production of authentic human growth hormone using a plantvirus-based expression system. Plant Biotechnol. J., 2005; 3: 613-620
  Google Scholar
• 14. Goel M.K., Mehrotra S., Kukreja A.K.: Elicitor-induced cellularand molecular events are responsible for productivity enhancementin hairy root cultures: an insight study. Appl. Biochem. Biotechnol.,2011; 165: 1342-1355
  Google Scholar
• 15. Gołąb J., Jakóbisiak M., Zagożdżon R., Obłąkowski P.: Cytokiny.W: Immunologia, red.: M. Jakóbisiak, J. Gołąb, W. Lasek, PWN, Warszawa,2004, 198-224
  Google Scholar
• 16. González-Navajas J.M., Lee J., David M., Raz E.: Immunomodulatoryfunctions of type I interferons. Nat. Rev. Immunol., 2012;12: 125-135
  Google Scholar
• 17. Góra-Sochacka A., Redkiewicz P., Napiórkowska B., Sirko A.: Wykorzystaniesystemów roślinnych do produkcji rekombinowanychcytokin. Postępy Biochem., 2009; 55: 85-94
  Google Scholar
• 18. Haggman H.M., Aronen T.S.: Agrobacterium rhizogenes for rootingrecalcitrant woody plants. W: Molecular biology of woody plants.t.2, red.: S.M. Jain, S.C. Minocha. Springer Netherlands 2000, 47-78
  Google Scholar
• 19. Häkkinen S.T., Raven N., Henquet M., Laukkanen M.L., AnderleiT., Pitkänen J.P., Twyman R.M., Bosch D., Oksman-Caldentey K.M.,Schillberg S., Ritala A.: Molecular farming in tobacco hairy rootsby triggering the secretion of a pharmaceutical antibody. Biotechnol.Bioeng., 2014; 111: 336-346
  Google Scholar
• 20. Han C., Gong Z., Hao L., Yang J., Hu J., Dong B., Fan T., Tang W.,Teng G.: Mechanism of monoclonal antibody-coupled Staphylococcussuperantigen-A induced apoptosis in human bladder cancercells. Cell Biochem. Biophys., 2011; 61: 679-684
  Google Scholar
• 21. Hasanloo T., Rahnama H., Sepehrifar R., Shams M.R.: The influenceof yeast extract on the production of flavonolignans in hairyroot cultures of Silybum marianum L. Gaertn. 4th Kuala Lumpur InternationalConference on Biomedical Engineering. red.: N.A. Osman,F. Ibrahim, W.A. Abas, H.S. Rahman, H.N. Ting. Springer Berlin Heidelberg,Kuala Lumpur, Malaysia 2008, 358-361
  Google Scholar
• 22. Hasanloo T., Sepehrifar R., Rahnama H., Shams M.R.: Evaluationof the yeast-extract signaling pathway leading to silymarinbiosynthesis in milk thistle hairy root culture. World J. Microbiol.Biotechnol., 2009; 25: 1901-1909
  Google Scholar
• 23. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K.: Production of antibodies intransgenic plants. Nature, 1989; 342: 76-78
  Google Scholar
• 24. Hooykaas P.J.: Transformation mediated by Agrobacteriumtumefaciens. W: Advances in fungal biotechnology for industry,agriculture, and medicine, red.: J.S. Tkacz, L. Lange. Springer US2004, 41-65
  Google Scholar
• 25. Huang B., Lin H., Yan C., Qiu H., Qiu L., Yu R.: Optimal inductiveand cultural conditions of Polygonum multiflorum transgenichairy roots mediated with Agrobacterium rhizogenes R1601 and ananalysis of their anthraquinone constituents. Pharmacogn. Mag.,2014; 10: 77-82
  Google Scholar
• 26. Kai G., Yang S., Zhang Y., Luo X., Fu X., Zhang A., Xiao J.: Effectsof different elicitors on yield of tropane alkaloids in hairy roots ofAnisodus acutangulus. Mol. Biol. Rep., 2012; 39: 1721-1729
  Google Scholar
