Abstrakt

Lizozym to białko występujące u zwierząt, roślin, bakterii i wirusów. Znaleźć je można m.in. w ziarnach neutrofilów, makrofagów, a także w surowicy, ślinie, mleku, miodzie i w białku jaja kurzego. Enzym działa hydrolitycznie na wiązania β-1,4-glikozydowe znajdujące się między kwasem N-acetylomuraminowym (MurNAc) a N-acetyloglukozaminą (GlcNAc) peptydoglikanu (PG) bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. W królestwie zwierząt zidentyfikowano trzy postacie muramidazy: typ c (kurzy), typ g (gęsi) oraz typ i (obecny u bezkręgowców). Lizozym typu c z białka jaja kurzego jest obecnie modelem do badań nad jego strukturą i funkcją. Aktywność bakteriobójczą muramidaza wykazuje głównie wobec bakterii Gram-dodatnich. Jej działanie cytolityczne na komórki bakterii Gram-ujemnych nie jest w pełni wyjaśnione. Bakterie wykształciły mechanizmy obronne pozwalające im na uniknięcie działania lizozymu. Polegają one m.in. na wytwarzaniu inhibitorów enzymu lub na modyfikacji PG. Lizozym należy do jednych z najlepiej zbadanych enzymów, a mimo to wciąż nie wszystkie aspekty charakteryzujące to białko zostały w pełni poznane. Niewyjaśnione kwestie dotyczące jego biologicznej funkcji to rola muramidazy w procesie bakteriobójczego działania surowicy wobec bakterii Gram-ujemnych. Do jej wyjaśnienia jest stosowana m.in. metoda polegająca na usunięciu lizozymu z surowicy przez adsorpcję na bentonicie (montmorylonit, MMT). Z wykorzystaniem technik dyfraktometrii rentgenowskiej wykazano, że MMT po kontakcie z surowicą ulega delaminacji. Na wyjaśnienie czekają także zagadnienia związane z fałdowaniem muramidazy oraz jego udziałem w powstawaniu amyloidoz.

Wprowadzenie

Szkocki bakteriolog, Aleksander Fleming (1881-1955) jest znany głównie z odkrycia penicyliny. Jednak w 1921 r., zaobserwował, że kropla śluzu z nosa, która przypadkowo spadła na płytkę z podłożem agarowym, spowodowała lizę rosnących na nim bakterii. To zdarzenie doprowadziło badacza do odkrycia bakteriolitycznego czynnika, któremu w 1922 r. nadał nazwę: lizozym [13,30,96].

Pierwsze badania nad lizozymem (LZ, muramidaza, N- -acetylomuramylohydrolaza) sięgają jednak jeszcze wcześniejszego okresu, bo aż 1909 roku, kiedy to Pavel Laschtschenko analizował bakteriobójczą aktywność białka jaja kurzego i stwierdził, że jest spowodowana działaniem enzymu [78]. Działanie lityczne białka jaja na komórki Bacillus subtilis ustalono pod mikroskopem, określono również wpływ białek obecnych w jajach kręgowców na inne komórki bakterii – Bacillus spp. i Proteus spp. Już Fleming uważał, że silna bakteriolityczna substancja zdolna do wywołania szybkiej lizy komórek gęstej zawiesiny niektórych bakterii, jest szeroko rozpowszechniona w naturze. Obecnie wiadomo, że występuje we łzach, śluzie nosa, ślinie, surowicy krwi, w wielu tkankach i wydzielinach pochodzenia zwierzęcego oraz w białku jaj. Ze wszystkich przebadanych materiałów to właśnie białko jaja kurzego stanowiło najbogatsze źródło lizozymu. A. Fleming wyizolował także Gram-dodatnie bakterie, które nazwał Micrococcus lysodeikticus („wskaźnik lizy”), będące jak się okazało, szczególnie wrażliwe na lityczne działanie lizozymu. Jego badania przyczyniły się do ustalenia terminu przyjętego obecnie dla bakteriolitycznej substancji, wniosły także wiele informacji o jej występowaniu w przyrodzie. Wynikiem badań prowadzonych przez Fleminga było również opisanie organizmu najlepiej nadającego się do badań nad lizozymem – M. lysodeikticus [78,96].

Jednak enzym ten okazał się w ówczesnych czasach bezużyteczny leczniczo, ponieważ nie znalazł zastosowania, jako bezpośrednia substancja bakteriobójcza przeciwko wielu poważnym chorobom nękającym człowieka. Dlatego nie był początkowo uważany za czynnik o podstawowym znaczeniu antybakteryjnym. Po upływie prawie 80 lat, białko to zaczęło służyć jako model do badań nie tylko w mikrobiologii i medycynie, ale także w enzymologii, krystalografii i biologii molekularnej. Jego rola w obronie przed bakteriami Gram-dodatnimi atakującymi zwierzęta została dobrze poznana, a zastosowanie jako środka konserwującego w żywności nadało mu dodatkową wartość użyteczną. Jednak należy wspomnieć, iż wiele aspektów dotyczących biologicznej funkcji lizozymu nadal nie jest w pełni poznanych [13].

Budowa lizozymu

Lizozym (LZ, muramidaza, N-acetylomuramylohydrolaza) należy do układu nieswoistej, humoralnej odpowiedzi immunologicznej [18,27,30,73]. EC 3.2.1.17 to numer EC (Enzyme Commission, Komisja Enzymatyczna) przypisany do LZ według zasad klasyfikacji enzymów opracowanej przez Komitet Nazewnictwa (Nomenclature Committee) Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, IUBMB) [25]. Muramidaza występuje u zwierząt, roślin oraz wirusów. Znaleźć ją można w ziarnach neutrofilów, makrofagów i monocytów, również w osoczu krwi, łzach, ślinie oraz wydzielinach śluzowo-surowiczych dróg oddechowych. Występuje również w mleku, miodzie i w białku jaja kurzego. We krwi zdrowego człowieka stężenie LZ zawiera się w przedziale 0,5-2,0 µg/ml, natomiast w ślinie 2,0-5,0 µg/ml [27,30].

Muramidaza jest białkiem występującym w postaci pojedynczego łańcucha peptydowego utworzonego ze 129 reszt aminokwasowych, którego masa cząsteczkowa wynosi 14,4 kDa. W swej budowie nie zawiera grupy prostetycznej. Cztery mostki disiarczkowe stabilizują strukturę natywną LZ. Kształt cząsteczki jest prawie elipsoidalny o wymiarach 4,5 × 3,0 × 3,0 nm. Wiele reszt argininy obecnych w łańcuchu polipeptydowym muramidazy, nadaje jej ogólny ładunek dodatni. Struktura trzeciorzędowa enzymu jest podzielona na dwie domeny przez głęboką szczelinę zawierającą miejsce aktywne, wiążące substrat. Jedna domena składa się głównie ze struktur β, druga natomiast zawiera helisy α. W reakcje enzymatyczne są zaangażowane dwie reszty aminokwasowe: kwasu glutaminowego (Glu35) oraz kwasu asparaginowego (Asp52). Są umiejscowione po przeciwnych stronach szczeliny wiążącej substrat. Proces rozszczepiania wiązania glikozydowego wymaga także udziału cząsteczki wody. Muramidaza ma spoistą budowę dzięki zgromadzeniu grup hydrofobowych w środku cząsteczki, a wyeksponowaniu grup polarnych na zewnątrz. Samo związanie substratu zachodzi za pomocą sił van der Waalsa i towarzyszy mu zmniejszenie szczeliny [2,13,22,49]. Należy dodać, że jęczmienna chitynaza, bakteryjna chitozanaza, LZ białka jaja gęsiego (goose egg white lysozyme, GEWL), LZ bakteriofaga T4 (T4L) i LZ białka jaja kurzego (hen egg white lysozyme, HEWL) – wszystkie hydrolizują podobne polisacharydy. Białka te nie wykazują istotnych podobieństw w składzie aminokwasowym, ale mają strukturalnie niezmienny rdzeń, składający się z dwóch helis i trzech nici beta-kartki, które formują wiążącą substrat i katalityczną szczelinę. Enzymy te reprezentują nadrodzinę hydrolaz, która prawdopodobnie powstała na skutek ewolucji dywergentnej. Na podstawie strukturalnych kryteriów Monzingo i wsp. podzielili tę nadrodzinę na rodzinę bakteryjną (chitozanaza i T4L) i eukariotyczną (chitynaza, GEWL). HEWL jest bardziej powiązany z rodziną eukariotyczną niż z rodziną bakteryjną [62]. Przedstawiciele obu wspomnianych rodzin mają w strukturze białka wspólny rdzeń, ale zawierają różne N- i C-terminalne domeny [62].

W królestwie zwierząt występują trzy główne postaci LZ: typ c opisany jako kurzy (chicken, conventional type), typ g opisany jako gęsi (goose-type) oraz typ i obecny u bezkręgowców (invertebrate type) [13,31]. Typ c LZ stwierdzono również u bezczaszkowców i stawonogów, typ g u osłonic i mięczaków. Natomiast typ i występuje u szkarłupni, mięczaków, pierścienic, nicieni, stawonogów oraz gąbek (ryc. 1). Modelem do badań nad strukturą i funkcją enzymatyczną jest muramidaza typu c z białka jaja kurzego. Ten rodzaj LZ jest wytwarzany przez większość kręgowców, w tym ssaki [13]. Marsich i wsp. opisali nowy gen bakterii Helicobacter pylori, którego ekspresja prowadzi do powstania autolitycznego enzymu zdolnego do degradacji ściany komórkowej Gram-dodatnich i Gram-ujemnych bakterii [56]. Badacze nadali mu nazwę lys. Zaobserwowano jego ekspresję u wielu niespokrewnionych szczepów klinicznych bakterii, co sugeruje, iż jest on konserwatywny u gatunku H. pylori. Porównanie nukleotydowej sekwencji lys i genu HP0339 H. pylori ATCC 26695 ujawniło niemal całkowitą ich identyczność z wyjątkiem obecności 24-nukleotydowej „wstawki” w sekwencji genu lys. Kodujące sekwencje lys i HP0339 wykazały natomiast wysoki stopień homologii z kodującą sekwencją genu LZ bakteriofaga T4.

Aby dane białko można było zaklasyfikować, jako nową postać muramidazy, musi spełniać następujące kryteria:

• niska masa molekularna,

• stabilność w kwaśnym pH,

• inaktywacja pod wpływem warunków zasadowych,

• powodować lizę komórek M. lysodeikticus [70,80].

LZ jest prawdopodobnie jednym z najlepiej zbadanych enzymów hydrolitycznych (tab. 1). Rentgenograficznie oznaczona struktura molekularna HEWL ogłoszona w 1965 r. [5] była pierwszą strukturą 3D określoną dla molekuły enzymu. Od tego czasu muramidaza służy, jako model do badań procesu fałdowania białek, katalizy enzymatycznej, krystalografii i ewolucji enzymów. Co więcej, ludzki LZ wzbudził ostatnio znaczne zainteresowanie, jako białko amyloidogenne [23].

