Abstrakt

Orbitopatia tarczycowa (OT), jako swoista narządowa choroba autoimmunologiczna, jest skutkiem immunodysregulacji prowadzącej do utraty kontroli nad odpowiedzią zapalną skierowaną przeciwko własnym antygenom. Źródłem autoreaktywnych limfocytów są zaburzenia procesu tolerancji centralnej, a także ich indukcja na obwodzie przez zmodyfikowane bądź sekwestrowane antygeny. Aktywna supresja różnych subpopulacji limfocytów regulatorowych (Lreg) jest przeciwwagą dla czynników prozapalnych i ma za zadanie tłumić patologiczną reakcję. Tym samym, deficyty ilościowe bądź jakościowe Lreg pełnią fundamentalną rolę w rozwoju chorób z autoagresji. Ukierunkowanie terapii na Lreg i przywrócenie stanu dynamicznej równowagi wydaje się mieć podstawowe znaczenie, przede wszystkim w takich chorobach jak OT, gdzie kauzatywny autoantygen nie został jeszcze jednoznacznie zidentyfikowany.Trudności techniczne związane z izolacją oraz oceną funkcji Lreg w warunkach in vitro oraz brak unifikacji protokołów badawczych powodują, że wyniki badań są często nieporównywalne, niejednoznaczne, a nawet sprzeczne. Brak swoistego dla Treg (limfocytów T regulatorowych) zestawu markerów powierzchniowych czyni analizę metylacji regionu TSDR (Treg specific demethylated region) FOXP3 (forkhead box P3) locus najbardziej wiarygodną metodą oceny ich ilości. Mimo licznych rozbieżności między wynikami badań, większość wskazuje na istotną rolę Lreg w leżącej u podstawy OT i autoimmunologicznych chorób tarczycy (AITD) immunodysregulacji.

Orbitopatia tarczycowa – definicja, patogeneza

Orbitopatia tarczycowa jest autoimmunologicznym procesem zapalnym tkanek miękkich oczodołu o samo‑ ograniczającym się przebiegu. Najczęściej występuje jako pozatarczycowy objaw choroby Gravesa i Base‑ dowa (GD) [52]. Prawie w 10% jest związana z chorobą Hashimoto (HT), znacznie rzadziej towarzyszy innym autoimmunologicznym zapaleniom tarczycy, a spora‑ dycznie także rakowi tarczycy. Bezpośrednią przyczyną objawów i dolegliwości w fazie aktywnej zapalenia są zmiany naciekowo‑obrzękowe, nagromadzenie gli‑ kozaminoglikanów, proliferacja fibrocytów i ich róż‑ nicowanie w kierunku adipocytów lub miocytów. Wobec szczególnego umiejscowienia procesu, w prze‑ strzeni oczodołu ograniczonej kostnymi ścianami, wzrost objętości tkanek miękkich powoduje wzrost ciśnienia wewnątrzoczodołowego, zastój żylny i lim‑ fatyczny, obrzęk, zaburzenia ruchomości gałki ocznej i wytrzeszcz, a w skrajnych przypadkach prowadzi do zagrażającej utratą wzroku neuropatii nerwu wzroko‑ wego i keratopatii [58].

Patogeneza OT nie jest jeszcze wyjaśniona, uważa się, że u podłoża zapalenia leży autoimmunologiczna, krzyżowa reakcja między antygenami tarczycy i tkanek okołogał‑ kowych. Większość obserwacji oraz model zwierzęcy OT wskazuje na receptor TSH (TSHR) jako główny autoan‑ tygen zapoczątkowujący reakcję zapalną [33,36,52]. Jed‑ nocześnie podkreśla się rolę innych antygenów tkanki łącznej, w tym IGF1‑R (insulin‑like growth factor‑I recep‑ tor) [52,56,58]. Nadal pozostaje do wyjaśnienia występo‑ wanie orbitopatii u osób bez wykrywalnych przeciwciał anty‑TSHR i AITD. Według hipotezy opierającej się na roli TSHR, źródłem toczącego się zapalenia jest tkanka łączna, a w niej fibrocyty – niejednorodna morfologicz‑ nie, pochodząca ze szpiku grupa komórek progenitoro‑ wych o cechach immunomodulujących, która wykazuje wysoką, porównywalną z komórkami tarczycy, ekspre‑ sję TSHR oraz innych białek wspólnych z tyreocytami.

Do oczodołów migrują tylko u osób z orbitopatią i dają początek szczególnemu typowi fibroblastów – o wyróż‑ niającej je ekspresji powierzchniowych receptorów i cząsteczek kostymulująych oraz cechujących się nad‑ reaktywnością na bodźce prozapalne. Jako niejedno‑ rodna morfologicznie i funkcjonalnie grupa wykazują zróżnicowanie na linię Thy(+), mogącej pod wpływem odpowiednich bodźców ulegać zróżnicowaniu do mio‑ fibroblastów oraz Thy(‑), z potencjałem różnicowania się do adipocytów [58]. Pobudzenie TSHR na wykazu‑ jących nadmierną reaktywność zapalną fibrocytach i fibroblastach, przy niezbędnym współudziale stymu‑ lacji IGF1‑R powoduje uwolnienie cytokin prozapalnych i inicjację zapalenia [52]. Nadmierne wytwarzanie sil‑ nie hydrofilnych glikozaminoglikanów oraz intensywna adipogeneza odpowiadają za nawet kilkukrotny wzrost objętości tkanek oczodołu. Rozwój zapalenia doprowa‑ dza do migracji i infiltracji limfocytarnych o podobnym charakterze jak w lokalizacji tarczycowej. Większość doniesień dotyczących charakterystyki nacieków limfo‑ cytarnych w OT wskazuje na dominację limfocytów CD4+ i makrofagów, przy braku lub niewielkim współudziale komórek CD8+ i nieobecności komórek CD20. Badaniu jednak poddawano pacjentów po przebytej steroidotera‑ pii i/lub radioterapii [13,16,45,62]. Avunduk i wsp. nato‑ miast, na podstawie analizy nacieków limfocytarnych pochodzących od czterech osób niepoddawanych wcze‑ śniej terapii glukokortykosteroidami ani też radiotera‑ pii, wykazali istotną rolę w rozwoju zapalenia zarówno limfocytów CD4 jak i CD8  [2]. Nie tylko leczenie, ale także czas trwania i etap choroby odgrywają istotną rolę. W początkowym stadium dominują komórki i cytokiny limfocytów Th1, a w miarę wyciszania procesu – zdro‑ wienia dochodzi do przesunięcia równowagi w stronę limfocytów Th2. Dotychczas nie potwierdzono oczeki‑ wanej obecności w naciekach komórek Th17, których ważna rola została dowiedziona w innych schorzeniach autoimmunologicznych. Donoszono natomiast o zwięk‑ szonej ich liczebności we krwi obwodowej pacjentów z OT [30] oraz tkance tarczycy i krwi obwodowej pacjen‑ tów z GD, HT [1,10,14,22,47,58].

Orbitopatia jako choroba autoimmunologiczna

Orbitopatia tarczycowa, jako swoista narządowo choroba autoimmunologiczna, jest wynikiem utraty tolerancji wobec własnych antygenów. Autoreaktywne limfocyty mogą być wynikiem niedoskonałości procesu tolerancji centralnej lub powstać na obwodzie wobec:

• antygenów sekwestrowanych i nieobecnych w płodo‑ wej grasicy i krążeniu,

• antygenów ulegających nieznacznej modyfikacji np. w wyniku mutacji, infekcji wirusowej, procesu nowotworowego,

• pojawienia się nagle nadmiernej, przełamującej tole‑ rancję ilości antygenu w krążeniu lub

• krzyżowej reakcji z antygenami bakteryjnymi czy wirusowymi.

W prawidłowych warunkach przed rozwojem chorób z autoagresji chronią złożone mechanizmy tolerancji obwodowej opierające się na: sekwestracji, delecji, aner‑ gii klonalnej oraz na aktywnej supresji – niezaburzonym działaniu swoistych antygenowo i nieswoistych limfocy‑ tów regulatorowych. Podobne procesy selekcji dotyczą również limfocytów B. Do ich proliferacji i różnicowa‑ nia w dojrzałe komórki wytwarzające immunoglobuliny konieczne jest współdziałanie limfocytów T. W przy‑ padku braku autoreaktywnych pomocniczych limfo‑ cytów T (Thelp), autoreaktywne komórki B pozostają w uśpieniu [59]. Istotna rola limfocytów Treg w cho‑ robach autoimmunologicznych została dobrze udoku‑ mentowana na modelach zwierzęcych oraz poparta doniesieniami o ich deficytach funkcjonalnych i ilościo‑ wych w wielu autoimmunologicznych chorobach u ludzi, zarówno narządowych, jak i układowych [20,29,53].