• 27. Kang S., Ajjappala H., Seo H.H., Sim J.S., Yoon S.H., Koo B.S., KimY.H., Lee S., Hahn B.S.: Expression of the human tissue-plasminogenactivator in hairy roots of oriental melon (Cucumis melo). Plant Mol.Biol. Report., 2011; 29: 919-926
  Google Scholar
• 28. Kaplan H.S., Olsson L.: Human-human hybridoma monoclonalantibodies in diagnosis and treatment of neoplastic disease. Biochem.Biol. Markers Neoplast. Transform., 1983; 57: 57-66
  Google Scholar
• 29. Khojasteh A., Mirjalili M.H., Hidalgo D., Corchete P., Palazon J.:New trends in biotechnological production of rosmarinic acid. Biotechnol.Lett., 2014; 36: 2393-2406
  Google Scholar
• 30. Kim J.A., Kim Y.S., Choi Y.E.: Triterpenoid production and phenotypicchanges in hairy roots of Codonopsis lanceolata and the plantsregenerated from them. Plant Biotechnol. Rep., 2011; 5: 255-263
  Google Scholar
• 31. Kim O.T., Bang K.H., Shin Y.S., Lee M.J., Jung S.J., Hyun D.Y., KimY.C., Seong N.S., Cha S.W., Hwang B.: Enhanced production of asiaticosidefrom hairy root cultures of Centella asiatica (L.) Urban elicitedby methyl jasmonate. Plant Cell Rep., 2007; 26: 1941-1949
  Google Scholar
• 32. Ko S., Liu J.R., Yamakawa T., Matsumoto Y.: Expression of theprotective antigen (SpaA) in transgenic hairy roots of tobacco. PlantMol. Biol. Report, 2006; 24: 251
  Google Scholar
• 33. Kochan E., Wasiela M., Sienkiewicz M.: The production of ginsenosidesin hairy root cultures of American ginseng, Panax quinquefoliumL. and their antimicrobial activity. In Vitro Cell. Dev. Biol.Plant, 2013; 49: 24-29
  Google Scholar
• 34. Kuzovkina I.N., Schneider B.: Genetically transformed root cultures- generation, properties and application in plant sciences. W:Progress in Botany, t. 67, red.: K. Esser, U. Luttge, W. Beyschlag, J.Murata. Springer Berlin Heidelberg 2006, 275-314
  Google Scholar
• 35. Lewko W.M., Oldham R.K.: Cytokines. W: Principles of CancerBiotherapy, red.: R.K. Oldham, R.O. Dillman. Springer Netherlands2009, 155-276
  Google Scholar
• 36. Liu C., Towler M.J., Medrano G., Cramer C.L., Weathers P.J.: Productionof mouse interleukin-12 is greater in tobacco hairy rootsgrown in a mist reactor than in an airlift reactor. Biotechnol. Bioeng.,2009; 102: 1074-1086
  Google Scholar
• 37. Luchakivskaya Y.S., Olevinskaya Z.M., Kishchenko E.M., SpivakN.Y., Kuchuk N. V.: Obtaining of hairy-root, callus and suspenisoncell cultures of carrot (Daucus carota L.) able to accumulate humaninterferon alpha-2b. Cytol. Genet., 2012; 46: 15-20
  Google Scholar
• 38. Łucka M., Kowalczyk T., Szemraj J., Sakowicz T.: Rośliny jakoalternatywne źródło białek terapeutycznych. Postępy Hig. Med.Dośw., 2015; 69: 362-373
  Google Scholar
• 39. Martin K.P., Sabovljevic A., Madassery J.: High-frequency transgenicplant regeneration and plumbagin production through methyljasmonate elicitation from hairy roots of Plumbago indica L. J. CropSci. Biotechnol., 2011; 14: 205-212
  Google Scholar
• 40. Matvieieva N.A., Kudryavets Y.I., Likhova A.A., Shakhovskij A.M.,Bezdenezhnykh N.A., Kvasko E.Y.: Antiviral activity of extracts oftransgenic chicory and lettuce plants with the human interferonα2b gene. Cytol. Genet., 2012; 46: 285-290
  Google Scholar
• 41. Ming Q., Su C., Zheng C., Jia M., Zhang Q., Zhang H., RahmanK., Han T., Qin L.: Elicitors from the endophytic fungus Trichodermaatroviride promote Salvia miltiorrhiza hairy root growth and tanshinonebiosynthesis. J. Exp. Bot., 2013; 64: 5687-5694