Amyloidozy są grupą chorób, które łączy wspólna cecha: pozakomórkowe złogi patologicznych, nierozpuszczalnych białek włókienkowych, odkładających się w jednym bądź też wielu tkankach i narządach. Odkładające się białka tworzące włókienka amyloidu są wynikiem dziedziczonych autosomalnie dominująco amyloidoz rodzinnych. Najczęściej występującą postać amyloidozy wywołuje zmutowana transtyretyna (rodzinna amyloidoza transtyretynowa). Transtyretyna to białko transportujące tyroksynę oraz wiążące retinol. Jednak zmiany w strukturze apolipoproteiny A-I, gelsoliny, fibrynogenu Aα i co ważne – LZ, także są przyczyną amyloidozy. W przypadku mutacji dotyczącej muramidazy, zajmowane złogami białek włókienkowych pozostają nerki, wątroba i śledziona [37].

Badania struktury enzymu są wymagane do szczegółowego zrozumienia właściwości białka w skali molekularnej lub atomowej. Chemiczna synteza białka jest ważnym i przydatnym narzędziem, ponieważ umożliwia niemal absolutną kontrolę nad kowalencyjną strukturą molekuły enzymu. Próby chemicznej syntezy muramidazy o pełnej długości były podejmowane bezskutecznie już od 1970 r. [39,84]. Dopiero niedawne badania [23] pozwoliły na całkowitą chemiczną syntezę ludzkiego LZ. Syntetyczne białko o dużej czystości i zachowanej aktywności enzymatycznej uzyskano w znacznej ilości. Opracowana metoda umożliwi wytworzenie unikalnych chemicznych analogów muramidazy i jak się uważa znajdzie w przyszłości zastosowanie w wielu dziedzinach badań nad LZ.

Mechanizm działania lizozymu

Enzym działa litycznie w stosunku do ściany komórkowej bakterii. Jego aktywność powoduje rozszczepianie w peptydoglikanie (PG) wiązań β-1,4-glikozydowych znajdujących się między atomem C-1 kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc) a atomem C-4 N-acetyloglukozaminy (GlcNAc). LZ prowadzi więc do rozkładu mureiny na disacharydy GlcNAc-MurNAc [13,22,27,30]. Aktywność bakteriobójczą muramidaza wykazuje głównie w stosunku do bakterii Gram- -dodatnich, a jej cytolityczne działanie na komórki bakterii Gram-ujemnych nie zostało w pełni poznane [27,30,98]. Enzym hydrolizuje również wiązania glikozydowe obecne w chitynie [31]. Dodanie muramidazy do zawiesiny komórek bakterii Gram- -dodatnich powoduje szybkie jej przejaśnienie. Bakterie M. luteus (M. lysodeikticus) są poddawane lizie już przy stężeniu LZ wynoszącym 1 µg/ml. Spektrofotometryczny pomiar zmiany absorbancji zawiesiny bakterii M. lysodeikticus w badanym roztworze wykorzystuje się do oznaczania aktywności enzymatycznej LZ [73,85].

Muramidaza działa, według doniesień literaturowych, również wobec niektórych gatunków grzybów [54,55,90], a tak- że wpływa hamująco na aktywność wirusa HIV-1 (tab. 2) [46]. Enzym ma ponadto właściwości przeciwnowotworowe [81]. Ostatnie badania [38,45] wskazują natomiast, iż LZ występujący u komarów (Anopheles gambiae, Anopheles dirus) ułatwia u tych żywicieli rozwój pasożytniczych pierwotniaków z rodzaju Plasmodium, będących czynnikami etiologicznymi malarii. Lizozym typu c-1 występujący u A. gambiae wiąże się do oocyst Plasmodium. Wyciszenie genu LYSC-1 u tych komarów znacznie zmniejsza intensywność zarażenia i częstość występowania pasożytniczych pierwotniaków. Podobne wyniki uzyskano dla A. dirus, u którego wyciszenie genu AdLys c-1 spowodowało redukcję liczby oocyst Plasmodium.

Na lityczne działanie LZ wpływają: temperatura, pH i stężenie chlorku sodu (NaCl) w środowisku. Zwiększenie aktywności litycznej enzymu odnotowano przy temperaturze wzrastającej do 60°C. Wartość pH, przy której obserwuje się maksymalną lizę komórek M. lysodeikticus zawiera się między 6,0 a 7,0. Niewielka liza komórek bakterii obserwowana jest natomiast przy nieobecności NaCl w środowisku. Na podatność bakterii na aktywność muramidazy wpływają też warunki hodowli. Każdy czynnik działający na stabilność struktury powierzchni komórki (ściany komórkowej i błony protoplazmatycznej) lub każda substancja blokująca interakcję LZ z jego substratem (np. kwaśne polimery), zmienia wynik litycznej aktywności enzymu [78]. O tym, że muramidaza jest bardzo stabilna w kwaśnych roztworach świadczy to, iż ogrzewanie do temperatury 100°C w pH nieprzekraczającym 8,5 nie powoduje utraty aktywności enzymatycznej. Stopniowa inaktywacja LZ występuje natomiast powyżej pH 9,0. Stabilność termiczną w dużej mierze warunkują obecne w cząsteczce cztery mostki dwusiarczkowe. W roztworach o niewielkiej sile jonowej i pH w zakresie 5,0-9,0 możliwa jest dimeryzacja enzymu, powyżej 9,0 może nawet nastąpić oligomeryzacja [31].

Działanie muramidazy na komórki bakterii zależy od fazy wzrostu hodowli bakteryjnej. Wrażliwość komórek Lactobacillus fermenti na działanie LZ jest największa podczas wykładniczej fazy wzrostu tych bakterii. Komórki L. fermenti pochodzące ze stacjonarnej fazy wzrostu są oporne na działanie muramidazy. Ponadto komórki z wczesnej fazy stacjonarnej do optymalnej aktywności muramidazy wymagają wyższej temperatury, niż te będące w fazie wzrostu wykładniczego. Chemiczna modyfikacja PG, która występuje podczas przejścia bakterii Gram-dodatnich z fazy wzrostu wykładniczego do fazy stacjonarnej może wyjaśniać zwiększoną ich oporność na LZ. Modyfikacje mogą być różnego typu, np. obecność grup O-acetylowych w PG, brak grup N- -acetylowych w PG, przyłączenie kwasów tejchojowych do PG lub występowanie wolnych grup aminowych w części peptydowej PG [66].

LZ był długo uznawany za enzym, który ma małe znaczenie w odporności przeciwbakteryjnej, ponieważ tylko nieliczne organizmy wydawały się bezpośrednio wrażliwe na jego działanie. Okazało się jednak, że muramidaza, oprócz dobrze znanej aktywności wobec niektórych szczepów Bacillus i Micrococcus, działa także na większość Enterobacteriaceae. Na komórki Gram-ujemne LZ nie działa jednak bezpośrednio, ale są one na niego podatne, jeżeli będą zastosowane dodatkowe czynniki, np. EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), wysokie pH czy polimyksyna. Wpływ różnych czynników wspomagających działanie LZ, polega prawdopodobnie na dezorganizacji lipoprotein ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych, co w rezultacie umożliwia dostęp enzymu do substratu [67,68,76,77,91,93].

Działanie EDTA lub LZ powoduje lizę bakterii Vibrio succinogenes, ale tylko wtedy, jeśli komórki są zawieszone w środowisku hipotonicznym przy zasadowym pH. Działanie LZ na mrożone i rozmrażane bakterie nie powoduje dużej utraty makromolekuł z komórki. Traktowanie komórek muramidazą w neutralnym pH oraz w obecności EDTA, powoduje tworzenie się z nich form kulistych (protoplastów), które jednak nie tracą wiele swoich komponentów komórkowych. Możliwe, że zarówno rozmrażanie jak i zamrażanie oraz użycie EDTA przy neutralnym pH, ułatwiają działanie LZ na mukopeptyd bakteryjny [99]. Bakteriobójcza aktywność normalnej surowicy ludzkiej (NSL), przypuszczalnie wymaga współudziału LZ i układu dopełniacza (komplementu). Układ dopełniacza może więc działać tak jak EDTA, przygotowywać miejsce docelowe dla działania LZ przez dezintegrację błony zewnętrznej [91].

W latach 50. XX w. Warren i wsp. przeprowadzili badania mające na celu określenie wpływu temperatury i acetonu na działanie LZ wobec bakterii Pseudomonas aeruginosa [92]. Pomiar zmętnienia ogrzewanej zawiesiny komórek P. aeruginosa w buforze fosforanowym (pH 7,0) zawierającym LZ wykazał lizę bakterii, ale jej stopień był mniejszy w temperaturze 100°C w czasie 10 min od obserwowanej w temperaturze 60°C w czasie 1 godziny. Dodanie muramidazy do zawiesiny pałeczek P. aeruginosa uprzednio traktowanych acetonem jeszcze bardziej działało litycznie niż po zastosowaniu ogrzewania komórek bakterii. Natomiast dodanie LZ do ogrzanych i traktowanych acetonem pałeczek P. aeruginosa spowodowało znacznie większą ich lizę od obserwowanej bez dodania muramidazy. Warren i wsp. uznali więc, że komórki P. aeruginosa, które były uprzednio ogrzane lub traktowane acetonem ulegają lizie spowodowanej działaniem LZ [92]. Również wiele innych traktowanych wcześniej acetonem bakterii Gram-ujemnych (włączając w to niektóre patogenne gatunki), ulega lizie pod wpływem działania LZ. Możliwe, że ogrzewanie lub stosowanie acetonu jest niezbędne w procesie lizy, ponieważ sprawia, że substrat w ścianie komórkowej dla enzymu staje się bardziej dostępny. Prawdopodobnie aceton wpływa na zwiększenie wrażliwości komórek P. aeruginosa na działanie muramidazy przez jego oddziaływanie na lipidy błony zewnętrznej tych bakterii. Badacze zaobserwowali także, że LZ jest aktywny w szerokim zakresie pH – 5,0-9,0. Stwierdzili również, iż enzym wykazuje silniejsze działanie w 37 lub 50°C niż w 24°C, a żadnej lizy komórek nie odnotowuje się w 4°C. Te obserwacje są zgodne z podobnymi wykazanymi dla bakterii M. lysodeikticus [92].

Występowanie lizozymu u kręgowców

Ryby

Muramidaza u ryb, podobnie jak u innych kręgowców, odgrywa ważną rolę w mechanizmach obronnych gospodarza przed infekcjami. LZ u tych zwierząt występuje głównie w tkankach bogatych w leukocyty. Znaleźć go można na skórze, w skrzelach, w przewodzie pokarmowym, a więc w miejscach, gdzie ryzyko inwazji bakteryjnej jest duże. Muramidaza ryb w odróżnieniu od ssaczej ma istotną antybakteryjną aktywność nie tylko względem Gram-dodatnich bakterii, ale również wobec Gram-ujemnych, nawet w przypadku braku aktywności układu dopełniacza. LZ może również uczestniczyć w zapobieganiu pionowej (wertykalnej – z matki na potomstwo) transmisji niektórych patogenów ryb, choć jego działanie nie przyczynia się do zabicia komórek np. bakterii Renibacterium salmoninarum, które wywołują choroby nerek u tych krę- gowców [102].