W warunkach fizjologicznych układ immunologiczny cechuje się zachowaniem dynamicznej równowagi mię‑ dzy procesami pro- i przeciwzapalnymi. Choroby auto‑ immunizacyjne natomiast charakteryzuje patologiczna i niekontrolowana odpowiedź zapalna. W związku z tym wydaje się, że fundamentalne znaczenie ma odtworze‑ nie homeostazy przez poprawę funkcji lub zwiększe‑ nie ilości Lreg w takim stopniu, aby były adekwatne do nasilenia procesu zapalnego i rozpatrywanie ich deficy‑ tów ilościowych w odniesieniu do liczebności komórek zapalnych, a nie wartości bezwzględnych.

Aktywowane Treg mogą hamować odpowiedź zapalną niezależnie od rodzaju autoantygenu. Biorąc pod uwagę wieloczynnikowe uwarunkowanie większości chorób autoimmunizacyjnych, poznanie i ukierunkowanie tera‑ pii na Treg wydaje się istotne, zwłaszcza w takich cho‑ robach jak OT, gdzie swoisty autoantygen nie został jednoznacznie zidentyfikowany [29].

Limfocyty regulatorowe

Limfocyty regulatorowe, nazywane niegdyś „limfocy‑ tami supresorowymi”, to niejednorodna pod wzglę‑ dem fenotypowym i funkcjonalnym grupa limfocytów różnych linii rozwojowych, których wspólną cechą jest zdolność do tłumienia odpowiedzi immunologicznej. Działając w sposób bezpośredni lub za pomocą wydzie‑ lanych cytokin i metabolitów blokują interakcję komó‑ rek efektorowych (Teff) z komórkami prezentującymi antygen (APC). Hamują różnicowanie i proliferację limfocytów naiwnych (niepoddanych dotychczas sty‑ mulacji zewnętrznymi antygenami), proliferację zróżni‑ cowanych limfocytów efektorowych oraz komórek NK, makrofagów, osteoklastów, APC, a także indukują w tych komórkach apoptozę lub niszczą je bezpośrednio. W pra‑ widłowych warunkach zapobiegają w ten sposób choro‑ bom autoimmunizacyjnym, alergiom oraz nadmiernemu uszkodzeniu tkanek przez procesy zapalne [25].

Opisano już wiele rodzajów limfocytów regulatorowych należących do populacji pomocniczych limfocytów CD4+, CD8+, B oraz komórek NK [8,9,20,26,66], jednak najliczniejszą i najlepiej poznaną grupą są grasicze pomocnicze limfocyty CD4+ Treg. Ich funkcję i stabilność determinuje przede wszystkim czynnik transkrypcyjny FOXP3 oraz status epigenetyczny locus FOXP3 – deme‑ tylacja regionu TSDR. Za typowe i mimo nieswoisto‑ ści powszechnie używane do ich izolacji (ze względu na trudności w wykorzystaniu wewnątrzkomórkowego FOXP3) markery powierzchniowe uchodzą: wysoka eks‑ presja lekkiego łańcucha receptora dla IL‑2 – IL‑2Rα (CD25), CTLA‑4 (cytotoxic T lymphocyte antygen‑4), ektonukleazy: CD39 i CD73, GITR (glucocorticoid‑indu‑ ced tumor necrosis receptor) oraz niska ekspresja IL‑7Rα (CD127), która wykazuje odwrotną korelację z ich funk‑ cją supresorową [21,43].

FOXP3 jest krytycznym dla rozwoju Treg białkiem, składającym się z kilku funkcjonalnych domen. Odpo‑ wiada za regulację transkrypcji genów kształtują‑ cych fenotyp i funkcje Treg przez supresję czynników transkrypcyjnych związanych z ekspresją cytokin pro‑ zapalnych (NF‑κB, NFAT) czy indukcją prozapalnych komórek (RORγt), a aktywację podstawowych czynni‑ ków dla funkcji regulatorowych Treg, jak np. CTLA‑4, GITR [4,7,8,20,44].

Główną rolę FOXP3 dla funkcji limfocytów supreso‑ rowych potwierdza występowanie ciężkich chorób autoimmunologicznych oraz letalnego zespołu immu‑ nodysregulacji, poliendokrynopatii i enteropatii – IPEX (immunodysregulation, polyendocrinopathy, entero‑ pathy, X‑linked syndrome) w wyniku mutacji w obrę‑ bie domen FOXP3, a także możliwość nabycia przez komórki naiwne funkcji i fenotypu Treg po wprowa‑ dzeniu do nich mRNA FOXP3 [7]. Do niedawna uważano FOXP3 za główny marker umożliwiający identyfikację Treg. Okazało się jednak, że może również przejściowo ulegać ekspresji na pobudzonych komórkach efekto‑ rowych, a limfocyty regulatorowe mogą na jakiś czas utracić ekspresję FOXP3 przechodząc w stan latencji. Identyfikację prawdziwych Treg można przeprowa‑ dzić na podstawie oceny metylacji regionu TSDR locus FOXP3 będącej wyrazem modyfikacji epigenetycznej odpowiadającej za stabilność i funkcje Treg. Stabilne komórki Treg charakteryzuje całkowita demetylacja TSDR, natomiast częściowa bądź całkowita metyla‑ cja, zmniejszająca dostępność pewnych regionów DNA dla czynników transkrypcyjnych i innych wiążących się z DNA cząsteczek, występuje w komórkach efekto‑ rowych oraz niestabilnych indukowanych Treg. Cał‑ kowita demetylacja regionu TSDR pozostaje obecnie najbardziej swoistym z dotychczas znanych markerów stabilnych Treg, a analiza metylacji TSDR – najbardziej wiarygodną metodą identyfikacji stabilnych Treg we krwi obwodowej i tkankach miękkich, niezależną od oceny ekspresji FOXP3. Ponadto, stopień demetylacji koreluje z funkcją supresorową iTreg (indukowanych Treg) [21,35,37].

Inną, ważną dla funkcji Treg cząsteczką jest CTLA‑4, której blokada uchyla funkcję supresorową limfocytów, a jego niedobory wywołują śmiertelne choroby autoim‑ munizacyjne w modelach zwierzęcych [54].

Wśród limfocytów regulatorowych wszystkich linii roz‑ wojowych istnieje duża różnorodność ukierunkowa‑ nych na ten sam cel profilów działania – zahamowanie funkcji i/lub eliminacja komórek efektorowych i APC oraz zakłócenie ich współdziałania. Limfocyty T CD4+, CD8+ i limfocyty B można próbować podzielić w spo‑ sób analogiczny, m.in. ze względu na: profil wydziela‑ nych cytokin, ekspresję powierzchniowych receptorów, czynników transkrypcyjnych (w tym FOXP3), przeja‑ wianą aktywność (ekspresja Ki‑67) i status – aktywne komórki pamięci (CD45RA(‑), CD45RO(+))/komórki naiwne (CD45RA(+)) [9,20,49,66]. W związku z brakiem swoisto‑ ści, a także niestabilnością ekspresji poszczególnych markerów powierzchniowych, zależną od stanu aktywa‑ cji komórki i charakteru otaczającego mikrośrodowiska, nie jest możliwe określenie immunofenotypu poszcze‑ gólnych subpopulacji Treg [60].

Podstawowy i najbardziej zaznaczony podział głównych limfocytów regulatorowych – CD4+Treg opiera się na ich pochodzeniu. Wyróżnia się naturalne – grasicze Treg (nTreg) oraz obwodowe, indukowane iTreg, różnice mię‑ dzy nimi dotyczą głównie statusu epigenetycznego oraz ich stabilności [41].

Limfocyty nTreg (CD4+CD25+FOXP3+) powstają z tymo‑ cytów CD4+CD25+ w grasicy, przez selekcję negatywną w wyniku interakcji autoantygenów z kompleksem TCR/CD3 o dużym powinowactwie, prezentowanych w kontekście MHC klasy II (cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej klasy drugiej) na komórkach rdze‑ nia grasicy, przy współudziale odpowiednich cytokin – głównie IL‑2 lub IL‑15, a w bardzo małym stopniu także innych. W zależności od intensywności i czasu sty‑ mulacji TCR (T Cell Receptor) oraz obecnych cytokin, dochodzi do powstania różnych populacji limfocytów. Odpowiednio silna stymulacja TCR indukuje ekspresję FOXP3. Niezależnie, wystarczająco długi czas stymula‑ cji doprowadza do odpowiadającej za stabilność Treg, modyfikacji epigenetycznej – demetylacji regionu TSDR locus FOXP3. Tylko limfocyty FOXP3(+) z charaktery‑ stycznym epigenomem są aktywną i stabilną populacją Treg, niezależną od dalszej stymulacji TCR i prozapal‑ nego charakteru środowiska. Populacja FOXP3(‑) o zmo‑ dyfikowanym epigenomie stanowi pulę potencjalnych, nieaktywnych Treg, które w odpowiednich warunkach mogą nabyć ekspresję FOXP3 oraz pełnowartościową funkcję supresorową. Komórki wykazujące tylko ekspre‑ sję FOXP3, bez demetylacji TSDR, są niestabilne i w przy‑ padku braku TGF-β czy odpowiedniej stymulacji, łatwo tracą swój fenotyp [8,41,43,66] (ryc. 1).