  Google Scholar
• 42. Oda K., Matsuda H., Murakami T., Katayama S., Ohgitani T., YoshikawaM.: Adjuvant and haemolytic activities of 47 saponins derivedfrom medicinal and food plants. Biol. Chem., 2000; 381: 67-74
  Google Scholar
• 43. Ono N.N., Tian L.: The multiplicity of hairy root cultures: prolificpossibilities., Plant Sci., 2011; 180: 439-446
  Google Scholar
• 44. Otten L., Burr T., Szegedi E.: Agrobacterium: a disease causingbacterium. W: Agrobacterium: from biology to biotechnology, red.:T. Tzfira, V. Citovsky, Springer New York 2008, 1-46
  Google Scholar
• 45. Pandey R., Krishnasamy V., Kumaravadivel N., Rajamani K.:Establishment of hairy root culture and production of secondarymetabolites in coleus (Coleus forskohlii). J. Med. Plants Res., 2014;8: 58-62
  Google Scholar
• 46. Papatheodoridis G., Buti M., Cornberg M., Janssen H., Mutimer D.,Pol S., Raimondo G.: EASL clinical practice guidelines: managementof chronic hepatitis B virus infection, J. Hepatol., 2012; 57: 167-185
  Google Scholar
• 47. Pistelli L., Giovannini A., Ruffoni B., Bertoli A., Pistelli L.: Hairyroot cultures for secondary metabolites production. Adv. Exp. Med.Biol., 2010; 698: 167-184
  Google Scholar
• 48. Pitta-Alvarez S.I., Spollansky T.C., Giulietti A.M.: The influenceof different biotic and abiotic elicitors on the production and profileof tropane alkaloids in hairy root cultures of Brugmansia candida.Enzyme Microb. Technol., 2000; 26: 252-258
  Google Scholar
• 49. Powroźnik B., Kubowicz P., Pękala E.: Monoclonal antibodies intargeted therapy. Postępy Hig. Med. Dośw., 2012; 66: 663-673
  Google Scholar
• 50. Rahnama H., Razi Z., Dadgar M.N., Hasanloo T.: Enhanced productionof flavonolignans in hairy root cultures of Silybum marianumby over-expression of chalcone synthase gene. J. Plant Biochem. Biotechnol.,2013; 22: 138-143
  Google Scholar
• 51. Rao A.V., Sung M.K.: Saponins as anticancerogens. J. Nutr., 1995; 125 (Suppl.): 717S-724S
  Google Scholar
• 52. Redkiewicz P, Więsyk A, Góra-Sochacka A, Sirko A.: Transgenictobacco plants as production platform for biologically active humaninterleukin 2 and its fusion with proteinase inhibitors. PlantBiotechnol. J., 2012; 10: 806-814
  Google Scholar
• 53. Ritala A., Dong L., Imseng N., Seppänen-Laakso T., Vasilev N., vander Krol S., Rischer H., Maaheimo H., Virkki A., Brändli J., SchillbergS., Eibl R., Bouwmeester H., Oksman-Caldentey K.M.: Evaluation oftobacco (Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1) hairy roots forthe production of geraniol, the first committed step in terpenoidindole alkaloid pathway. J. Biotechnol., 2014; 176: 20-28
  Google Scholar
• 54. Roig Celma C., Palazon J., Cusido R.M., Pinol M.T., Keil M.: Decreasedscopolamine yield in field-grown Duboisia plants regeneratedfrom hairy roots. Planta Med., 2001; 67: 249-253
  Google Scholar
• 55. Rukavtsova E.B., Abramikhina T.V., Shulga N.Y., Bykov V.A., Bur’yanovY.I.: Tissue specific expression of hepatitis B virus surfaceantigen in transgenic plant cells and tissue culture. Russ. J. PlantPhysiol., 2007; 54: 770-775
  Google Scholar