Aktywność enzymatyczna LZ może się zmieniać w zależności od płci ryb, ich wieku, pory roku, temperatury wody, pH, występujących infekcji oraz stopnia nasilenia czynników stresowych [80]. Pstrąg tęczowy (Oncorhynchus mykiss) w warunkach stresu wywołanego dużym zanieczyszczeniem wody ma zmniejszone stężenie LZ w surowicy. Zwiększoną aktywność enzymu w surowicy obserwowano natomiast u karpia (Cyprinus carpio) zainfekowanego bakteriami Aeromonas punctata bądź narażonego na inwazję pierwotniakami Eimeria subepithelialis [102]. Stężenie LZ w surowicy u jednego z gatunków karpia jest wyższe w porach letnich i deszczowych, ale niższsze w sezonie zimowym, co wskazywać może na większą podatność tych ryb na zakażenia w okresie zimowym [80]. Niektóre gatunki ryb zawierają typ g muramidazy w miejscach narażonych na wpływy środowiska i/lub zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną, takich jak: skrzela, jelito czy wątroba [87].

Płazy

Lizozym u płazów został wykryty podczas badań [64] prowadzonych nad etiologią jednego z nowotworów u żab leopardowych (Rana pipiens). Zauważono, że organy dorosłych zdrowych osobników tych żab zawierają enzymy bakteriolityczne. Po przeprowadzeniu dodatkowych testów okazało się, że enzymy te stanowią osiem form LZ. Wszystkie te izoenzymy muramidazy wykryto w nerkach badanych zwierząt, natomiast wątroba oraz śledziona zawierała siedem form, skóra sześć, jajnik pięć, a surowica tylko dwie. Największe stężenie LZ stwierdzono w śledzionie, a następnie w nerkach, wątrobie, skórze i jajniku. Surowica zawierała bardzo niewielkie ilości enzymu. Pod względem największej aktywności muramidazy w określonym narządzie – jajnik zajmował najwyższą pozycję [70].

Gady

Na temat LZ u gadów zgromadzone dotychczas informacje są niewielkie. Wyizolowano i scharakteryzowano muramidazę z białka jaja, ale nie wiadomo czy jest obecna w innych tkankach. Niemniej jednak enzymy te są uważane za ważne czynniki uczestniczące w interakcji z bakteriami. Zasugerowano, że brak ich litycznej aktywności u gadów wobec komórek Aeromonas hydrophila może się przyczynić do zwiększonej ich zjadliwości w omawianej grupie kręgowców. Bez bezpośrednich dowodów doświadczalnych stwierdzenie to pozostaje jednak nadal tylko przypuszczeniem. Wśród innych badanych szczepów bakterii Gram-ujemnych, Vibrio cholerae był najbardziej podatny na działanie LZ gadów, a P. aeruginosa miał niewielką wrażliwość [13]. U gadów enzym wykryto u jaszczurek i kilku gatunków żółwi. LZ żółwia Trionyx gangeticus wykazuje podobne enzymatyczne właściwości, co LZ kurzy. Porównanie muramidaz pochodzących z takich gatunków gadów jak: żółwiak chiński (Pelodiscus sinensis), żółwiak sundajski (Amyda cartilagenea) oraz żółw zielony (Chelonia mydas) doprowadziło do stwierdzenia, że każda z nich miała różną lityczną aktywność przeciwko kilku szczepom zarówno Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych bakterii. Żaden z LZ nie był natomiast skuteczny wobec szczepów, które były patogenne dla gadów [105].

Ptaki

LZ u ptaków można znaleźć przede wszystkim w ich jajach. Niektóre białka jaj tych zwierząt zawierają tylko muramidazę typu g (np. u gęsi rasy embden), inne tylko LZ typu c (np. u kury), ale też zdarza się, że w ich skład mogą wchodzić oba typy enzymu (występujące np. u czarnego łabędzia) [13]. Porównując LZ kurzy i gęsi, enzym kurzy ma kilkakrotnie mniejszą aktywność od gęsiego w swym działaniu litycznym na ściany komórek bakterii [31].

Ssaki

Spośród ssaków, szczególną uwagę należy zwrócić na grupę przeżuwaczy, u których rodzina genów kodujących LZ prawdopodobnie występowała już 40-50 mln lat temu, a rozdział jej dla różnych gatunków nastąpił około 25 mln lat temu. Dlatego też LZ wydaje się jednym z najstarszych i niezmienionych białek w tej grupie zwierząt. Należy jednak zaznaczyć, że u przeżuwaczy występuje niewielkie stężenie tego enzymu w surowicy krwi. Natomiast u takich zwierząt jak banteng (Bos javanicus) i lama (Lama glama) nie wykryto muramidazy w surowicy [29]. Aktywność enzymatyczna LZ u bydła jest zbliżona do występującej u koni i jednocześnie jest o 50-100% większa niż u psa. Ilość i aktywność enzymu w surowicy u wszystkich przeżuwaczy jest zależna od pory roku, stanu fizjologicznego oraz wieku zwierząt. Duże stężenie muramidazy stwierdzono we łzach kóz [7,19].

Stężenie LZ w surowicy określone u żubra (Bison bonasus) zawierało się w zakresie 2,10-6,40 µg/ml ze średnią wartością w przedziale 3,91-4,02 µg/ml ustaloną dla różnych grup badanych zwierząt. Nigdy nie osiągnęło poziomu 10 µg/ml, który jest wymagany do skutecznego przeprowadzania procesu lizy. Sugeruje to, że niespecyficzna odporność żubra wobec patogennych bakterii oparta na zawartości muramidazy w surowicy musi być uznana za bardzo niską [29]. W odniesieniu do LZ występującego w surowicy świń, psa i bydła, LZ surowiczy koni ma dwa razy większą aktywność. Jego ilość (podobnie jak u bydła) jest zależna od sezonu, rasy i stanu fizjologicznego zwierząt. W komórkach polimorfonuklearnych psów, LZ występuje w podobnym stężeniu jak u świń [7,19].

Dimitrov i wsp. oznaczyli stężenie LZ w surowicy owiec w badaniach mających na celu określenie związku między wrażliwością zwierząt na stres a ilością muramidazy w surowicy [21]. Najwyższe stężenie enzymu występowało u owiec spokojnych (0,300 mg/ml), natomiast najniższe stwierdzono u zwierząt zaniepokojonych, zdenerwowanych (0,173 mg/ml). Wskazuje to, że muramidaza jest obecna u owiec w dużej ilości, ale na jej stężenie w surowicy mają wpływ różne czynniki, takie jak np. stres, które mogą znacznie obniżyć jej zawartość. Typ g LZ ma u ssaków mniejsze znaczenie niż typ c. Ekspresja genu postaci g LZ jest swoista tkankowo i różni się między zwierzętami. U człowieka wykazano ją w komórkach nerki osób dorosłych zainfekowanych uropatogennymi szczepami bakterii E. coli, u myszy w języku i skórze, a u kur w jelicie [87].

Funkcje lizozymu związanez mechanizmami nieenzymatycznymi

Początkowo LZ definiowano tylko przez jego zdolność do lizy komórek niektórych bakterii. Nieenzymatyczny sposób działania LZ, jaki zaobserwowano na wczesnych etapach badań nad tym białkiem, polegał na aglutynacji komórek bakteryjnych. Muramidaza, wspólnie z innymi podobnymi komponentami, może być przyciągana przez negatywnie naładowane grupy na powierzchni komórki bakterii, których neutralizacja powoduje aglutynację. Ponadto wiele substancji, w tym proste syntetyczne związki powierzchniowo czynne i naturalnie występują- ce kwasowe polimery bakteryjnego pochodzenia, mogą się łączyć z LZ [78].

Według niektórych autorów cząsteczki LZ w warunkach in vitro mogą się przedostawać przez błony biologiczne zbudowane ze związków fosfatydyloglicerolu, fosfatydyloseryny i fosfatydyloetanoloaminy [63,103]. Inni badacze twierdzą [24], że najbardziej prawdopodobny mechanizm bakteriobójczej aktywności muramidazy polega na zaburzaniu struktury błony zewnętrznej bakterii. Właściwość ta, wykazana dla HEWL oraz T4L, została potwierdzona w doświadczeniach na bakteriach, grzybach oraz protoplastach ziemniaków, przy czym nie stwierdzono jej w teście hemolitycznym z użyciem komórek ssaczych [24].

Muramidaza ma istotne właściwości przeciwzapalne [69]. Enzym hamuje chemotaksję aktywowanych leukocytów. Jest też zdolny do bezpośredniej modulacji kaskadowo przebiegających reakcji dopełniacza w czasie jego aktywacji. LZ, niektóre białka mleka oraz ligandy o niskiej masie molekularnej (np. cytryniany, fosforany), mają miejsca wiążące o dużym powinowactwie do wapnia i dlatego mogą być inhibitorami komplementu. Chelatują bowiem dwuwartościowe jony wymagane do aktywacji dopełniacza [69]. Jony wapnia są niezbędne do aktywacji drogi klasycznej komplementu [51].

Do innych właściwości LZ należy, przez uszkadzanie ścian komórkowych bakterii i fragmentowanie PG, inicjowanie powstawania przeciwciał, a także wiązanie się do DNA wirusów i tworzenie nierozpuszczalnych kompleksów, co przyczynia się do ich inaktywacji [48]. Niedawno LZ został zidentyfikowany, jako białkowy feromon termitów. Stwierdza się jego występowanie w jajach i gruczołach ślinowych tych owadów. Ta nowa funkcja muramidazy podkreśla duży wpływ patogennych drobnoustrojów na ewolucję zachowań społecznych u termitów [59].

Zastosowanie lizozymu w przemyślespożywczym

Muramidaza ma właściwości, które pozwalają na zastosowanie jej w celu konserwacji żywności. Stężenie LZ w białku jaja kurzego wynosi około 3,2 mg/ml, w mleku krowim prawie 0,13 µg/ml, a w ludzkiej siarze około 65 µg/ml. Kalafior zawiera około 27,6 µg/ml muramidazy, a kapusta około 2,3 µg/ml. Użycie więc takiego naturalnie obecnego w wielu produktach spożywczych LZ, w ilości zawierającej się w przedziale 10-100 µg/ml nie może stanowić zagrożenia toksykologicznego. Bakteriostatyczne i bakteriobójcze własności enzymu są dobrze zbadane, a w ciągu ostatnich lat pojawiają się nowe przykłady antybakteryjnych mechanizmów działania LZ, niezależnych od jego aktywności hydrolitycznej [58]. Komisja Ekspertów WHO/FAO ds. stosowania dodatków do żywności w 1992 r. uznała muramidazę za środek bezpieczny i zezwoliła na wykorzystanie jej przy produkcji i utrwalaniu żywności. Enzym jest stosowany w skali przemysłowej m.in. w Australii, Austrii, Belgii, Danii, Francji, Japonii, Niemczech i Włoszech [41]. LZ może być użyty, jako dodatek do przetworów, środek powlekający oraz jako składnik roztworów, którymi spryskuje się lub w których moczy się gotowe spożywcze wyroby [6].