Drugą główną linią rozwojową CD4+Treg są iTreg powstające w obwodowych narządach limfatycznych z naiwnych limfocytów CD4(+) pod wpływem stymulacji obcymi antygenami w niskich stężeniach, przy współ‑ udziale krytycznych dla indukcji FOXP3 cytokin: IL‑2 i TGF‑β. Obecność innych przeciwzapalnych cytokin wzmacnia działanie TGF‑β, natomiast obecność cząste‑ czek prozapalnych, zwłaszcza IL‑6, -1, -21 , przeciwdziała indukowanej przez TGF‑β ekspresji FOXP3, a w zamian promuje ekspresję czynnika transkrypcyjnego RORγt i rozwój limfocytów Th17. Indukcję FOXP3 przez TGF‑β wzmacniają także inne substancje, np. metabolity wita‑ miny A (ATRA, all trans retinoic acid) czy inhibitor szlaku mTOR– rapamycyna [21,66].

Brak demetylacji TSDR stabilizującej funkcję iTreg, powoduje, że ich dalsze losy i zachowanie fenotypu w znacznym stopniu zależą od środowiska w jakim się znajdują. Do czynników stabilizujących i promujących rozwój populacji Treg należą m.in.: TGF‑β i IL‑2, ‑15, -33, ATRA, metabolity witaminy D, adenozyna, a także zależne od obecności komensalowych bakterii jelito‑ wych: krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, polisa‑ charyd A Bacteroides fragilis, czy inne elementy bakterii probiotycznych [21]. Jednak odpowiednio długa stymu‑ lacja TCR niestabilnych iTreg, w odpowiednich warun‑ kach, prowadzi do stopniowej demetylacji TSDR [38].

Profil cytokin obecnych w środowisku, poprzez induk‑ cję ekspresji czynników transkrypcyjnych typowych dla poszczególnych linii limfocytów efektorowych, powo‑ duje wyspecjalizowanie się subpopulacji Treg ukie‑ runkowanych na supresję odpowiadających im Teff i wykazujących ekspresję receptorów chemokin umoż‑ liwiających migrację do konkretnego kompartmentu, w którym toczy się zapalenie [43].

Liczne doniesienia wskazują na możliwość zachowania większej lub mniejszej plastyczności w obrębie wszyst‑ kich subpopulacji CD4+. Poszczególne typy limfocytów efektorowych i regulatorowych, w określonych warun‑ kach, mogą ulegać wzajemnej konwersji, tracąc pier‑ wotne funkcje, nabierając nowe, a także doprowadzając do powstania komórek o pośrednich, wspólnych dla obu linii komórkowych cechach. Donoszono o przekształ‑ caniu się limfocytów regulatorowych w prozapalne komórki Th1 czy limfocyty Th17, o zachowanych bądź utraconych cechach przeciwzapalnych [18,26,41]. Pro‑ zapalne, wydzielające IFN‑γ Th1 mogą nabyć zdolność wytwarzania IL‑10, a tym samym, jako regulatorowe komórki Tr1 FOXP3(‑), potencjału ograniczenia procesu zapalnego, na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego. Bardzo niestabilną i heterogenną grupą komórek są lim‑ focyty Th17, których główną rolę potwierdzono w roz‑ woju wielu procesów autoimmunizacyjnych. Mogą się przekształcać w limfocyty Treg, Th1, Th2 oraz Tr1 – lim‑ focyty regulatorowe FOXP3(‑) [3,18,41]. Mimo to, że peł‑ nią przeciwstawne do Treg funkcje mają z nimi wspólną ścieżkę rozwojową. W wyniku stymulacji naiwnych lim‑ focytów CD4 przez TGF‑β powstają komórki wykazu‑ jące ekspresję zarówno krytycznego dla rozwoju Treg czynnika transkrypcyjnego FOXP3, jak i decydującego o powstaniu prozapalnych Th17 – RORγt. W przypadku obecności prozapalnych interleukin: IL‑6, -21 docho‑ dzi do redukcji FOXP3, zwiększenia ekspresji RORγt i do powstania Th17. Brak prozapalnych cytokin umożliwia zahamowanie przez FOXP3 ekspresji RORγt i powstania Treg FOXP3+ [26,41].

Głównie ze względu na bardzo małą liczebność populacji CD8(+)Treg, stanowiących około 0,4% populacji limfocy‑ tów T krwi obwodowej zdrowych ludzi, geneza i funk‑ cja CD8 Treg są bardzo słabo poznane [9]. Nie jest pewne czy reprezentują jedynie indukowaną w odpowiednich warunkach grupę komórek supresorowych, czy – ana‑ logicznie do CD4 Treg – istnieją również grasicze natu‑ ralne CD8 Treg, a ich rozwój przebiega jednocześnie z CD4+Treg. Za drugą teorią przemawiają doniesienia o wyizolowaniu z ludzkiej grasicy komórek CD25+CD8+ oraz CD25+CD4+CD8+ o zbliżonym do Treg fenotypie i stabilnej funkcji supresorowej wobec Teff [31,39,48]. Podobnie, jak w populacji regulatorowych komórek CD4, w obrębie CD8 Treg można wyróżnić subpopulacje róż‑ niące się profilem działania i fenotypem [40]. Prozapalne i przeciwzapalne komórki pozostają w warunkach prawidłowych w dynamicznej równowa‑ dze zapewniając zachowanie autotolerancji oraz ochronę przed destrukcją tkanek przez nadmiernie rozwijający się proces zapalny. Jej zachwianie, czy to przez czynniki wewnątrzkomórkowe czy humoralne, może doprowa‑ dzić do rozwoju chorób z autoagresji. Ponadto, istotną rolę w procesie autoimmunizacji może pełnić nabranie funkcji prozapalnych przez swoiste dla autoantygenów Treg [26].

Pomimo różnic w genezie i profilu działania Treg, podstawowe mechanizmy supresji odpowiedzi immunologicznej są wspólne i opierają się na:

• modulacji funkcji i procesu dojrzewania komórek pre‑ zentujących antygen,

• eliminacji komórek efektorowych i prezentujących antygen,

• przerwaniu szlaków metabolicznych oraz

• wytwarzaniu cytokin przeciwzapalnych [20].

Treg ograniczają zdolność APC do inicjacji odpowie‑ dzi immunologicznej zmniejszając ekspresję obecnych na nich, łączących się z CD28 i niezbędnych w proce‑ sie prezentacji antygenu – koreceptorów CD80 i CD86. Działanie to wywierają pośrednio – przez redukcję ich mRNA spowodowaną oddziaływaniem CTLA‑4 oraz bez‑ pośrednio – fizyczne usunięcie z powierzchni komó‑ rek przez transendocytozę i degradację. Wytwarzane przez Treg granzymy A i B wnikające do komórek doce‑ lowych, dzięki wydzielanym przez nie perforynom, uruchamiają szlak kaspaz prowadzący do apoptozy. Zahamowanie proliferacji i aktywności limfocytów efektorowych jest również możliwe przez dostarczenie negatywnego sygnału do komórek – aktywację cAMP. Obecność na Treg ektonukleatydazy – CD39 oraz CD73 umożliwia rozkład ATP do adenozyny wykazują‑ cej liczne przeciwzapalne cechy: tłumienie aktywacji i proliferacji komórek T efektorowych oraz promowa‑ nie powstawania Treg. Para- i autokrynne działanie Treg jest możliwe dzięki wydzielanym przez nie inter‑ leukinom: IL‑10, TGF‑β, IL‑35 [8,20].

Regulatorowe limfocyty b

Dwoistość funkcji limfocytów B wyrażającą się możliwo‑ ścią pełnienia funkcji zarówno komórek prozapalnych jak i supresorowych, w tej samej chorobie zaobserwowano po raz pierwszy około 40 lat temu. Od tego czasu zebrano wiele doniesień o przypadkach zaostrzenia objawów cho‑ rób autoimmunologicznych i alergicznych na skutek utraty regulatorowych limfocytów B (Breg), a ich funkcje supreso‑ rowe scharakteryzowano na wielu zwierzęcych modelach zapalenia, autoimmunizacji i nowotworów [42]. Okazało się również, że ukierunkowanie terapii na redukcję limfo‑ cytów B (Rituximab) w chorobach autoimmunizacyjnych, w której pokładano wielkie nadzieje, nie zawsze wywołuje oczekiwany skutek terapeutyczny. W niektórych proce‑ sach autoimmunizacyjnych (np. Th1‑zależne: łuszczyca, colitis ulcerosa, neurologiczne choroby autoimmunolo‑ giczne) zastosowanie terapii Rituximabem nasila objawy choroby. Do zaostrzenia może prowadzić również wpro‑ wadzenie leczenia na niewłaściwym – zbyt późnym etapie choroby [61]. Mimo skutecznej redukcji limfocytów B w GD, skutek kliniczny jest bardzo niezadawalający – zdrowieje tylko około 40% pacjentów. Powyższe obserwacje wskazują na istotną rolę Breg w regulacji procesów zapalnych zależ‑ nych od limfocytów T [65].