• 56. Ryad A., Lakhdar K., Majda K.S., Samia A., Mark A., Corinne A.D.,Eric G.: Optimization of the culture medium composition to improvethe production of hyoscyamine in elicited Datura stramonium L.hairy roots using the Response Surface Methodology (RSM). Int. J.Mol. Sci., 2010; 11: 4726-4740
  Google Scholar
• 57. Saleem T.S., Chetty C.M., Ramkanth S., Alagusundaram M., GnanaprakashK., Rajan V.S., Angalaparameswari S.: Solanum nigrum Linn.- a review. Pharmacogn. Rev., 2009; 3: 342-345
  Google Scholar
• 58. Schwab M.: Encyclopedia of Cancer. Springer-Verlag Berlin Heidelberg,2009
  Google Scholar
• 59. Schwab M.: Encyclopedia of Cancer. Springer-Verlag Berlin Heidelberg,2012
  Google Scholar
• 60. Sharp J.M., Doran P.M.: Effect of bacitracin on growth and monoclonalantibody production by tobacco hairy roots and cell suspensions.Biotechnol. Bioprocess Eng., 1999; 4: 253-258
  Google Scholar
• 61. Sharp J.M., Doran P.M.: Strategies for enhancing monoclonalantibody accumulation in plant cell and organ cultures. Biotechnol.Prog., 2001; 17: 979-992
  Google Scholar
• 62. Skarjinskaia M., Karl J., Araujo A., Ruby K., Rabindran S., StreatfieldS.J., Yusibov V.: Production of recombinant proteins in clonalroot cultures using episomal expression vectors. Biotechnol. Bioeng.,2008; 100: 814-819
  Google Scholar
• 63. Solleti S.K., Bakshi S., Sahoo L.: Additional virulence genes inconjunction with efficient selection scheme, and compatible cultureregime enhance recovery of stable transgenic plants in cowpea viaAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation. J. Biotechnol.,2008; 135: 97-104
  Google Scholar
• 64. Srivastava S., Srivastava A.K.: Hairy root culture for mass-productionof high-value secondary metabolites. Crit. Rev. Biotechnol.,2007; 27: 29-43
  Google Scholar
• 65. Strumberg D., Schultheis B., Scheulen M.E., Hilger R.A., KraussJ., Marschner N., Lordick F., Bach F., Reuter D., Edler L., Mross K.:Phase II study of nimotuzumab, a humanized monoclonal anti-epidermalgrowth factor receptor (EGFR) antibody, in patients with locallyadvanced or metastatic pancreatic cancer. Invest. New Drugs,2012; 30: 1138-1143
  Google Scholar
• 66. Subroto M.A., Tampubolon E., Simanjuntak P.: Changes in solasodineaccumulation in regenerated plants of Solanum nigrum transformedwith Agrobacterium rhizogenes 15834. Biotechnology, 2007;6: 328-333
  Google Scholar
• 67. Sudha C.G., Sherina T.V., Anu Anand V.P., Reji J.V., Padmesh P.,Soniya E.V.: Agrobacterium rhizogenes mediated transformation ofthe medicinal plant Decalepis arayalpathra and production of 2-hydroxy-4-methoxy benzaldehyde. Plant Cell Tissue Organ Cult., 2013;112: 217-226
  Google Scholar
• 68. Sun J., Xiao J., Wang X., Yuan X., Zhao B.: Improved cardenolideproduction in Calotropis gigantea hairy roots using mechanical woundingand elicitation. Biotechnol. Lett., 2012; 34: 563-569
  Google Scholar
• 69. Sunil Kumar G.B., Ganapathi T.R., Srinivas L., Revathi C.J., BapatV.A.: Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots.Plant Sci., 2006; 170: 918-925
  Google Scholar
• 70. Sykłowska-Baranek K., Pietrosiuk A., Gawron A., Kawiak A., ŁojkowskaE., Jeziorek M., Chinou I.: Enhanced production of antitumournaphthoquinones in transgenic hairy root lines of Lithospermumcanescens. Plant Cell Tissue Organ Cult., 2012; 108: 213-219
  Google Scholar