W Japonii opatentowano procedury dotyczące utrwalania świeżych warzyw, owoców, ryb i mięsa przede wszystkim za pomocą pokrycia ich powierzchni LZ. Na przykład patent jednej z firm dotyczy sposobu przechowywania ostryg i krewetek w niskich temperaturach po uprzednim traktowaniu ich wodnym roztworem muramidazy i NaCl. Sposoby konserwacji z użyciem LZ zostały też opracowane dla takich typowych wschodnich potraw jak: sushi, sałatka japońska czy kluski chińskie [41]. W przemyśle serowarskim prowadzono dotąd najbardziej intensywne badania wiążące się ze stosowaniem LZ. Muramidazę używa się do produkcji serów dojrzewających w celu redukcji liczby bakterii kwasu masłowego, głównie Clostridium tyrobutyricum. Enzym przyczynia się także do poprawy cech sensorycznych sera, nie wpływając na proces produkcji i jego dojrzewanie [6,41,43,94]. LZ wykorzystano podczas produkcji sera edamskiego, gdzie wprowadzono go bezpośrednio do układu jeszcze przed dodaniem podpuszczki. Otrzymano pozytywny wynik mikrobiologiczny przy zastosowaniu LZ o aktywności 500 U/ml (co odpowiada dodatkowi białka jaja w ilości około 0,6%). Zarówno czysty enzym, jak i białko jaja kurzego wykazywały zbliżoną efektywność [41]. Muramidaza jest także wykorzystywana do kontrolowania obecności bakterii kwasu mlekowego w piwie, spełniając tę samą rolę przy produkcji wina [16,28]. Okazało się, że LZ jest także silnym inhibitorem bakterii hiochia (np. Lactobacillus heterohiochi, Lactobacillus homohiochi) w sake (20% alkoholu, pH 4,0-4,5), a po roku przechowywania w alkoholu w temperaturze pokojowej jego aktywność wynosi 85% wartości początkowej [41,101]

Dla przetworów mięsnych typu kiełbasy wołowe, salami oraz kiełbasy wiedeńskie, także wykorzystano różne procedury ich konserwacji z użyciem LZ (dodatek białka do wyrobów, środek powlekający przetwory oraz składnik roztworów, w których moczy się osłonki i gotowe produkty). Dla kiełbasy wołowej najlepszy efekt uzyskano, kiedy do mieszanki peklującej zawierającej chlorek i azotyn sodu dodano muramidazę [41]. Również inne wyniki badań wskazują, że dodatek enzymu do wyrobów mięsnych, korzystnie wpływa na zmniejszenie stopnia ich zanieczyszczenia poprodukcyjnego oraz istotnie przedłuża trwałość w czasie przechowywania w chłodniach [53].

LZ może w określonych warunkach odznaczać się większym zakresem właściwości, które poszerzają zakres jego antybakteryjnej aktywności. Wynikiem modyfikacji muramidazy, która powoduje zmianę monomeru enzymu w dimer i wyższe oligomery jest pojawienie się nowych właściwości LZ. Inkubując jaja w skorupach lub samo białko jaja w temperaturze 40°C można doprowadzić do oligomeryzacji enzymu [47,48]. LZ w nowej postaci traci pewną część swojej hydrolitycznej aktywności, jednak wykazuje silniejsze działanie antybakteryjne na bakterie Gram-dodatnie oraz zwiększa zakres aktywności na bakterie Gram-ujemne (w tym liczne bakterie chorobotwórcze). W wyniku dimeryzacji ujawnia się nowa aktywność enzymu, która wiąże się z odsłonięciem obszaru hydrofobowego w cząsteczce. Zwiększa to zdolność przenikania LZ przez membranę, co tłumaczy większą skuteczność działania względem bakterii Gram-ujemnych [35,47,48]. Prowadzone prace badawcze dotyczące sposobów modyfikacji LZ mają na celu otrzymanie zwiększonej aktywności enzymu [14,15,47,48]. Wyniki wskazują, że niezależnie od sposobu modyfikacji muramidazy, uzyskane po modyfikacji preparaty mają większą biologiczną aktywność przeciwdrobnoustrojową i szerszy zakres działania antybakteryjnego. Stwarza to możliwość na lepsze zastosowanie LZ w przemyśle spożywczym [48].

Znaczenielizozymu w medycynie

Muramidaza jest wykorzystywana w leczeniu zakażeń bakteryjnych, wirusowych i grzybiczych. Preparaty LZ w postaci sztyftów lub maści mogą być aplikowane na błony śluzowe jamy ustnej, gardła, do oczu czy na skórę. Lecznicze gumy do żucia z dodatkiem LZ są stosowane w schorzeniach jamy ustnej i przyzębia. Enzym wykorzystuje się także w leczeniu chorób nowotworowych ze względu na właściwości przeciwbólowe. Jest ponadto środkiem wspomagającym antybiotykoterapię oraz działanie antyseptyków, kortykosteroidów i enzymów proteolitycznych [31,72]. LZ w połączeniu z antybiotykami β-laktamowymi zachowuje silne bakteriobójcze działanie. Dlatego też terapia złożona z obu tych elementów, może skutecznie hamować bakteriemię i prowadzić do uniknięcia posocznicy [50].

Peptydy uzyskane z LZ, mimo braku aktywności enzymatycznej, działają bakteriostatycznie. Budzą zainteresowanie ze względu na małą masę cząsteczkową i brak odczynu alergicznego po zastosowaniu w preparatach leczniczych. Odczyn alergiczny może być obserwowany w odpowiedzi na zastosowanie muramidazy. Mine i wsp. opracowali peptydy, z których jeden hamował rozwój Gram-ujemnych bakterii Escherichia coli K-12, a drugi bakterii Gram-dodatnich Staphylococcus aureus [31,60].

Muramidaza ma właściwości, które mogą zostać wykorzystane w celowanym transporcie leków do nerek. LZ, jako białko niskocząsteczkowe (< 30 kDa) bądź też w połączeniu z lekami: kaptopryl-LZ, naproksen-LZ, są łatwo przesączane przez kłębuszek nerkowy. Następnie rozpadają się w lizosomach komórek kanalika bliższego. Zastosowanie leku w postaci kompleksu z muramidazą umożliwia manipulowanie szybkością uwalniania leku w nerce. Białka niskocząsteczkowe odkładają się tylko w nerce, stąd też unika się szkodliwych następstw, jakie mogłyby wystąpić w wyniku oddziaływania na inne komórki organizmu człowieka. Celowany transport leku do nerek może poprawić nie tylko terapię chorób nerek, ale także chorób sercowo- -naczyniowych [31,33].

Ilość LZ w  organizmach ludzi albo zwierząt może być wskaźnikiem występowania zmian patologicznych. W celu rozpoznania wirusowego lub bakteryjnego zapalenia opon mózgowych stosowane jest oznaczanie zawartości LZ w surowicy krwi. Ilość muramidazy wyizolowana z kału ludzi dorosłych jest wykorzystywana, jako wskaźnik występujących zmian chorobowych jelit, a duża zawartość u osób po 40 roku życia może wskazywać na nowotwór odbytu [41]. Muramidaza podobnie jak niektóre inne białka wyizolowane z jaj (głównie kurzych), np. owomucyna, awidyna, cystatyna, jest stosowana w testach immunologicznych typu ELISA [31].

Mechanizmy obronne bakteriichroniąceje przed działaniem lizozymu

Udział LZ w systemie obronnym wielu taksonomicznie odległych organizmów, takich jak np. rośliny, bezkręgowce czy kręgowce wskazuje na jego ewolucyjny sukces, jako czynnika bakteriobójczego. W związku z tak powszechnym występowaniem i skutecznością antybakteryjną, nie dziwi, że bakterie wykształciły mechanizmy pozwalające im uniknąć działania tego enzymu [11]. Pałeczki E. coli zawierają peryplazmatyczne białko Ivy, będące inhibitorem LZ. Działa swoiście w stosunku do typu c i g muramidazy, które występują u kręgowców. Jego hamująca właściwość odpowiada strukturalnemu i ewolucyjnemu powiązaniu poszczególnych postaci LZ [12].

Wykryto, że aktywność hamującą działanie muramidazy typu c ma peryplazmatyczne białko PliC Salmonella Enteritidis oraz lipoproteiny MliC P. aeruginosa i E. coli [11,104]. Jest to nowa klasa inhibitorów, których homologi są powszechne wśród Proteobacteria, co wskazuje na ich udział w interakcji bakteria-gospodarz. Dla pałeczek z rodzaju Salmonella taki rodzaj oporności może mieć istotne znaczenie w przeżywalności mikroorganizmów wewnątrz makrofagów, które wytwarzają cały zestaw antybakteryjnych substancji, w tym również LZ. Należy dodać, że PliC oraz MliC nie są w żaden sposób powiązane z białkiem Ivy.

Możliwe działanie bakteryjnych inhibitorów muramidazy może wykraczać poza ich neutralizujące działanie wzglę- dem LZ. PG jest uważany za silny czynnik wpływający na odporność wrodzoną przez interakcję ze specyficznymi receptorami gospodarza. Szczególne znaczenie mają fragmenty PG powstające w wyniku działania enzymów litycznych. Wpływ bakteryjnych inhibitorów LZ na fragmentację PG przez muramidazę, przyczynia się więc do zaburzeń w funkcjonowaniu układu immunologicznego gospodarza [11,104]. Swoiste bakteryjne inhibitory LZ wykryto również dla typu i muramidazy – białko PliI oraz typu g – PliG. Początkowo PliG wyizolowano z pałeczek E. coli, ale domniemane jego homologi można znaleźć w 15-20 innych rodzajów Proteobacteria. Wiele bakterii ma więcej niż jeden rodzaj inhibitora LZ. U np. Salmonella stwierdzono obecność genów pliC, mliC i pliG. Może to być związane z tym, iż niektóre zwierzęta wytwarzają dwa typy muramidazy, a bakterie często mają więcej niż jednego gospodarza, kręgowca lub bezkręgowca [87].

W ostatnich latach wykazano [3,4], że S. aureus jest oporny na działanie LZ ze względu na modyfikację PG przez O- -acetylowanie w pozycji C-6 MurNAc za pomocą O-acetylotransferazy (OatA). Badania wskazują ponadto, iż kwasy tejchojowe (wall teichoic acid, WTA) oraz stopień usieciowania PG również przyczyniają się do oporności gronkowców na hydrolityczną aktywność LZ. W badaniach zastosowano różne metody, takie jak analiza genomu, PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy), Southern blotting, badanie wrażliwości bakterii na LZ i sprawdzenie O-acetylacji PG za pomocą techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), aby określić, u których gatunków gronkowców PG jest zmodyfikowany. Badania wykazały, że kwas muraminowy był O-acetylowany tylko u patogennych, opornych na działanie LZ bakterii (np. S. aureus, S. epidermidis, S. lugdunensis). Wszystkie niepatogenne gatunki były wrażliwe na działanie LZ. Można wskazać wrażliwe gatunki (np. S. carnosus, S. gallinarum i S. xylosus) i nadwrażliwe gatunki (np. S. equorum, S. lentus i S. arlettae). U wszystkich podatnych na działanie LZ gatunków gronkowców, analizowany PG był de-O-acetylowany. Kiedy wykonano transformację genu oatA od opornego na LZ szczepu S. aureus do komórek wrażliwej bakterii S. carnosus, odpowiednie transformanty także stały się oporne na muramidazę [3].