Regulatorowe limfocyty B są heterogenną populacją, wśród której opisano wiele podtypów wykorzystują‑ cych odmienne mechanizmy działania. Wszystkie mają wspólne z innymi subpopulacjami limfocytów B markery powierzchniowe. Nie ustalono dotychczas swoistych dla Breg markerów powierzchniowych ani czynnika trans‑ krypcyjnego. Pod wpływem stymulacji w odpowiednim kontekście i czasie mogą być wytworzone ze wszystkich komórek B, co wskazuje na fundamentalną rolę mikro‑ środowiska dla indukcji Breg [63]. Odkrycie autoreaktyw‑ nego charakteru BCR (B Cell Receptor) regulatorowych limfocytów B sugeruje immunizację autoantygenami, jako jeden z etapów rozwoju Breg i tym samym ich rolę w utrzymaniu autotolerancji [23].

Lee i Noh wprowadzili systematyczne nazewnictwo regulatorowych limfocytów B analogicznie do subpo‑ pulacji limfocytów T. Najbardziej poznane, wykazujące funkcje supresorowe głównie za pośrednictwem IL‑10 limfocyty B10, nazwano Br1 (podobnie jak wydziela‑ jące IL‑10 regulatorowe limfocyty T–Tr1). Jako Br3 (ana‑ logicznie do Th3) określono odgrywające główną rolę w indukcji tolerancji w alergiach pokarmowych regula‑ torowe limfocyty wydzielające TGF‑β. CD19+C5+FOXP3+ komórki B oznaczono, jako Breg [42].

Podobnie jak Treg, Breg działają zarówno przez mechani‑ zmy bezpośrednie jak i pośrednie, takie jak: wydzielanie supresorowych cytokin (IL‑10, TGF‑β), immunoglobu‑ lin (IgG4, sialowane IgG), grazymów, czy bezpośredni kontakt międzykomórkowy – indukcja apoptozy za pomocą ligandów, takich jak FAsL, PD‑L1, PD‑L2 oraz synergistyczne z IL oddziaływanie cząsteczek kosty‑ mulujących (CD80, CD86). W wyniku oddziaływania: a) hamują proliferację, różnicowanie i wydzielanie proza‑ palnych cytokin przez komórki Th1, Th17 oraz indukują ich konwersję w limfocyty regulatorowe (odpowiednio Tr1 i FOXP3+ Treg), b) indukują apoptozę w komórkach efektorowych i autoreaktywnych, c) tłumią aktywa‑ cję prezentujących antygen komórek dendrytycznych i makrofagów, d) aktywują regulatorowe komórki NK. W następstwie dochodzi do przesunięcia równowagi Th1/Th2 na korzyść Th2, ekspansji Treg kosztem Teff, a także wytworzenia tolerancyjnych komórek prezentu‑ jących antygen. Wydaje się, że regulatorowe komórki B odgrywają główną rolę w plastyczności komórek T [63]. Działanie komórek supresorowych B i T jest ukierunko‑ wane na supresję procesu zapalnego, jednak ich funkcje w chorobach autoimmunizacyjnych są różne, zależne od umiejscowienia ich działania w czasie. Limfocyty B dzia‑ łają wcześniej, inicjują reakcje supresorowe, ułatwiają rekrutacje Treg, a następnie zanikają, gdy te rozwiną pełne działanie. Komórki T są głównie aktywne w póź‑ niejszej fazie przedłużającego się procesu autoimmuni‑ zacyjnego i progresji choroby [42].

Badania dotyczące określenia liczebności komórek B10 w różnych chorobach autoimmunizacyjnych wskazują na ich zwiększoną liczbę w porównaniu z osobami zdro‑ wymi, a także na większe, spontaniczne wytwarzanie IL‑10 przez komórki chorych z procesami autoimmu‑ nizacyjnymi (RZS, SLE, twardzina układowa), niepod‑ dawanych żadnemu leczeniu w porównaniu do grup kontrolnych. Wyniki badań dotyczące ewentualnego istnienia upośledzenia funkcjonalnego B10 pozostają na razie niejednoznaczne [23].

Kristensen i wsp. [27] oceniali zdolność limfocytów B osób z AITD (GD, HT) oraz zdrowych do różnicowania się w wytwarzające IL‑10 B10, po stymulacji powszech‑ nie stosowanymi, nieswoistymi odczynnikami (PMA/ ionomycyna, Cpg), a także naturalnym autoantygenem – tyreoglobuliną (TG). Próbowano określić również zdol‑ ność potraktowanych TG komórek B do indukcji wydzie‑ lających IL‑10 komórek CD4 i profil cytokinowy PBMCs (komórek jednojądrzastych krwi obwodowej) wszystkich grup w warunkach podstawowych oraz po stymulacji poliklonalnej i autoantygenem. Na podstawie wyników badania wyciągnięto wnioski, iż w AITD różnicowanie komórek B w B10 jest niezaburzone. Po poliklonalnej stymulacji nie stwierdzono istotnych różnic w ilości B10 między grupami. Ponadto, u pacjentów z GD indukowane TG B10 wypromowały powstanie komórek CD4+ wydzie‑ lających IL‑10. Stężenie przeciwzapalnej IL‑10 zarówno w warunkach podstawowych, jak i po stymulacji było znacznie wyższe w obu grupach chorych niż u osób zdrowych. Nie wyklucza to jednak defektu funkcjonal‑ nego regulatorowych komórek B związanego z innymi mechanizmami immunoregulacji, a także upośledzenia ich czynności lokalnie – w gruczole tarczowym. Warto zaznaczyć, że większość dobranych do badania pacjentów było jednocześnie poddawanych farmakoterapii (lewotyroksyna, tiamazol).

Do odmiennych wniosków doszli natomiast Zha i wsp. [65] przypisując, na podstawie wcześniejszych obserwacji, komórkom B10 fenotyp CD19+CD24hiCD27+, wykazali ich istotnie mniejszą liczebność u pacjen‑ tów ze świeżo rozpoznaną i niepoddawaną leczeniu GD w porównaniu do osób zdrowych oraz pacjentów z co najmniej 12‑miesięczną remisją choroby. Funkcja supre‑ sorowa, określana jako zdolność do hamowania prolife‑ racji komórek CD4+ oraz wytwarzania przez nie cytokin prozapalnych, pozostawała upośledzona zarówno u cho‑ rych jak i osób po przebytej GD.

Ocena ilości i funkcji limfocytów regulatorowych – problemy diagnostyczne

Badania dotyczące zaburzeń Treg w chorobach autoim‑ munizacyjnych u ludzi, w tym AITD i OT napotykają na wiele trudności, a ich wyniki bywają niespójne a nawet sprzeczne. Wynika to najprawdopodobniej z braku stan‑ daryzacji i unifikacji protokołów badawczych między różnymi ośrodkami, a także różnic w charakterystyce dobranej grupy badawczej, nieuwzględniania niektó‑ rych czynników (np. uprzednia steroido‑/radioterapia, aktywność choroby, oporność komórek efektorowych), a przede wszystkim trudności technicznych związanych z wyizolowaniem i oceną funkcji Treg.

W związku z tym, iż nie poznano dotychczas jednego, swoistego dla Treg markera powierzchniowego, a nie‑ które z typowo występujących na ich powierzchni czą‑ steczek są również obecne na aktywowanych komórkach efektorowych, selekcję Treg przeprowadza się na podsta‑ wie ustalonej konfiguracji kilku z nich oraz braku/niskiej ekspresji innych. Niestety nie ma ujednoliconego wzoru markerów, który charakteryzowałby homogeniczną grupę Treg. Ośrodki badawcze stosują różne protokoły w zależ‑ ności od własnego doświadczenia. W związku z tym ocenie poddawane są różne populacje limfocytów regula‑ torowych, a także próbki o różnym stopniu kontaminacji limfocytami efektorowymi z przejściową ekspresją mar‑ kerów typowych dla Treg. W związku z tym wyniki są nie‑ porównywalne i na ich podstawie nie można wnioskować o ilości i funkcji całej populacji Treg. Niespójność donie‑ sień pochodzących z badań charakteryzujących Treg według różnych kryteriów mogą również odzwierciedlać zaburzenie tylko konkretnych podgrup Treg, przy prawi‑ dłowej funkcji innych [20]. W ostatnim czasie podkreśla się rolę analizy metylacji TSDR, jako jedynej wiarygodnej metody oznaczania ilości Treg [35,37].