• 71. Torkamani M.R., Jafari M., Abbaspour N., Heidary R., Safaie N.:Enhanced production of valerenic acid in hairy root culture of Valerianaofficinalis by elicitation, Open Life Sci., 2014; 9: 853-863
  Google Scholar
• 72. Tremblay R., Wang D., Jevnikar A.M., Ma S.: Tobacco, a highlyefficient green bioreactor for production of therapeutic proteins.Biotechnol. Adv., 2010; 28: 214-221
  Google Scholar
• 74. Wang C.T., Liu H., Gao X.S., Zhang H.X.: Overexpression of G10Hand ORCA3 in the hairy roots of Catharanthus roseus improves catharanthineproduction. Plant Cell Rep., 2010; 29: 887-894
  Google Scholar
• 75. Wang D.J., Brandsma M., Yin Z., Wang A., Jevnikar A.M., Ma S.:A novel platform for biologically active recombinant human interleukin- 13 production. Plant Biotechnol. J., 2008; 6: 504-515
  Google Scholar
• 76. Wang J.W., Zheng L.P., Zhang B., Zou T.: Stimulation of artemisininsynthesis by combined cerebroside and nitric oxide elicitation in Artemisia annua hairy roots. Appl. Microbiol. Biotechnol.,2009; 85: 285-292
  Google Scholar
• 77. Wasilewska A., Królicka A.: Otrzymywanie i charakterystykakultur korzeni włośnikowatych. Biotechnologia, 2005; 4: 173-188
  Google Scholar
• 78. Wilczańska-Barska A., Królicka A., Głód D., Majdan M., KawiakA., Krauze-Baranowska M.: Enhanced accumulation of secondarymetabolites in hairy root cultures of Scutellaria lateriflora followingelicitation. Biotechnol. Lett., 2012; 34: 1757-1763
  Google Scholar
• 79. Wirz H., Sauer-Budge A.F., Briggs J., Sharpe A., Shu S., Sharon A.:Automated production of plant-based vaccines and pharmaceuticals.J. Lab. Autom., 2012; 17: 449-457
  Google Scholar
• 80. Wongsamuth R., Doran P.M.: Production of monoclonal antibodiesby tobacco hairy roots. Biotechnol. Bioeng., 1997; 54: 401-415
  Google Scholar
• 81. Woods R.R., Geyer B.C., Mor T.S.: Hairy-root organ cultures forthe production of human acetylcholinesterase. BMC Biotechnol.,2008; 8: 95
  Google Scholar
• 82. Xu J., Dolan M.C., Medrano G., Cramer C.L., Weathers P.J.: Greenfactory: plants as bioproduction platforms for recombinant proteins.Biotechnol. Adv., 2012; 30: 1171-1184
  Google Scholar
• 83. Ya-ut P., Chareonsap P., Sukrong S.: Micropropagation and hairyroot culture of Ophiorrhiza alata Craib for camptothecin production.Biotechnol. Lett., 2011; 33: 2519-2526
  Google Scholar
• 84. Zhai D.D., Zhong J.J.: Simultaneous analysis of three bioactivecompounds in Artemisia annua hairy root cultures by reversed-phasehigh-performance liquid chromatography-diode array detector.Phytochem. Anal., 2010; 21: 524-530
  Google Scholar
• 85. Zhang H.C., Liu J.M., Lu H.Y., Gao S.L.: Enhanced flavonoid productionin hairy root cultures of Glycyrrhiza uralensis Fisch by combiningthe over-expression of chalcone isomerase gene with the elicitationtreatment. Plant Cell Rep., 2009; 28: 1205-1213
  Google Scholar
• 86. Zhou M.L., Zhu X.M., Shao J.R., Wu Y.M., Tang Y.X.: Transcriptionalresponse of the catharanthine biosynthesis pathway to methyljasmonate/nitric oxide elicitation in Catharanthus roseus hairy rootculture. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010; 88: 737-750
  Google Scholar
• 87. Ziemienowicz A.: Agrobacterium-mediated plant transformation:factors, applications and recent advances. Biocatal. Agric. Biotechnol.,2014; 3: 95-102
  Google Scholar

Pełna treść artykułu