Rola lizozymu w procesie bakteriobójczej aktywnościsurowicy oraz znaczenie montmorylonitu, jako czynnika adsorbującego lizozym z surowicy

Wilson i Spitznagel badali antybakteryjne działanie przeciwciał, komplementu i LZ przez analizę zmian ultrastrukturalnych i biochemicznych, które wywołują te składowe surowicy u szczepów gładkich bakterii E. coli [97]. Przeciwciała (przy nieobecności muramidazy), powodowały wraz z układem dopełniacza uwolnienie z błony zewnętrznej do 72% fosfolipidów znakowanych fosforem 32P i do 85% ma- łych bakteryjnych komponentów. Kwas nukleinowy znakowany fosforem 32P nie został uwolniony. Wykazano nabrzmienie komórek bakterii oraz wygładzenie prawidłowo „pomarszczonych” zewnętrznych warstw ściany komórkowej. Błona cytoplazmatyczna była zniszczona, a struktury wewnątrzkomórkowe uległy dezorganizacji. Kiedy LZ został dodany do układu: przeciwciała i komplement – znakowane fosforem 32P makromolekularne składniki komórki były z niej uwalniane. Uszkodzenie struktury obejmowało utratę sztywności ściany komórkowej oraz jej przerwanie. Zauważono fragmentację mukopeptydowej warstwy ściany komórkowej. Przeciwciała wraz z LZ (przy braku komplementu) nie wywoływały uwalniania znaczącej ilości fosforu 32P z komórek bakterii [97].

W literaturze można znaleźć także badania wskazujące, że muramidaza surowicy ludzkiej nie jest bezpośrednio zaangażowana w reakcje bakteriobójcze in vitro względem szczepów E. coli [57]. Wynika to z obserwacji procesów biochemicznych, które dowodzą, że chociaż uwolnienie komponentów PG i liza komórek są opóźnione i zmniejszone w odpowiedzi na neutralizację LZ, to wzrastająca przepuszczalność oraz hamowanie syntezy białek i RNA postępują nadal, podobnie jak w przypadku obecności aktywnego enzymu. Wydaje się więc, że LZ pełni rolę wspomagającą, ułatwiającą „wejście” składowych komplementu do leżącej głębiej, pod bogato usieciowaną warstwą PG, błony komórkowej. Schreiber i wsp. podobnie sugerują, że zmiany w błonie zewnętrznej powodowane działalnością składowych komplementu, pozwalają na dostęp LZ do warstw PG i jego enzymatyczną degradację [83]. Badacze wskazują tym samym, iż sama muramidaza jest niewystarczającym czynnikiem potrzebnym do wystąpienia lizy komórek bakterii Gram- -ujemnych.

Wykazano, że traktowanie surowicy bakteriami E. coli (dwukrotne, występujące kolejno po sobie), usuwa większość jej bakteriolitycznej aktywności. Zauważono ponadto, że hemolityczny komplement nie został wyraźnie „naruszony” [91]. Zakładając, że utrata bakteriolitycznego działania surowicy, spowodowana kontaktem z bakteriami, była związana ze stratą przeciwciał, dodano do niej surowicę podgrzaną do 56°C (co powodowało jej inaktywację). Uzyskano wówczas częściowe przywrócenie aktywności. Obserwacje te uznano początkowo za dowód udziału przeciwciał w reakcji bakteriolitycznej, do czasu aż zauważono, iż krystaliczny LZ białka jaja dodany w ilościach śladowych, również był zdolny odtworzyć bakteriolityczną aktywność surowicy traktowanej bakteriami. Sugerowało to, że LZ był ważnym czynnikiem usuwanym z surowicy podczas jej wymieszania z bakteriami. Wykonano więc badania z użyciem komórek M. lysodeikticus i stwierdzono, że początkowy poziom muramidazy w surowicy wynosił 5,2 µg/ml [91]. Po pierwszym traktowaniu bakteriami spadł do 2,4 µg/ml, a po drugim do 0,9 µg/ml. Ogrzanie surowicy przez 30 min w 56°C nie miało dostrzegalnego wpływu na aktywność LZ. Zaobserwowano ponadto, że LZ białka jaja wykazywał stabilność termiczną podczas ogrzewania w obecności białek surowicy, która była podobna do stabilności termicznej wykazywanej przez endogenny LZ surowicy. Potwierdzono to eksperymentem, w którym 20 µg/ml LZ białka jaja dodano do surowicy, w której wykazano początkową aktywność LZ na poziomie 4 µg/ml. Po ogrzaniu przez 30 min w 56°C, całkowita aktywność muramidazy w testowanej surowicy wyniosła 20 µg/ml, wskazując, że mniej niż 20% aktywności zostało utracone. Wykazano dodatkowo, że EDTA bez muramidazy nie działało litycznie [91].

Badania prowadzone już w latach 60 XX w. wskazywały na udział endogennego LZ w bakteriobójczej aktywności surowicy. Dowiedziono tego przez adsorpcję surowicy na bentonicie (montmorylonit, glina smektyczna), który w za- łożeniu, jakie poczyniono usuwa ten enzym z surowicy. Surowica traktowana bentonitem ma tylko niewielką aktywność bakteriobójczą względem bakterii E. coli, ale stawała się bardzo aktywna, kiedy dodano do niej LZ białka jaja [91]. Gliny smektyczne, takie jak montmorylonit, są również nazywane bentonitami. Dlatego też w nomenklaturze używa się często zamiennie określenia montmorylonit i bentonit [9,73,86]. Montmorylonit (MMT) należy do krzemianów warstwowych i jest głównym składnikiem bentonitu. Bentonit jest skałą ilastą (iłem pęczniejącym) [52,73,86]. MMT ma zdolność pochłaniania dużych ilości wody, a wraz z nią także pierwiastków biogennych i substancji chemicznych. Na zdolności adsorpcyjne MMT wpływa jego pakietowa struktura oraz obecność słabych oddziaływań van der Waalsa [27,73].

Niektórzy badacze sądzą [9], że najskuteczniejszy przebieg procesu zabijania bakterii występuje wtedy, kiedy wszystkie elementy surowicy współpracują ze sobą. Do badania roli tej kooperacji pomocna jest wspomniana wyżej metoda, w której usuwa się muramidazę z surowicy w wyniku jej adsorpcji na bentonicie [9,26]. Przy jej zastosowaniu wykazano, iż LZ może być brany pod uwagę, jako ważny czynnik w bakteriobójczej aktywności normalnej surowicy bydlęcej oraz NSL dla większości badanych serowarów Salmonella O48 [9]. MMT, oprócz LZ, usuwa z surowicy również inne jej komponenty. Sugeruje się, że są to: składowe C1q i C3 układu dopełniacza, immunoglobulina IgG, properdyna oraz jony wapnia. Może to tłumaczyć utratę właściwości bakteriobójczych surowicy po kontakcie z MMT [9,36].

Za pomocą metod WAXS (wide-angle X-ray scattering, szerokokątowa dyfraktometria rentgenowska, szerokokątowe rozpraszanie rentgenowskie) i SAXS (small-angle X-ray scattering, małokątowa dyfraktometria rentgenowska, dyfraktometria niskokątowa) udało się wykazać, że MMT po kontakcie z surowicą ludzką i bydlęcą, zmienia swoją strukturę przestrzenną [9,10,27].

MMT ma regularną, tworzącą warstwy budowę. Przestrzeń międzywarstwowa wyznaczona według prawa Bragga wynosi 1,1 nm. Najprostszym sposobem zbadania mechanizmu adsorpcji białek surowicy przez MMT jest kontrolowanie rozmiarów tej przestrzeni za pomocą wspomnianych technik dyfraktometrii rentgenowskiej (X-ray diffraction). Okazało się, że struktura minerału po kontakcie z surowicą (eksfoliacji surowicą) ulega delaminacji i traci uporządkowaną budowę [8,9,10]. Aby dowiedzieć się, jakie białko powoduje wspomnianą zmianę struktury, MMT potraktowano roztworem albuminy, roztworem LZ oraz dla porównania, roztworem zawierającym mieszaninę obu tych ważnych białek surowicy. Nie zaobserwowano jednak w żadnym przypadku procesu delaminacji. Wskazuje to, że zmiany struktury przestrzennej MMT są spowodowane przez niezidentyfikowane jeszcze białko lub przez synergistyczną adsorpcję kilku komponentów surowicy, w tym LZ. Bardziej prawdopodobny wydaje się drugi mechanizm. W przypadku surowicy pozbawionej jonów wapnia nie obserwuje się delaminacji struktury minerału, co wskazuje na decydujący wpływ tych kationów na cały proces adsorpcji [9].

W celu ustalenia, jaką rolę LZ odgrywa w zjawisku delaminacji MMT, użyto powszechnie dostępnego źródła enzymu, jakim jest białko jaja kurzego. Przypuszcza się, że dodatni ładunek muramidazy, utrzymujący się w szerokim zakresie pH, powinien nie tylko wspomagać wiązanie się innych białek jaja kurzego do MMT, ale również wpływać stabilizująco na zaadsorbowane molekuły. Roztwór pochodzący z białka jaja kurzego wykorzystany w eksperymentach zawierał cztery najważniejsze jego białka: LZ (o masie cząsteczkowej 14,4 kDa), owomukoid, owoalbuminę oraz owotransferynę [42]. Owoalbumina jest proteiną o masie cząsteczkowej 44,5 kDa i stanowi 54% wszystkich protein jaja kurzego. Owotransferyna stanowi 12% wszystkich protein białka jaja kurzego. Owomukoid natomiast to glikoproteina o masie 28 kDa stanowiąca 10-11% protein białka jaja [31].

Wykazano [42], że w pierwszych sekundach proces adsorpcji na MMT zachodzi najbardziej efektywnie dla transferyny i albumin. Adsorpcja LZ jest o wiele mniejsza, a owomukoid prawie wcale nie odkłada się na płytkach MMT. Po upływie 40 s od początku procesu zaobserwowano nieznaczny wzrost w przebiegu adsorpcji muramidazy, zwiększenie adsorpcji owomukoidu, a także spadek pochłaniania albumin. Po 60 s adsorpcja wszystkich białek z wyjątkiem transferyny niemal ustaje, zaś po około 300 s następuje gwałtowny wzrost w przebiegu adsorpcji owomukoidu. Razem z tym białkiem zwiększa się także adsorpcja LZ. Po upływie 900 s proces ustaje i żadne z białek nie jest już adsorbowane przez MMT. Wynika stąd wniosek, że zjawisko adsorpcji jest związane z sekwencyjnym, zależnym od czasu przyłączaniem się kolejnych białek do MMT [42].