Najczęściej ocenę funkcji Treg opiera się o ich zdol‑ ność do hamowania proliferacji komórek efektorowych w warunkach in vitro. Do najważniejszych ograniczeń tej metody należą trudności w odtworzeniu cech zapalenia oraz nieuwzględnienie możliwości występowania opor‑ ności komórek efektorowych na działanie Treg. Środowi‑ sko, w jakim się znajdują komórki regulatorowe, bardzo istotnie wpływa na ich funkcję, a działanie interleukin jest niezmiernie złożone – zależne od kombinacji i pro‑ porcji, w jakich występują [21]. Sytuacja byłaby jeszcze bardziej skomplikowana gdyby uwzględnić doniesienia o szeroko zachowanej plastyczności linii komórkowych, która w szczególnych warunkach umożliwiałaby wza‑ jemną konwersję komórek supresorowych i efektoro‑ wych [20].

Badania dotyczące Treg, wykonywane na komórkach pobranych z krwi obwodowej, nie uwzględniają możli‑ wości wystąpienia ich defektu tylko regionalnie – w okolicy zajętego zapaleniem narządu [20].

Aktywność Treg zależy od stopnia pobudzenia komórek efektorowych. Glick i wsp. [18] badając rolę Treg w auto‑ immunologicznych zapaleniach tarczycy zauważyli, że wynik oceny ich funkcji supresorowej zależy od użytych stymulantów. Jeśli jako kostymulant, oprócz przeciw‑ ciał anty‑CD3 i anty‑CD28, użyte były auto‑PBMCs (auto‑ logiczne PBMCs), obserwowano upośledzenie funkcji supresorowej Treg osób z GD i HT, w porównaniu do osób zdrowych. Natomiast, jeśli zamiast auto‑PBMCs użyto allo‑PBMCs (allogeniczne PBMCs) lub allo‑PBMCs, jako jedynego stymulanta, nie stwierdzono różnic między badanymi grupami. Otrzymany wynik skłonił do zwery‑ fikowania spostrzeżeń w chorobie, w której upośledze‑ nie funkcji Treg jest powszechnie uznawane – cukrzycy typu 1. Wyniki były podobne – w przypadku użycia jako stymulanta allo‑PBMCs, w grupie zdrowych i chorych na cukrzycę typu 1 nie stwierdzano różnic w supresji proli‑ feracji zależnej od Treg. Tylko nieliczne badania uwzględniają możliwość zafał‑ szowania wyniku przez występowanie oporności Teff i hodują Treg badanych również z Teff ludzi zdro‑ wych [20].

Inny, bardzo ważny aspekt badań nad Treg dotyczy doboru grupy badawczej, gdyż poziom Treg zależy od stopnia zaawansowania choroby, a także przebytego leczenia. Wykazano, iż pacjenci podczas aktywnej/wczesnej fazy: tocznia układowego (SLE), stwardnienia rozsianego (SM), reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS), łuszczycy, nie‑ swoistego zapalenia jelit (IBD) wykazywali niższy poziom Treg niż ci z nieaktywną/przewlekłą fazą choroby. Odpo‑ wiedź kliniczna na zastosowanie przeciwciała anty‑TNF‑α (infliximab) w RZS i IBD oraz GKS w SM, a fotochemiotera‑ pii w łuszczycy koreluje ze wzrostem populacji Treg [20]. To samo dotyczy terapii tiamazolem w GD [25].

Mimo tylu nieścisłości i aspektów badań nad Treg dostarczają informacji, które wskazują na ważną rolę limfocytów regulatorowych w przełamaniu tolerancji w chorobach autoimmunizacyjnych [20].

Limfocyty regulatorowe a orbitopatia

Pawłowski i wsp. [46], badając tkankę łączną usuniętą podczas zabiegu dekompresji oczodołów u 27 pacjentów z OT o różnym stopniu nasilenia, wykazali zwiększoną ekspresję mRNA dla FOXP3 w stosunku do grupy kon‑ trolnej – osób zdrowych oraz dodatnią korelację mię‑ dzy poziomem mRNA FOXP3 a nasileniem/aktywnością zapalenia (ocenianą odpowiednio według skal: NOSPECS i CAS) oraz CD3 i CRP. Jednocześnie, tkanka oczodołowa pacjentów z ciężką orbitopatią (NOSPECS>/=5) i aktyw‑ nym zapaleniem (CAS>/=4) cechowała się niższym pozio‑ mem ekspresji, determinującego funkcję Treg – CTLA‑4, niż u osób z łagodną orbitopatią (NOSPECS<5) i prawie nieaktywnym zapaleniem (CAS<4), mimo że poziom ekspresji liganda dla CTLA‑4 – CD86 wykazywał dodat‑ nią korelację z obecnością i stopniem nasilenia zapale‑ nia. Poziom mRNA FOXP3 we krwi obwodowej nie różnił się natomiast między pacjentami z OT i grupą kontrolną [46]. Uwzględniając dodatnią korelację poziomu mRNA FOXP3 z nasileniem zapalenia przy jednoczesnym zmniejszeniu stężenia CTLA‑4 mRNA, badacze wysu‑ nęli wniosek o upośledzonej funkcji Treg w ciężkiej OT. W badaniu nie uwzględniono obecności mRNA FOXP3 pochodzącego od aktywowanych komórek efektorowych (opierając się o mRNA FOXP3 nie można wnioskować o ilości/aktywności Treg), natomiast ujemna korelacja mRNA CTLA‑4 z nasileniem zapalenia, szczególnie przy zachowanej dodatniej korelacji jego ligandu – CD86, sugeruje nieadekwatną i upośledzoną funkcję Treg.

Za istotną rolą Treg w rozwoju OT przemawiają pośred‑ nio wielokrotne doniesienia o rozwoju orbitopatii zapalnej przypominającej orbitopatię Gravesa u osób poddawanych terapii ipilimumabem – monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciwko CTLA‑4, stoso‑ wanym w terapii przerzutującego czerniaka i innych guzów litych. Wyindukowanej orbitopatii u pacjentów bez wcześniejszego wywiadu w kierunku chorób tar‑ czycy towarzyszyło pojawienie się przeciwciał anty‑TPO i anty‑TG, a w niektórych przypadkach dochodziło do rozwoju zapalenia tarczycy i zaburzenia jej funk‑ cji [5,6,15,28,32,34]. W opisanym przez Le Mina i wsp. [34] przypadku, remisję orbitopatii oraz zmniejszenie miana przeciwciał przeciwtarczycowych uzyskano po odsta‑ wieniu ipilimumabu i zastosowaniu wielotygodniowego leczenia metyloprednisolonem. Przeciwciała anty‑TSHR nie były oznaczone na początku choroby, jednak ich nie‑ znacznie podwyższone miano po zakończeniu lecze‑ nia i spadku stężenia anty‑TPO i anty‑TG sugeruje, iż w aktywnej fazie choroby mogły być istotnie podwyż‑ szone.

Terapia ipilimumabem opiera się na zahamowaniu supresorowej funkcji Treg, przez co promuje skiero‑ waną przeciwko komórkom nowotworowym odpowiedź zapalną. Zachwianie równowagi między komórkami zapalnymi i supresorowymi może jednak doprowadzić do indukcji różnorodnych zaburzeń autoimmunologicz‑ nych. Najczęściej jest to: niedoczynność przysadki (17%), zapalenie tarczycy (GD, HT, czy przejściowe – ciche, bez‑ bolesne zapalenie tarczycy), niedoczynność kory nad‑ nerczy, zapalenie spojówek [15,34]. Dlaczego u części pacjentów dochodzi do indukcji chorób autoimmunizacyjnych a u innych nie? Odpowiedzią na to pytanie, a zarazem doskonałą ilustracją oddającą wie‑ loczynnikowe uwarunkowanie procesów autoimmunolo‑ gicznych może być polimorfizm genu CTLA‑4. Sanderson i wsp. [50] w małym badaniu dotyczącym wywołanej podawaniem przeciwciał anty‑CTLA‑4 autoimmuniza‑ cji, przeprowadził analizę polimorfizmu CTLA‑4 stwier‑ dzając, że polimorfizm Jo33, związany z niższą ekspresją CTLA‑4 na limfocytach, koreluje z ryzykiem rozwoju cho‑ rób autoimmunizacyjnych w przebiegu leczenia prze‑ ciwciałami anty‑CTLA‑4. O istocie polimorfizmu genu CTLA‑4 dla rozwoju i przebiegu orbitopatii świadczą rów‑ nież doniesienia pochodzące z naszego ośrodka [11,17].

Do tej pory przeprowadzono wiele badań mających na celu ustalenie zależności poszczególnych polimorfizmów genu z podatnością na różne choroby autoimmunolo‑ giczne. Opublikowane w ostatnim czasie metaanalizy potwierdzają związek polimorfizmu CTLA‑4 zarówno z ryzykiem wystąpienia AITD [38,51], jak i OT [12,57].