Jedynie muramidaza (ze wszystkich czterech wspomnianych białek) ma ładunek dodatni, co powinno sprzyjać jej wiązaniu przez MMT. Omówione jednak wyżej wyniki wskazują, że na początku procesu adsorpcji (0-20 s), na MMT „osadzają” się głównie owoalbumina i owotransferyna, mimo ich ujemnego ładunku. Świadczy to, iż wytworzenie pierwszej warstwy białek na powierzchni minerału nie zależy od elektrostatycznych interakcji między białkami a MMT. Na tym etapie można przypuszczać, że wspomniane proteiny wiążą się na powierzchni MMT przez pewne specyficzne interakcje. Badacze doszli do wniosku, że za dezintegrację warstwowej struktury minerału odpowiada głównie adsorpcja owotransferyny i owoalbuminy. Wydaje się, że LZ nie bierze udziału podczas delaminacji, a jego ilość zaadsorbowana przez MMT jest niewielka [42]. Dzięki metodom WAXS i SAXS pojawiają się nowe moż- liwości badań nad interakcją LZ z innymi białkami, np. białkami obecnymi w jajach kręgowców lub białkami układu dopełniacza. Rola LZ w procesie bakteriobójczej aktywności surowicy wobec bakterii Gram-ujemnych jest niewyjaśniona i budzi wciąż wiele kontrowersji [9].

Wyniki eksperymentów przeprowadzonych przez Mokracką-Latajka i wsp. [61] wskazują, że 60% badanych szczepów Salmonella było zabijanych tylko w surowicy, w której dopełniacz był aktywowany na drodze klasycznej oraz obecny był LZ. 20% szczepów bakterii było wrażliwych, kiedy w surowicy aktywna była ścieżka klasyczna układu dopełniacza bez udziału muramidazy, a pozosta- łe 20% wykazywało podatność na działanie surowicy, w której aktywowane były niezależne mechanizmy: komplement aktywowany na drodze klasycznej bez udziału LZ oraz komplement aktywowany na drodze alternatywnej w obecności LZ. Badacze Ci wykazali również, iż szczepy bakterii Gram-ujemnych typu gładkiego, mające kompletny lipopolisacharyd (LPS) – postaci S były wrażliwe tylko na kompletną ludzką surowicę, co oznacza, że wszystkie jej bakteriobójcze czynniki (łącznie z LZ) są potrzebne do wywołania spadku przeżywalności tych bakterii w surowicy. Aby zabić komórki bakterii o skróconym LPS (typu R, postaci szorstkie), konieczna była aktywacja różnych mechanizmów antybakteryjnych [61]. Wolska i wsp. stwierdzili, że obecność muramidazy w surowicy świńskiej i bydlęcej pełni ważną funkcję w ich reakcji bakteriobójczej, ponieważ usunięcie enzymu wywołało 69% obniżenie aktywności surowicy świńskiej wobec komórek bakterii P. aeruginosa i 78% spadek działania surowicy bydlęcej wobec komórek tych bakterii [100]. Wpływu LZ na komórki P. aeruginosa nie zauważono natomiast w 50% surowicy ludzkiej [100].

Bardzo ciekawe są wyniki wykazujące, iż wpływ LZ na proces bakteriobójczy surowicy ujawnia się w niskich stężeniach surowicy ludzkiej, ponieważ w 1% NSL, z któ- rej usunięto LZ odnotowano bardzo wyraźne obniżenie bakteriobójczego działania surowicy. Natomiast 10% NSL pozbawiona enzymu była tak samo bakteriobójcza wobec komórek bakterii jak przed usunięciem z niej LZ [82]. Stwierdzono, że jednorazowa adsorpcja surowicy na bentonicie (z użyciem 5 mg MMT na mililitr surowicy), obniża stężenie LZ z 2,5 µg/ml do mniej niż 0,12 µg/ml [91]. Miano komplementu było przy tym nieznacznie zmniejszone. Jednak aktywność lityczna względem komórek E. coli wyraźnie się obniżyła, a dodanie LZ do 2 µg/ml przywróciło aktywność surowicy do pierwotnego stanu. Sama muramidaza na poziomie 5 µg/ml nie wykazywała bakteriolitycznego działania na komórki E. coli [91].

Badania prowadzone przez Jankowskiego potwierdzają, iż LZ jest usuwany z surowicy po kontakcie z MMT, ale wskazują także, że pewna jego część nadal w niej pozostaje [36]. Autor zaobserwował, że w surowicy pępowinowej poddanej procesowi adsorpcji na bentonicie występuje mniejsze stężenie muramidazy w porównaniu z surowicą wyjściową. We wspomnianych badaniach użyto pulę składającą się z trzech surowic pępowinowych (NSP – normalna surowica pępowinowa). Należy dodać, że w zastosowanej przez autora metodzie, użyto 5 mg bentonitu na 1 ml surowicy. Być może mniejsza ilość MMT nie była wystarczająca do całkowitego usunięcia LZ z surowicy [36].

Wyniki badań własnych (dane niepublikowane) wykazały, że po procesie adsorpcji na MMT surowica końska oraz owcza tracą antybakteryjną aktywność wobec bakterii Salmonella enterica subsp. enterica serowar Dahlem oraz S. enterica subsp. salamae serowar Erlangen. Jednak po zwiększeniu objętości surowicy owczej (do 4 lub 8 ml), która miała kontakt ze stałą ilością MMT (10 mg), obserwowano spadek przeżywalności pałeczek S. Erlangen w surowicy. Po traktowaniu MMT, w obu wspomnianych surowicach zwierzęcych nie wykryto aktywności enzymatycznej LZ, a stężenie białka całkowitego w tak modyfikowanych surowicach zmniejszyło się, choć obie surowice różnią się pod względem ilości zaadsorbowanych przez bentonit białek. Wyniki uzyskane z elektroforezy SDS- -PAGE białek surowiczych wskazują natomiast, że MMT z dwóch badanych surowic kręgowców usuwa białko, którego masa cząsteczkowa zawiera się w przedziale 93,8- 96,2 kDa. W podanym zakresie mas mieszczą się czynnik B i składowa C6 układu dopełniacza.

Celem obecnie prowadzonych badań nad procesem adsorpcji białek jaja kurzego na MMT jest opracowanie metody służącej do otrzymywania stabilnych hybrydowych kompleksów: eksfoliowany montmorylonit-molekuły białek, która nie wymagałaby zastosowania modyfikacji chemicznych [42]. Natomiast celem badań prowadzonych nad zjawiskiem delaminacji MMT w surowicy jest uzyskanie nanonapełniacza kompozytów polimerowych mającego bakteriobójcze lub bakteriostatyczne właściwości [40]. Nasuwać się może jeszcze pytanie czy proces adsorpcji jest odwracalny i czy istnieje możliwość odzyskania związanych przez MMT protein. Jeśli desorpcja okazałaby się skuteczna, bentonit mógłby znaleźć zastosowanie, jako materiał do separacji białek [73].

Podsumowanie

Przedstawione w pracy informacje mają na celu zwrócenie uwagi na wielość i złożoność aspektów charakteryzujących LZ. Rozległe i szczegółowe badania prowadzone nad enzymem, nie wyjaśniły dotychczas wszystkich jego funkcji i procesów, w które białko to jest zaangażowane. Oprócz podstawowego działania litycznego LZ na ściany komórek bakteryjnych, podawane są inne liczne właściwości muramidazy. Różne sposoby modyfikacji enzymu stwarzają możliwość lepszego wykorzystania tego białka w przemyśle spożywczym i medycynie. Zainteresowanie badaczy skupia się również wokół mechanizmów obronnych bakterii, pozwalających im uniknąć działania LZ oraz udziału muramidazy w procesie bakteriobójczej aktywności surowicy. Ta wielość i różnorodność właściwości LZ czyni z białka wciąż interesujący przedmiot badań.

Przypisy

• 1. Abergel C., Monchois V., Byrne D., Chenivesse S., Lembo F., LazzaroniJ.C., Claverie J.M.: Structure and evolution of the Ivy proteinfamily, unexpected lysozyme inhibitors in Gram-negative bacteria.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007; 104: 6394-6399
  Google Scholar
• 2. Artymiuk P.J., Blake C.C., Grace D.E., Oatley S.J., Phillips D.C., SternbergM.J.: Crystallographic studies of the dynamic properties of lysozyme.Nature, 1979; 280: 563-568
  Google Scholar
• 3. Bera A., Biswas R., Herbert S., Götz F.: The presence of peptidoglycano-acetyltransferase in various staphylococcal species correlateswith lysozyme resistance and pathogenicity. Infect. Immun., 2006;74: 4598-4604
  Google Scholar
• 4. Bera A., Biswas R., Herbert S., Kulauzovic E., Weidenmaier C., PeschelA., Götz F.: Influence of wall teichoic acid on lysozyme resistancein Staphylococcus aureus. J. Bacteriol., 2007; 189: 280-283
  Google Scholar
• 5. Blake C.C., Koenig D.F., Mair G.A., North A.C., Phillips D.C., SarmaV.R.: Structure of hen egg-white lysozyme. A three-dimensional Fouriersynthesis at 2 Angstrom resolution. Nature, 1965; 206: 757-761
  Google Scholar
• 6. Borowiak R., Leśnierowski G.: Próba zwiększenia funkcjonalnościpreparatów otrzymanych metodą wysokotemperaturowej modyfikacjilizozymu. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2012; 5: 124-134
  Google Scholar
• 7. Buczek J., Deptuła W., Gliński Z., Jarosz J., Stosik M., Wernicki A.:Immunologia porównawcza i rozwojowa zwierząt. Wydawnictwo NaukowePWN, Warszawa, Poznań 2000
  Google Scholar
• 8. Bugla-Płoskońska G., Kiersnowski A., Futoma-Kołoch B., DoroszkiewiczW.: Cooperation between lysozyme and complement systemin bactericidal action of human serum – is everything already clear?Centr. Eur. J. Immunol., 2008; 33: 37-42
  Google Scholar
• 9. Bugla-Płoskońska G., Kiersnowski A., Futoma-Kołoch B., DoroszkiewiczW.: Killing of Gram-negative bacteria with normal human serumand normal bovine serum: use of lysozyme and complement proteinsin the death of Salmonella strains O48. Microb. Ecol. 2009; 58: 276-289
  Google Scholar
• 10. Bugla-Płoskońska G., Kiersnowski A., Futoma-Kołoch B., DoroszkiewiczW.: Serum as an environment to live or not to live for Gramnegativebacteria: relationship between lysozyme and complementsystem in killing Salmonella O48 strain. W: Current Research Topics inApplied Microbiology and Microbial Biotechnology, red.: A. MendezVilas.World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, Singapore 2009, 523-527
  Google Scholar
• 11. Callewaert L., Aertsen A., Deckers D., Vanoirbeek K.G., VanderkelenL., Van Herreweghe J.M., Masschalck B., Nakimbugwe D., RobbenJ., Michiels C.W.: A new family of lysozyme inhibitors contributing tolysozyme tolerance in gram-negative bacteria. PLoS Pathog., 2008;4: e1000019
  Google Scholar
• 12. Callewaert L., Masschalck B., Deckers D., Nakimbugwe D., AtanassovaM., Aertsen A., Michiels C.W.: Purification of Ivy, a lysozyme inhibitorfrom Escherichia coli, and characterisation of its specificity forvarious lysozymes. Enz. Microb. Technol., 2005; 37: 205-211
  Google Scholar
• 13. Callewaert L., Michiels C.W.: Lysozymes in the animal kingdom.J. Biosci., 2010; 35: 127-160
  Google Scholar
• 14. Cegielska-Radziejewska R., Leśnierowski G., Kijowski J.: Antibacterialactivity of lysozyme modified by the membrane technique. EJPAUFood Sci. Technol., 2003; 6: 1-6
  Google Scholar
• 15. Cegielska-Radziejewska R., Leśnierowski G., Kijowski J.: Antibacterialactivity of hen egg white lysozyme modified by termochemicaltechnique. Eur. Food Res. Technol., 2009; 228: 841-845
  Google Scholar
• 16. Daeschel M.A., Bruslind L., Clawson J.: Application of the enzymelysozyme in brewing. MBAA TQ, 1999; 36: 219-222
  Google Scholar
• 17. Datta S., Biswal B.K., Vijayan M.: The effect of stabilizing additiveson the structure and hydration of proteins: a study involving tetragonallysozyme. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2001; 57: 1614-1620
  Google Scholar
• 18. Dembczyński R.,Białas W., Jankowski T.: Wykorzystanie dwufazowejekstrakcji wodnej do separacji lizozymu z białka jaja kurzego.Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2009; 5: 5-17
  Google Scholar
• 19. Deptuła W., Buczek J.: Zarys immunologii ssaków. WydawnictwoUniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 1998
  Google Scholar
• 20. Deshpande A., Nimsadkar S., Mande S.C.: Effect of alcohols onprotein hydration: crystallographic analysis of hen egg-white lysozymein the presence of alcohols. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.,2005; 61: 1005-1008
  Google Scholar
• 21. Dimitrov I., Djorbineva M., Sotirov L., Tanchev S.: Influence offearfulness on lysozyme and complement concentrations in dairysheep. Revue Méd. Vét., 2005; 156: 445-448
  Google Scholar
• 22. Doonan S.: Białka i peptydy. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa2008
  Google Scholar
• 23. Durek T., Torbeev V.Y., Kent S.B.: Convergent chemical synthesisand high-resolution x-ray structure of human lysozyme. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 2007; 104: 4846-4851
  Google Scholar
• 24. Düring K., Porsch P., Mahn A., Brinkmann O., Gieffers W.: Thenon-enzymatic microbicidal activity of lysozymes. FEBS Lett., 1999;449: 93-100
  Google Scholar
• 25. Enzyme nomenclature database. http://enzyme.expasy.org/EC/3.2.1.17 (12.09.2013)
  Google Scholar
• 26. Feingold D.S., Goldman J.N., Kuritz H.M.: Locus of the action ofserum and the role of lysozyme in the serum bactericidal reaction. J.Bacteriol., 1968; 96: 2118-2126
  Google Scholar
• 27. Futoma-Kołoch B., Bugla-Płoskońska G.: Efektywność bakteriobójczegodziałania surowicy wynikająca z obecności układu dopełniaczai lizozymu wobec bakterii, które unikają odpowiedzi immunologicznejorganizmu. Postępy Hig. Med. Dośw., 2009; 63: 471-484
  Google Scholar
• 28. Gerbaux V., Villa A., Monamy C., Bertrand A.: Use of lysozyme toinhibit malolactic fermentation and to stabilize wine after malolacticfermentation. Am. J. Enol. Vitic., 1997; 48: 49-54
  Google Scholar
• 29. Gill J.: Serum lysozyme level in the European bison, Bison bonasus(L.). Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol., 1995; 110B: 235-240
  Google Scholar
• 30. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W., Stokłosa T.: Immunologia. WydawnictwoNaukowe PWN, Warszawa 2007
  Google Scholar
• 31. Gołąb K., Warwas M.: Białka jaja kurzego – właściwości biochemicznei zastosowania. Adv. Clin. Exp. Med., 2005; 14: 1001-1010
  Google Scholar
• 32. Goto T., Abe Y., Kakuta Y., Takeshita K., Imoto T., Ueda T.: Crystalstructure of Tapes japonica lysozyme with substrate analogue: structuralbasis of the catalytic mechanism and manifestation of its chitinaseactivity accompanied by quaternary structural change. J. Biol.Chem., 2007; 282: 27459-27467
  Google Scholar
• 33. Haas M., Moolenaar F., Meijer D.K., De Zeeuw D.: Specific drug deliveryto the kidney. Cardiovasc. Drugs Ther., 2002; 16: 489-496
  Google Scholar
• 34. Hadfield A.T., Harvey D.J., Archer D.B., MacKenzie D.A., Jeenes D.J.,Radford S.E., Lowe G., Dobson C.M., Johnson L.N.: Crystal structure ofthe mutant D52S hen egg white lysozyme with an oligosaccharideproduct. J. Mol. Biol., 1994; 243: 856-872
  Google Scholar
• 35. Ibrahim H.R., Higashiguchi S., Koketsu M., Juneja L.R., Kim M.,Yamamoto T., Sugimoto Y., Aoki T.: Partially unfolded lysozyme atneutral pH agglutinates and kills Gram-negative and Gram-positivebacteria through membrane damage mechanism. J. Agric. Food Chem.,1996; 44: 3799-3806
  Google Scholar
• 36. Jankowski S.: Badania nad rolą dopełniacza i przeciwciał w bakteriobójczymdziałaniu normalnej surowicy pępowinowej wobec pa-łeczek Salmonella. Immunologia Polska, 1988; 13: 233-244
  Google Scholar
• 37. Jurczyszyn A., Skotnicki A.B.: Postępy w badaniach nad molekularnąpatogenezą amyloidozy oraz implikacje kliniczne. Adv. Clin. Exp.Med., 2004; 13: 669-676
  Google Scholar
• 38. Kajla M.K., Shi L., Li B., Luckhart S., Li J., Paskewitz S.M.: A newrole for an old antimicrobial: lysozyme c-1 can function to protectmalaria parasites in Anopheles mosquitoes. PLoS One, 2011; 6: e19649
  Google Scholar
• 39. Kenner G.W.: The Bakerian lecture. Towards synthesis of proteins.Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 1977; 197: 237-253
  Google Scholar
• 40. Kiersnowski A., Serwadczak M., Kułaga E., Futoma-Kołoch B.,Bugla-Płoskońska G., Kwiatkowski R., Doroszkiewicz W., PigłowskiJ.: Delamination of montmorillonite in serum – a new approach toobtaining clay-based biofunctional hybrid materials. Appl. Clay Sci.,2009; 44: 225-229
  Google Scholar
• 41. Kijowski J., Leśnierowski G.: Wykorzystanie lizozymu do utrwalaniażywności w diagnostyce medycznej i farmakologii. Biotechnologia,1995; 2: 130-140
  Google Scholar
• 42. Kolman K., Steffen W., Bugla-Płoskońska G., Skwara A., PigłowskiJ., Butt H.J., Kiersnowski A.: Exfoliation of montmorillonite in proteinsolutions. J. Colloid Interface Sci., 2012; 374: 135-140
  Google Scholar
• 43. Koterska B., Poznańska S., Lewicki C., Ryduzik W.: Inhibition ofbutyric acid fermentation in cheese by addition of lysozyme in theform of egg-white. Dodatek Naukowy, 1972; 4: 5-7
  Google Scholar
• 44. Kurinov I.V., Harrison R.W.: The influence of temperature on lysozymecrystals. Structure and dynamics of protein and water. ActaCrystallogr. D Biol. Crystallogr., 1995; 51: 98-109
  Google Scholar
• 45. Lapcharoen P., Komalamisra N., Rongsriyam Y., WangsuphachartV., Dekumyoy P., Prachumsri J., Kajla M.K., Paskewitz S.M.: Investigationson the role of a lysozyme from the malaria vector Anophelesdirus during malaria parasite development. Dev. Comp. Immunol.,2012; 36: 104-111
  Google Scholar
• 46. Lee-Huang S., Huang P.L., Sun Y., Huang P.L., Kung H.F., Blithe D.L.,Chen H.C.: Lysozyme and RNases as anti-HIV components in β-corepreparations of human chorionic gonadotropin. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 1999; 96: 2678-2681
  Google Scholar
• 47. Leśnierowski G.: Nowe sposoby fizykochemicznej modyfikacjilizozymu. Nauka Przyr. Technol., 2009; 3: 1-18
  Google Scholar
• 48. Leśnierowski G., Borowiak R.: Wpływ warunków środowiskowychna zmianę właściwości lizozymu w białku jaj kurzych. Żywność. Nauka.Technologia. Jakość, 2012; 3: 77-87
  Google Scholar
• 49. Leyko W.: Biofizyka dla biologów. Państwowe Wydawnictwo Naukowe,Warszawa 1983
  Google Scholar
• 50. Liang A.H., Sugawara N., Ohno N., Adachi Y., Yadomae T.: Effectof O-antigenic polysaccharide of Escherichia coli on endotoxin neutralizingactivity of lysozyme. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1998;21: 79-87