Zaburzenia limfocytów regulatorowych wspólnym mianownikiem orbitopatii i zapalenia tarczycy?

Orbitopatia nie jest traktowana jako powikłanie choroby Gravesa i Basedowa, ale jako najczęstszy pozatarczycowy objaw tego samego procesu autoimmunologicznego [33]. Drugą najczęściej związaną z OT chorobą jest przewle‑ kłe zapalenie tarczycy typu Hashimoto. Choć łagodne i dyskretne zmiany oczne w jego przebiegu występują dość często, to ciężkie postacie zapalenia należą do rzad‑ kości [48,64]. Wiele wspólnych cech łączących GD i HT: możliwość konwersji jednej choroby w drugą, podobna predyspozycja do rozwoju innych chorób z autoagresji oraz częste rodzinne współwystępowanie obu chorób może sugerować istnienie łączącego je defektu immuno‑ regulacyjnego [19].

W związku z brakiem ujednolicenia protokołów badawczych, wyniki dotyczące zaburzeń ilości Treg w chorobach autoimmunologicznych tarczycy są niejednoznaczne [19,61]. Uwzględniając przedstawione wyżej trudności techniczne oraz znaczne wątpliwości co do wiarygodności oceny ich funkcji supresorowej in vitro, należy zachować dużą czujność podczas interpretacji wyników badań. Niemniej jednak, większość doniesień wskazuje na istnienie defektu Treg, jako jednego z podstawowych elementów utraty autotolerancji.

Glick i wsp. [19] wykazali w grupie pacjentów z AITD – GD oraz HT, którzy od minimum pół roku nie przyj‑ mowali glukokortykosteroidów, upośledzoną funkcję supresorową Treg pochodzących z krwi obwodowej, a także znacząco obniżone wytwarzanie IL‑10. Wyniki pozostawały bez związku z czasem trwania choroby.

Xue i wsp. [61] porównali nie tylko liczbę Treg u osób zdrowych i osób z AITD – HT, ale zbadali również dyna‑ mikę zmian ilości Treg we krwi obwodowej w poszcze‑ gólnych stadiach choroby względem prozapalnych Th17. Wykazano, że zarówno odsetek Treg, ilość mRNA FOXP3 i TGF‑β oraz stosunek Treg/TH17 były istotnie niższe, a odsetek Th17 i poziom RORγt mRNA, IL‑17 były zna‑ miennie wyższe u osób z HT. Ponadto stosunek Treg/ Th17 był istotnie związany ze stadium choroby, wykazu‑ jąc negatywną korelację z poziomem przeciwciał prze‑ ciwtarczycowych oraz TSH, co wskazuje na istotna rolę zaburzenia równowagi między supresorowymi Treg a prozapalnymi Th17 w progresji zapalenia i destruk‑ cji tarczycy. Podobne wnioski wyciągnęli Grywalska i wsp.  [24] porównując liczbę Treg i Th17, jako war‑ tość bezwzględną oraz odsetek, u chorych z GD i osób zdrowych. Pacjenci z GD cechowali się mniejszą liczbą Treg i większą Th17 niż osoby zdrowe. Po osiągnięciu remisji w przebiegu leczenia metamizolem, nie stwier‑ dzono już różnic między obiema grupami badanymi. W innym badaniu wykazano zwiększoną liczbę krążą‑ cych na obwodzie Th17 w GD oraz ich dodatnią korela‑ cję z poziomem przeciwciał anty‑TSHR [47]. Podobnie w modelu zwierzęcym GD stwierdzono zaburzoną pro‑ porcję Treg/Th17, wynikającą jednak z niższego stęże‑ nia Treg (poziom Th17 pozostał bez istotnych różnic w porównaniu do myszy bez zapalenia tarczycy) [67].

Ocena i porównanie liczby Treg i Th17 oraz wydziela‑ nych przez nie cytokin, a więc pośrednio ich funkcji, we krwi obwodowej osób z nieleczoną wcześniej OT aktywną i nieaktywną, pacjentów z chorobą GD bez orbitopatii oraz osób zdrowych, wykazała znacznie zwiększoną ilość Th17, ich czynnika transkrypcyjnego – RORγt oraz wydzielanych przez nie cytokin (IL‑17A, -23, -6)) u osób z orbitopatią oraz GD bez OT w porównaniu do osób zdrowych. Wartości korelowały z aktywnością OT. W zakresie odsetka Treg i ilości FOXP3 odnotowano mniejsze wartości niż u osób zdrowych oraz niewielkie, aczkolwiek wykazujące tendencję malejącą w stosunku do wzrostu aktywności OT, różnice. Skutkiem był istotny spadek stosunku Treg/Th17 i FOXP3/RORγt u osób z GD i OT w stosunku do zdrowych oraz pogłębianie się zaburzenia równowagi w miarę nasilenia się aktywno‑ ści zapalenia oczodołu. Ponadto, poziom wydzielanych przez Treg IL – TGF‑β i IL‑35 był znamiennie zmniej‑ szony u osób z GD i OT w porównaniu do grupy kontrolnej oraz ujemnie skorelowany z aktywnością zapalenia, co mogłoby sugerować zaburzenie funkcji Treg. Niespo‑ dziewaną obserwacją natomiast był znacznie wyższy poziom IL‑10 u chorych (GD i OT) niż u zdrowych [30].

Wnioski

Orbitopatia tarczycowa (OT) jako swoista narządowo choroba autoimmunologiczna jest wynikiem utraty kon‑ troli limfocytów regulatorowych nad skierowaną prze‑ ciwko własnym tkankom reakcją zapalną. Niedomoga Lreg wynikać może z upośledzenia ich funkcji, migracji bądź deficytów ilościowych. W związku z tym, że przy‑ czyną choroby jest zachwianie układu dynamicznej rów‑ nowagi, liczebność i funkcje Lreg należałoby rozpatrywać tylko w kontekście tego układu i komórek zapalnych. Interpretacji wyników badań należy dokonywać z dużą rozwagą, ponieważ zarówno izolacja Lreg, jak i ocena ich funkcji in vitro są bardzo trudne i w razie braku zasto‑ sowania odpowiedniego protokołu badawczego – mogą być obarczone dużym błędem. Brak ujednolicenia metod badawczych oraz nieobecność umożliwiającego identy‑ fikację Treg swoistego zestawu markerów, często unie‑ możliwia porównanie wyników badań pochodzących z różnych ośrodków. Jednak dotychczasowe obserwa‑ cje wskazują na występowanie zaburzeń funkcji i ilości Treg w tkankach oczodołu oraz krwi obwodowej osób z OT korelujące z aktywnością zapalenia, a także – choć o mniejszym nasileniu – we krwi obwodowej pacjentów z AITD bez OT.

Poznanie mechanizmów i przyczyn niedomogi populacji Lreg jako jednego z podstawowych elementów wieloczynnikowego podłoża OT, otworzyłoby nowe możliwości leczenia i zapobiegania nieodwracalnej utra‑ cie wzroku, co wydaje się szczególnie istotne z powodu nieznajomości inicjującego zapalenie antygenu i ograniczenia dotychczasowej terapii do immunosupresji systemowej.