  Google Scholar
• 51. Male D., Brostoff J., Roth D.B., Roitt I.: Immunology, Seventh Edition.Mosby Elsevier, 2006
  Google Scholar
• 52. Malesa M.: Nanonapełniacze kompozytów polimerowych. CzęśćI. Krzemiany warstwowe. Elastomery, 2004; 8: 12-17
  Google Scholar
• 53. Malicki A., Jarmoluk A., Brużewicz S.: Wpływ dodatku lizozymu natrwałość i bezpieczeństwo mikrobiologiczne kiełbas w osłonce barierowej.Acta Sci. Pol. Medicina Veterinaria, 2003; 2: 29-36
  Google Scholar
• 54. Marquis G., Garzon S., Strykowski H., Auger P.: Cell walls of normaland lysozyme-damaged blastoconidia of Candida albicans: localizationof surface factor 4 antigen and vicinal-glycol staining. Infect. Immun.,1991; 59: 1312-1318
  Google Scholar
• 55. Marquis G., Montplaisir S., Garzon S., Strykowski H., Auger P.: Fungitoxicityof muramidase. Ultrastructural damage to Candida albicans.Lab. Invest., 1982; 46: 627-636
  Google Scholar
• 56. Marsich E., Zuccato P., Rizzi S., Vetere A., Tonin E., Paoletti S.:Helicobacter pylori expresses an autolytic enzyme: gene identification,cloning, and theoretical protein structure. J. Bacteriol., 2002;184: 6270-6279
  Google Scholar
• 57. Martinez R.J., Carroll S.F.: Sequential metabolic expressions ofthe lethal process in human serum-treated Escherichia coli: role of lysozyme.Infect. Immun., 1980; 28: 735-745
  Google Scholar
• 58. Masschalck B., Van Houdt R., Van Haver E.G.R., Michiels C.W.: Inactivationof gram-negative bacteria by lysozyme, denatured lysozyme,and lysozyme-derived peptides under high hydrostatic pressure. Appl.Environ. Microbiol., 2001; 67: 339-344
  Google Scholar
• 59. Matsuura K., Tamura T., Kobayashi N., Yashiro T., Tatsumi S.: Theantibacterial protein lysozyme identified as the termite egg recognitionpheromone. PLoS One, 2007; 2: e813
  Google Scholar
• 60. Mine Y., Ma F., Lauriau S.: Antimicrobial peptides released by enzymatichydrolysis of hen egg white lysozyme. J. Agric. Food Chem.,2004; 52: 1088-1094
  Google Scholar
• 61. Mokracka-Latajka G., Jankowski S., Grzybek-Hryncewicz K.,Krzyżanowska B.: The mechanism of bactericidal action of normalhuman serum against Salmonella rods. Acta Microbiol. Pol., 1996; 45:169-180
  Google Scholar
• 62. Monzingo A.F., Marcotte E.M., Hart P.J., Robertus J.D.: Chitinases,chitosanases, and lysozymes can be divided into procaryoticand eucaryotic families sharing a conserved core. Nat. Struct. Biol.,1996; 3: 133-140
  Google Scholar
• 63. Mudgil P., Torres M., Millar T.J.: Adsorption of lysozyme to phospholipidand meibomian lipid monolayer films. Colloids Surf. B. Biointerfaces,2006; 48: 128-137
  Google Scholar
• 64. Nace G.W., Suyama T., Iwata T.: The relationship between a lysozyme-likeenzyme and frog adenocarcinoma. Ann. N. Y. Acad. Sci.,1965; 126: 204-221
  Google Scholar
• 65. Nagendra H.G., Sukumar N., Vijayan M.: Role of water in plasticity,stability, and action of proteins: the crystal structures of lysozyme atvery low levels of hydration. Proteins, 1998; 32: 229-240
  Google Scholar
• 66. Neujahr H.Y., Börstad B., Logardt I.M.: Factors affecting the resistanceof Lactobacillus fermenti to lysozyme. J. Bacteriol., 1973; 116:694-698
  Google Scholar
• 67. Noller E.C., Hartsell S.E.: Bacteriolysis of Enterobacteriaceae. I.Lysis by four lytic systems utilizing lysozyme. J. Bacteriol., 1961;81: 482-491
  Google Scholar
• 68. Noller E.C., Hartsell S.E.: Bacteriolysis of Enterobacteriaceae. II.Pre- and co-lytic treatments potentiating the action of lysozyme. J.Bacteriol., 1961; 81: 492-499
  Google Scholar
• 69. Ogundele M.O.: A novel anti-inflammatory activity of lysozyme:modulation of serum complement activation. Mediators Inflamm.,1998; 7: 363-365
  Google Scholar
• 70. Ostrovsky D.S., Snyder J.A., Iwata T., Izaka K.I., Maglott D.S., NaceG.W.: Frog lysozyme. I. Its identification, occurence as isozymes, andquantitative distribution in tissues of the leopard frog, Rana pipiens.J. Exp. Zool., 1976; 195: 279-290
  Google Scholar
• 71. Peterson R.G., Hartsell S.E.: The lysozyme spectrum of the gramnegativebacteria. J. Infect. Dis., 1955; 96: 75-81
  Google Scholar
• 72. Proctor V.A., Cunningham F.E.: The chemistry of lysozyme andits use as a food preservative and a pharmaceutical. Crit. Rev. FoodSci. Nutr., 1988; 26: 359-395
  Google Scholar
• 73. Ralla K., Sohling U., Riechers D., Kasper C., Ruf F., Scheper T.:Adsorption and separation of proteins by a smectitic clay mineral.Bioprocess Biosyst. Eng., 2010; 33: 847-861
  Google Scholar
• 74. Ratajczak P., Białas W., Dembczyński R., Grajek W., Jankowski T.:Ekstrakcja dwufazowa lizozymu z białka jaja kurzego. Żywność. Nauka.Technologia. Jakość, 2004; 3: 40-52
  Google Scholar
• 75. Refaee M., Tezuka T., Akasaka K., Williamson M.P.: Pressure-dependentchanges in the solution structure of hen egg-white lysozyme.J. Mol. Biol., 2003; 327: 857-865
  Google Scholar
• 76. Repaske R.: Lysis of gram-negative bacteria by lysozyme. Biochim.Biophys. Acta, 1956; 22: 189-191
  Google Scholar
• 77. Repaske R.: Lysis of gram-negative organisms and the role ofversene. Biochim. Biophys. Acta, 1958; 30: 225-232
  Google Scholar
• 78. Salton M.R.: The properties of lysozyme and its action on microorganisms.Bacteriol. Rev., 1957; 21: 82-100
  Google Scholar
• 79. Salton M.R., Pavlik J.G.: Studies of the bacterial cell wall. VI. Wallcomposition and sensitivity to lysozyme. Biochim. Biophys. Acta,1960; 39: 398-407
  Google Scholar
• 80. Saurabh S., Sahoo P.K.: Lysozyme: an important defence moleculeof fish innate immune system. Aquac. Res., 2008; 39: 223-239
  Google Scholar
• 81. Sava G., Benetti A., Ceschia V., Pacor S.: Lysozyme and cancer:role of exogenous lysozyme as anticancer agent (review). AnticancerRes., 1989; 9: 583-591
  Google Scholar
• 82. Schiller N.L., Alazard M.J., Borowski R.S.: Serum sensitivity ofa Pseudomonas aeruginosa mucoid strain. Infect. Immun., 1984; 45:748-755
  Google Scholar
• 83. Schreiber R.D., Morrison D.C., Podack E.R., Müller-EberhardH.J.: Bactericidal activity of the alternative complement pathwaygenerated from 11 isolated plasma proteins. J. Exp. Med., 1979;149: 870-882
  Google Scholar
• 84. Sharp J.J., Robinson A.B., Kamen M.D.: Synthesis of a polypeptidewith lysozyme activity. J. Am. Chem. Soc., 1973; 95: 6097-6108
  Google Scholar
• 85. Shugar D.: The measurement of lysozyme activity and the ultra-violetinactivation of lysozyme. Biochim. Biophys. Acta, 1952; 8: 302-309
  Google Scholar
• 86. Spychaj T., Heneczkowski M., Pigłowski J., Oleksy M., KowalczykK., Kiersnowski A., Galina H.: Modyfikowane bentonity (montmorylonity)jako podstawa rozwoju nanomateriałów polimerowych w kraju.Inżynieria Materiałowa, 2006; 6: 1296-1302
  Google Scholar
• 87. Vanderkelen L., Van Herreweghe J.M., Vanoirbeek K.G., BaggermanG., Myrnes B., Declerck P.J., Nilsen I.W., Michiels C.W., CallewaertL.: Identification of a bacterial inhibitor against g-type lysozyme. Cell.Mol. Life Sci., 2011; 68: 1053-1064
  Google Scholar
• 88. Ved’mina E.A., Pasternak N.A., Shenderovich V.A., Zhuravleva T.P.,Andrusenko I.T.: Sensitivity of Gram-negative microflora to lysozyme.Antibiotiki, 1979; 24: 746-750
  Google Scholar
• 89. Wang J., Dauter M., Alkire R., Joachimiak A., Dauter Z.: Tricliniclysozyme at 0.65 A resolution. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.,2007; 63: 1254-1268
  Google Scholar
• 90. Wang S., Ng T.B., Chen T., Lin D., Wu J., Rao P., Ye X.: First reportof a novel plant lysozyme with both antifungal and antibacterial activities.Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005; 327: 820-827
  Google Scholar
• 91. Wardlaw A.C.: The complement-dependent bacteriolytic activityof normal human serum. I. The effect of pH and ionic strength andthe role of lysozyme. J. Exp. Med., 1962; 115: 1231-1249
  Google Scholar
• 92. Warren G.H., Gray J., Bartell P.: The lysis of Pseudomonas aeruginosaby lysozyme. J. Bacteriol., 1955; 70: 614-619
  Google Scholar
• 93. Warren G.H., Gray J., Yurchenco J.A.: Effect of polymyxin on thelysis of Neisseria catarrhalis by lysozyme. J. Bacteriol., 1957; 74: 788-793
  Google Scholar
• 94. Wasserfall F.E., Voss E., Prokopek D.: Studies on cheese ripening.V. The use of lysozyme instead of nitrate to inhibit late blowing ofcheese. Kiel. Milchwirtsch. Forschungsber., 1976; 28: 3-16
  Google Scholar
• 95. Weaver L.H., Grütter M.G., Matthews B.W.: The refined structuresof goose lysozyme and its complex with a bound trisaccharide showthat the “goose-type” lysozymes lack a catalytic aspartate residue. J.Mol. Biol., 1995; 245: 54-68
  Google Scholar
• 96. Wiesner J., Vilcinskas A.: Antimicrobial peptides: the ancient armof the human immune system. Virulence, 2010; 1: 440-464
  Google Scholar
• 97. Wilson L.A., Spitznagel J.K.: Molecular and structural damageto Escherichia coli produced by antibody, complement, and lysozymesystems. J. Bacteriol., 1968; 96: 1339-1348
  Google Scholar
• 98. Witholt B., Heerikhuizen H.V., De Leij L.: How does lysozyme penetratethrough the bacterial outer membrane? Biochim. Biophys.Acta, 1976; 443: 534-544
  Google Scholar
• 99. Wolin M.J.: Lysis of Vibrio succinogenes by ethylenediaminetetraaceticacid or lysozyme. J. Bacteriol., 1966; 91: 1781-1786
  Google Scholar
• 100. Wolska K., Bukowski K., Anusz Z., Jakubczak A.: Bakteriobójczaaktywność surowicy ludzkiej, świńskiej i bydlęcej wobec szczepówPseudomonas aeruginosa. Med. Dośw. Mikrobiol., 1999; 51: 339-345
  Google Scholar
• 101. Yajima M., Hidaka Y., Matsuoka Y.: Studies on egg-white lysozymeas a preservative of sake. J. Ferment. Technol., 1968; 46: 782-788
  Google Scholar
• 102. Yano T.: The nonspecific immune system: humoral defence. W:The fish immune system. Organism, pathogen, and environment, red.:G. Iwama, T. Nakanishi. Academic Press, San Diego, London, Boston,New York, Sydney, Tokyo, Toronto 1996, 106-110
  Google Scholar
• 103. Yuan B., Xing L.L., Zhang Y.D., Lu Y., Luo Y.Y., Mai Z.H., Li M.:Penetration and saturation of lysozyme in phospholipid bilayers. J.Phys. Chem. B., 2007; 111: 6151-6155
  Google Scholar
• 104. Yum S., Kim M.J., Xu Y., Jin X.L., Yoo H.Y., Park J.W., Gong J.H.,Choe K.M., Lee B.L., Ha N.C.: Structural basis for the recognition of lysozymeby MliC, a periplasmic lysozyme inhibitor in Gram-negativebacteria. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2009; 378: 244-248
  Google Scholar
• 105. Zimmerman L.M., Vogel L.A., Bowden R.M.: Understanding thevertebrate immune system: insights from the reptilian perspective.J. Exp. Biol., 2010; 213: 661-671
  Google Scholar

Pełna treść artykułu