Przypisy

• 1. Aniszewski J.P., Valyasevi R.W., Bahn R.S.: Relationship betweendisease duration and predominant orbital T cell subset in Graves’ophthalmopathy. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2000; 85: 776‑780
  Google Scholar
• 2. Avunduk A.M., Avunduk M.C., Pazarli H., Oguz V., Varnell E.D.,Kaufman H.E., Aksay F.: Immunohistochemical analysis of orbitalconnective tissue specimens of patients with active Graves ophthal‑mopathy. Curr. Eye Res., 2005; 30: 631‑638
  Google Scholar
• 3. Bedoya S.K., Lam B., Lau K., Larkin J.3rd: Th17 cells in immunityand autoimmunity. Clin. Dev. Immunol., 2013; 2013: 986789
  Google Scholar
• 4. Bettelli E., Dastrange M., Oukka M.: Foxp3 interacts with nuclearfactor of activated T cells and NF‑κB to repress cytokine gene ex‑pression and effector functions of T helper cells., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 2005; 102: 5138‑5143Piśmiennictwo
  Google Scholar
• 5. Borodic G.E., Hinkle D.: Ipilimumab‑induced orbital inflammationresembling Graves disease with subsequent development of systemichyperthyroidism from CTLA‑4 receptor suppression. Ophthal. Plast.Reconstr. Surg., 2014; 30: 83
  Google Scholar
• 6. Borodic G., Hinkle D.M., Cia Y.: Drug‑induced Graves disease fromCTLA‑4 receptor suppression. Ophthal. Plast. Reconstr. Surg., 2011;27: e87‑e88
  Google Scholar
• 7. Boryczka K., Kuna P., Pietruczuk M.: Rola czynnika transkrypcyj‑nego FOXP3 w rozwoju i funkcjonowaniu regulatorowych limfocytówT. J. Lab. Diagn., 2011; 47: 335‑340
  Google Scholar
• 8. Boryczka K., Kuna P., Pietruczuk M.: Limfocyty regulatorowe w to‑lerancji immunologicznej. J. Lab. Diagn., 2012; 48: 71‑76
  Google Scholar
• 9. Churlaud G., Pitoiset F., Jebbawi F., Lorenzon R., Bellier B., Rosen‑zwajg M., Klatzman D.: Human and mouse CD8+CD25+FOXP3+ regula‑tory T cells at steady state and during interleukin‑2 therapy. Front.Immunol., 2015; 6: 171
  Google Scholar
• 10. Cogni G., Chiovato L.: An overview of the pathogenesis of thy‑roid autoimmunity. Hormones, 2013; 12: 19‑29
  Google Scholar
• 11. Daroszewski J., Pawlak E., Karabon L., Frydecka I., Jonkisz A.,Slowik M., Bolanowski M.: Soluble CTLA‑4 receptor an immuno‑logical marker of Graves’ disease and severity of ophthalmopathyis associated with CTLA‑4 Jo31 and CT60 gene polymorphisms. Eur.J. Endocrinol., 2009; 161: 787‑793
  Google Scholar
• 12. Du P., Ma X., Wang C.: Associations of CTLA4 gene polymor‑phisms with Graves’ ophthalmopathy: a meta‑analysis. Int. J. Ge‑nomics, 2014; 2014: 537969
  Google Scholar
• 13. Eckstein A.K., Quadbeck B., Tews S., Mann K., Krüger C., MohrC.H., Steuhl K.P., Esser J., Gieseler R.K.: Thyroid associated ophthal‑mopathy: evidence for CD4+ γδ T cells; de novo differentiation ofRFD7+ macrophages, but not of RFD1+ dendritic cells; and loss ofγδ and αβ T cell receptor expression. Br. J. Ophthalmol., 2004; 88:803‑808
  Google Scholar
• 14. Figueroa‑Vega N., Alfonso‑Pérez M., Benedicto I., Sánchez‑Ma‑drid F., González‑Amaro R., Marazuela M.: Increased circulatingpro‑inflammatory cytokines and Th17 lymphocytes in Hashimoto’sthyroiditis. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2010; 95: 953‑962
  Google Scholar
• 15. Fischli S., Allelein S., Zander T., Henzen C.: Endocrinologic sideeffects of oncologic treatment with anti‑CTLA‑4‑antibodies. Dtsch.Med. Wochenschr., 2014; 139: 996‑1000
  Google Scholar
• 16. Förster G., Otto E., Hansen C., Ochs K., Kahaly G.: Analysis oforbital T cells in thyroid‑associated ophthalmopathy. Clin. Exp. Im‑munol., 1998;112: 427‑434
  Google Scholar
• 17. Frydecka I., Daroszewski J., Suwalska K., Zołedziowska M., Tu‑tak A., Słowik M., Potoczek S., Dobosz T.: CTLA‑4 (CD152) gene po‑lymorphism at position 49 in exon 1 in Graves’ disease in a Polishpopulation of the Lower Silesian region. Arch. Immunol. Ther. Exp.,2004; 52: 369‑374
  Google Scholar
• 18. Geginat J., Paroni M., Maglie S., Alfen J.S., Kastirr I., Gruarin P.,De Simone M., Pagani M., Abrignani S.: Plasticity of human CD4 Tcell subsets. Front Immunol., 2014; 5: 630
  Google Scholar
• 19. Glick A.B., Wodzinski A., Fu P., Levine A.D., Wald D.N.: Impair‑ment of regulatory T‑cell function in autoimmune thyroid disease.Thyroid, 2013; 23: 871‑878
  Google Scholar
• 20. Grant C.R., Liberal R., Mieli‑Vergani G., Vergani D., Longhi M.S.:Regulatory T‑cells in autoimmune diseases: challenges, controversiesand–yet‑unanswered questions. Autoimmun. Rev., 2015; 14: 105‑116
  Google Scholar
• 21. Hoeppli R.E., Wu D., Cook L., Levings M.K.: The environment ofregulatory T cell biology: cytokines, metabolites, and the microbio‑me. Front. Immunol., 2015; 6: 61
  Google Scholar
• 22. Kahaly G.J., Shimony O., Gellman Y.N., Lytton S.D., Eshkar‑Seb‑ban L., Rosenblum N., Rafaeli E.,Kassem S., Ilany J., Naor D.: Regu‑latory T‑cells in Graves’ orbitopathy: baseline findings and immu‑nomodulation by anti‑T lymphocyte globulin. J. Clin. Endocrinol.Metab., 2011; 96: 422‑429
  Google Scholar
• 23. Kalampokis I., Yoshizaki A., Tedder T.F.: IL‑10‑producing re‑gulatory B cells (B10 cells) in autoimmune disease. Arthritis Res.Ther., 2013; 15: S1
  Google Scholar
• 24. Klatka M., Grywalska E., Partyka M., Charytanowicz M., Kisz‑czak‑Bochynska E., Rolinski J.: Th17 and Treg cells in adolescentswith Graves’ disease. Impact of treatment with methimazole onthese cell subsets. Autoimmunity, 2014; 47: 201‑211
  Google Scholar
• 25. Klatka M., Kaszubowska L., Grywalska E., Wasiak M., SzewczykL., Foerster J., Cyman M., Rolinski J.: Treatment of Graves’ diseasewith methimazole in children alters the proliferation of Treg cellsand CD3+ T lymphocytes. Folia Histochem. Cytobiol., 2014; 52: 69‑77
  Google Scholar
• 26. Kleinewietfeld M., Hafler D.A.: The plasticity of human Tregand Th17 cells and its role in autoimmunity. Semin. Immunol., 2013;25: 305‑312
  Google Scholar
• 27. Kristensen B., Hegedüs L., Lundy S.K., Brimnes M.K., Smith T.J.,Nielsen C.H.: Characterization of regulatory B cells in Graves’ diseaseand Hashimoto’s thyroiditis. PLoS One, 2015; 10: e0127949
  Google Scholar
• 28. Lecouflet M., Verschoore M., Giard C., Gohier P., Le Corre Y.,Milea D., Martin L.: Orbital myositis associated with Ipilimumab.Ann. Dermatol. Venereol., 2013; 140: 448‑451
  Google Scholar
• 29. Lewkowicz P., Lewkowicz N., Tchórzewski H.: Limfocyty regula‑torowe CD4+CD25+ w patofizjologii i terapii chorób o podłożu immu‑nologicznym. Postępy Hig. Med. Dośw., 2005; 59: 371‑376
  Google Scholar
• 30. Lv M., Shen J., Li Z., Zhao D., Chen Z., Wan H., Hao B.: Role ofTreg/Th17 cells and related cytokines in Graves’ ophthalmopathy.South. Med. J., 2014; 34: 1809‑1813
  Google Scholar
• 31. Maggi E., Cosmi L., Liotta F., Romagnani P., Romagnani S., Annun‑ziato F.: Thymic regulatory T cells. Autoimmun. Rev., 2005; 4: 579‑586
  Google Scholar
• 32. McElnea E., NíMhéalóid A., Moran S., Kelly R., Fulcher T.: Thy‑roid‑like ophthalmopathy in a euthyroid patient receiving Ipilim‑umab. Orbit, 2014; 33: 424‑427
  Google Scholar
• 33. Melcescu E., Horton W.B., Kim D., Vijayakumar V., Corbett J.J.,Crowder K.W., Pitman K.T., Uwaifo G.I., Koch C.A.: Graves orbitopa‑thy: update on diagnosis and therapy. South. Med. J., 2014; 107: 34‑43
  Google Scholar
• 34. Min L., Vaidya A., Becker C.: Thyroid autoimmunity and oph‑thalmopathy related to melanoma biological therapy. Eur. J. Endo‑crinol., 2011; 164: 303‑307
  Google Scholar
• 35. Miyao T., Floess S., Setoguchi R., Luche H., Fehling H.J., Waldma‑nn H., Huehn J., Hori S.: Plasticity of Foxp3+ T cells reflects promiscu‑ous Foxp3 expression in conventional T cells but not reprogrammingof regulatory T cells. Immunity, 2012; 36: 262‑275
  Google Scholar
• 36. Moshkelgosha S., So P.W., Deasy N., Diaz‑Cano S., Banga J.P.:Cutting edge: Retrobulbar inflammation, adipogenesis, and acuteorbital congestion in a preclinical female mouse model of Graves’orbitopathy induced by thyrotropin receptor plasmid‑in vivo elec‑troporation. Endocrinology, 2013; 154: 3008‑3015
  Google Scholar
• 37. Ngalamika O., Liang G., Zhao M., Yu X., Yang Y., Yin H., Liu Y.,Yung S., Chan T.M., Lu Q.: Peripheral whole blood FOXP3 TSDR meth‑ylation: a potential marker in severity assessment of autoimmunediseases and chronic infections. Immunol. Invest., 2015; 44: 126‑136
  Google Scholar
• 38. Ni J., Qiu L.J., Zhang M., Wen P.F., Ye X.R, Liang Y., Pan H.F., YeD.Q.: CTLA‑4 CT60 (rs3087243) polymorphism and autoimmune thy‑roid diseases susceptibility: a comprehensive meta‑analysis. Endocr.Res., 2014; 39: 180‑188
  Google Scholar
• 39. Niederkorn J.Y.: Emerging concepts in CD8+ T regulatory cells.Curr. Opin. Immunol., 2008; 20: 327‑331
  Google Scholar
• 40. Niedzwiedzka‑Rystwej P., Tokarz‑Deptuła B., Deptuła W.: Cha‑rakterystyka subpopulacji limfocytów T. Postępy Hig. Med. Dośw.,2013; 67: 371‑379
  Google Scholar
• 41. Noack M., Miossec P.: Th17 and regulatory T cell balance inautoimmune and inflammatory disease. Autoimmun. Rev., 2014;13: 668‑677
  Google Scholar
• 42. Noh G., Lee J.H.: Regulatory B cells and allergic diseases. AllergyAsthma Immunol. Res., 2011; 3: 168‑177
  Google Scholar
• 43. Ohkura N., Kitagawa Y., Sakaguchi S.: Development and mainte‑nance of regulatory T cells. Immunity, 2013; 38: 414‑423
  Google Scholar
• 44. Ono M., Yaguchi H., Ohkura N., Kitabayashi I., Nagamura Y., No‑mura T., Miyachi Y., Tsukada T., Sakaguchi S.: Foxp3 controls regu‑latory T‑cell function by interacting with AML1/Runx1. Nature,2007; 446: 685‑689
  Google Scholar
• 45. Pawlowski P., Reszec J., Eckstein A., Johnson K., Grzybowski A.,Chyczewski L., Mysliwiec J.: Markers of inflammation and fibrosis inthe orbital fat/connective tissue of patients with Graves’ orbitopathy: clinical implications. Mediators Inflamm., 2014; 2014: 412158
  Google Scholar
• 46. Pawlowski P., Wawrusiewicz‑Kurylonek N., Eckstein A., ReszecJ., Luczynski W., Johnson K., Kretowski A., Bakunowicz‑Lazarczyk A.,Gorska M., Szamatowicz J., Chyczewski L., Mysliwiec J.: Disturbancesof modulating molecules (FOXP3, CTLA‑4/CD28/B7, and CD40/CD40L)mRNA expressions in the orbital tissue from patients with severeGraves’ ophthalmopathy. Mediators Inflamm., 2015; 2015: 340934
  Google Scholar
• 47. Peng D., Xu B., Wang Y., Guo H., Jiang Y.: A high frequency ofcirculating th22 and th17 cells in patients with new onset graves’disease. PLoS One, 2013; 8: e68446
  Google Scholar
• 48. Povoleri G.A., Scotta C., Nova‑Lamperti E.A., John S., LombardiG., Afzali B.: Thymic versus induced regulatory T cells – who regu‑lates the regulators? Front. Immunol., 2013; 4: 169
  Google Scholar
• 49. Raphael I., Nalawade S., Eagar T.N., Forsthuber T.G.: T cell sub‑sets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatorydiseases. Cytokine, 2015; 74: 5‑17
  Google Scholar
• 50. Sanderson K., Scotland R., Lee P., Liu D., Groshen S., Snively J.,Sian S., Nichol G., Davis T., Keler T., Yellin M., Weber J.: Autoimmu‑nity in a phase I trial of a fully human anti‑cytotoxic T‑lymphocyteantigen‑4 monoclonal antibody with multiple melanoma peptidesand montanide ISA 51 for patients with resected stages III and IVmelanoma. J. Clin. Oncol., 2005; 23: 741‑750
  Google Scholar
• 51. Si X., Zhang X., Tang W., Luo Y., Tang W.: Association between theCTLA‑4 +49A/G polymorphism and Graves’ disease: a meta‑analysis.Exp. Ther. Med., 2012; 4: 538‑544
  Google Scholar
• 52. Smith T.J.: TSH‑receptor‑expressing fibrocytes and thyroid‑as‑sociated ophthalmopathy. Nat. Rev. Endocrinol., 2015; 11: 171‑181
  Google Scholar
• 53. Szmyrka‑Kaczmarek M., Kosmaczewska A., Ciszak L., SzteblichA., Wiland P.: Zaburzenia równowagi między komórkami Th17 i Tregwe krwi obwodowej chorych na toczeń rumieniowaty układowy z ni‑ską aktywnością choroby. Postępy Hig. Med. Dośw., 2014; 68: 893‑898
  Google Scholar
• 54. Tai X., Van Laethem F., Pobezinsky L., Guinter T., Sharrow S.O.,Adams A., Granger L., Kruhlak M., Lindsten T., Thompson C.B., Fei‑genbaum L., Singer A.: Basis of CTLA‑4 function in regulatory andconventional CD4+ T cells. Blood, 2012; 119: 5155‑5163
  Google Scholar
• 55. Tjiang H., Lahooti H., McCorquodale T., Parmar K.R., Wall J.R.:Eye and eyelid abnormalities are common in patients with Hashi‑moto’s thyroiditis. Thyroid, 2010; 20: 287‑290
  Google Scholar
• 56. Wall J.R., Lahooti H.: Pathogenesis of thyroid eye disease –does autoimmunity against the TSH receptor explain all cases. En‑dokrynol. Pol., 2010; 61: 222‑227
  Google Scholar
• 57. Wang H., Zhu L.S., Cheng J.W., Cai J.P., Li Y., Ma X.Y., Wei R.L.:Meta‑analysis of association between the +49A/G polymorphism ofcytotoxic T‑lymphocyte antigen‑4 and thyroid associated ophthal‑mopathy. Curr. Eye Res., 2015; 40: 1195‑1203
  Google Scholar
• 58. Wang Y., Smith T.J.: Current concepts in the molecular patho‑genesis of thyroid‑associated ophthalmopathy. Invest. Ophthalmol.Vis. Sci., 2014; 55: 1735‑1748
  Google Scholar
• 59. Weetman A., De Groot L.J.: Autoimmunity of the thyroid gland.Thyroid Dis. Manag. http://www.thyroidmanager.org/chapter/au‑toimmunity‑to‑the‑thyroid‑gland/(17.05.2015)
  Google Scholar
• 60. Whiteside T.L., Schuler P., Schilling B.: Induced and naturalregulatory T cells in human cancer. Expert Opin. Biol. Ther., 2012;12: 1383‑1397
  Google Scholar
• 61. Xue H., Yu X., Ma L., Song S., Li Y., Zhang L., Yang T., Liu H.: Thepossible role of CD4+CD25highFoxp3+/CD4+IL‑17A+ cell imbalance inthe autoimmunity of patients with Hashimoto thyroiditis. Endo‑crine, 2015; 50: 665‑673
  Google Scholar
• 62. Yang D., Hiromatsu Y., Hoshino T., Inoue Y., Itoh K., Nonaka K.:Dominant infiltration of TH1‑type CD4+ T cells at the retrobulbarspace of patients with thyroid‑associated ophthalmopathy. Thy‑roid, 1999; 9: 305‑310
  Google Scholar
• 63. Yang M., Rui K., Wang S., Lu L.: Regulatory B cells in autoimmunediseases. Cell. Mol. Immunol., 2013; 10: 122‑132
  Google Scholar
• 64. Yoshihara A., Yoshimura Noh J., Nakachi A., Ohye H., Sato S.,Sekiya K., Kosuga Y., Suzuki M., Matsumoto M., Kuni Y., WatanabeN., Mukasa K., Inoue Y., Ito K., Ito K.: Severe thyroid‑associated or‑bitopathy in Hashimoto’s thyroiditis. Report of 2 cases. Endocr. J.,2011; 58: 343‑348
  Google Scholar
• 65. Zha B., Wang L., Liu X., Liu J., Chen Z., Xu J., Sheng L., Li Y., ChuY.: Decrease in proportion of CD19+CD24hiCD27+ B cells and impair‑ment of their suppressive function in Graves’ disease. PLoS One,2012; 7: e49835
  Google Scholar
• 66. Zhang H., Kong H., Zeng X., Guo L., Sun X., He S.: Subsets of regu‑latory T cells and their roles in allergy. J. Transl. Med., 2014; 12: 125
  Google Scholar
• 67. Zhou J., Bi M., Fan C., Song X., Yang R., Zhao S., Li L., Li. Y., TengW., Shan Z.: Regulatory T cells but not T helper 17 cells are modu‑lated in an animal model of Graves’ hyperthyroidism. Clin. Exp.Med., 2012; 12: 39‑46
  Google Scholar

Pełna treść artykułu