Abstrakt

Od czasu odkrycia roli reaktywnych form tlenu (RFT) w etiologii tzw. chorób cywilizacyjnych, obejmujących nieinfekcyjne chroniczne choroby, takie jak nowotwory, cukrzyca czy nadciśnienie tętnicze oraz możliwości wykorzystania związków o charakterze przeciwutleniaczy w walce z tymi chorobami, naukowcy opracowali wiele metod służących do oznaczania aktywności przeciwutleniającej , zarówno czystych związków chemicznych, jak i ekstraktów roślinnych czy suplementów diety. Metody są przeważnie oparte na prostych reakcjach chemicznych między przeciwutleniaczem a modelowymi wolnymi rodnikami (np. testy ABTS, DPPH) lub jonami metali (np. FRAP czy CUPRAC). Jednak metody chemiczne zazwyczaj nie odzwierciedlają rzeczywistej aktywności przeciwutleniaczy w żywym organizmie. Przyczyną jest to, iż metody te nie tylko wykorzystują niefizjologiczne warunki pH i temperatury, ale również nie uwzględniają metabolizmu przeciwutleniaczy w organizmie ani ich transportu wewnątrz komórki. Idealnym modelem do oceny aktywności związków o charakterze przeciwutleniaczy byłby model ludzki, jednak zarówno badania z udziałem ludzi, jak i testy na zwierzętach są bardzo złożone, a ich wyniki często niejednoznaczne. Najlepszą alternatywą zarówno dla testów chemicznych, jak i badań z udziałem ludzi są obecnie testy wykorzystujące modele komórkowe. Są znacznie tańsze, a przy tym odwzorowują systemy biologiczne lepiej od testów chemicznych. Komórkowe testy oznaczania aktywności przeciwutleniającej są bowiem prowadzone w fizjologicznym zakresie pH i temperatury oraz – co najważniejsze – uwzględniają metabolizm oraz transport komórkowy. W artykule opisano metody oznaczania aktywności przeciwutleniającej w systemach komórkowych z wykorzystaniem zjawisk luminescencji lub fluorescencji.

Wykaz skrótów:

AAPH/ABAP – dihydrochlorek 2,2’-azobis(amidopropanu) (2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride); ABTS – sól diamonowa 2,2’-azobis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonianu) (2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) diammonium salt); AIPH – dihydrochlorek 2,2’-azobis[2-(2-imidazol-2-yl)propanu] (2,2’-azobis-[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride); AMVN – 2,2’-azobis(2,4-dimetylowaleronitryl) (2,2’-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)); APF – kwas 2-[6-(4V-amino)-fenoksy-3H-ksanten-3-on-9-yl]benzoesowy (2-[6-(4’-amino) phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid); CAA test– test mierzący komórkową aktywność przeciwutleniającą (cellular antioxidant activity assay); CBA – metoda odbarwienia krocyny (crocin bleaching assay); CUPRAC – metoda oznaczania zdolności do redukowania jonów miedzi (II) (cupric ion reducing antioxidant capacity); CV – cykliczna woltametria (cyclic voltammetry); DCF – 2,7-dichlorofluoresceina (2,7-dichlorofluorescein); DCFH – 2,7-dichlorodihydrofluorescyna (2,7-dichlorodihydrofluorescein); DCFH-DA – dioctan 2’,7’- dichlorodihydrofluorescyny (2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate); DHE – dihydroetydyna (dihydroethidium); DHR – dihydrorodamina (dihydrorhodamine); DMSO – dimetylosulfotlenek (dimethyl sulfoxide); DNA – kwas deoksyrybonukleinowy (deoxyrybonucleic acid); DPMD – dichlorowodorek dimetylo-p-fenylenodiaminy; DPPH – 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl (2,2’-diphenylo-1-picrylhydrazyl); DPPP – difenylo-1-pyrenylofosfina (diphenyl-1-pyrenylphosphine); DPV – woltametria pulsowa różnicowa (differential pulse voltammetry); FCR – odczynnik Folin-Ciocalteu (Folin-Ciocalteu reagent); FRAP – metoda oznaczania zdolności redukowania jonów żelaza (III) (ferric ion reducing antioxidant parameter); HPF – kwas 2-[6-(4V-hydroksy) fenoksy-3H- -ksanten-3-on-9-yl] benzoesowy (2-[6-(4’-hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid); LDL – lipoproteina o niskiej gęstości (low density lipoprotein); LPIC – metoda oznaczania inhibicji utlenienia frakcji LDL (lipid peroxidation capacity); mtDNA – mitochondrialny DNA (mitochondrial DNA); NADH – dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (nicotinamide adenine dinucleotide); ORAC – metoda oznaczania zdolności absorpcji rodników tlenowych (oxygen radical absorbance capacity); RFA – reaktywne formy azotu (RNS – reactive nitrogen species); RFT – reaktywne formy tlenu (ROS – reactive oxygen species); TOSC – metoda oznaczania całkowitej zdolności wychwytywania rodników tlenowych (total oxidant scavenging capacity); TPTZ – 2,4,6-tripirydylo-S-tiazyna (2,4,6-tripyridyl-S-triazine); TRAP – metoda oznaczania całkowitej zdolności zmiatania wolnych rodników (total redox antioxidant parameter); UV – promieniowanie ultrafioletowe (ultra-violet).

Homeostaza redoksowa

Reaktywne formy tlenu (RFT) są chemicznie aktywnymi cząsteczkami powstającymi przeważnie w enzymatycznych lub nieenzymatycznych reakcjach metabolizmu komórkowego. Do reakcji enzymatycznych należą zaangażowane przede wszystkim w łańcuch oddechowy, fagocytozę, syntezę prostaglandyn i układ cytochromu P-450. RFT mogą być również generowane w wyniku nieenzymatycznych reakcji tlenu ze związkami organicznymi oraz w odpowiedzi na niekorzystne dla komórek czynniki środowiskowe, takie jak promieniowanie jonizujące lub nadfioletowe, czy też toksyczne związki chemiczne [27]. Informacje o rodzajach RFT i ich klasyfikację przedstawiono na ryc. 1.

Ryc. 1. Klasyfikacja i rodzaje reaktywnych form tlenu [2]

Rola RFT oraz reaktywnych form azotu (RFA) jest przedmiotem obszernych badań dotyczących tzw. stresu oksydacyjnego, jak i udziału w komórkowych szlakach sygnalizacyjnych. Do niedawna uważano, że RFT mają tylko szkodliwy wpływ na ludzki organizm, a skutki ich działania w komórkach wiązano głównie ze stanami patologicznymi. Koncentrowano się na udziale RFT w etiologii wielu chorób przewlekłych, określanych często mianem chorób cywilizacyjnych. Obecnie zwraca się uwagę na „drugą twarz” RFT, czyli na ich funkcje fizjologiczne, takie jak udział w zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych szlakach sygnalizacyjnych zaangażowanych w procesy proliferacji, różnicowania i apoptozy komórek [35,54,58]. Stwierdzono również, że RFT nie zagrażają prawidłowemu funkcjonowaniu komórek dopóki jest utrzymywana w nich tzw. homeostaza redoksowa, czyli stan równowagi między ilością RFT a stężeniem substancji przeciwutleniających. W warunkach fizjologicznych poziom RFT jest kontrolowany przez antyoksydacyjny system obronny organizmu. Dopiero nadmiar RFT, które nie zostały zneutralizowane w komórkach może wywołać stan stresu oksydacyjnego, w wyniku którego może dochodzić do uszkodzeń oksydacyjnych wielu cząsteczek, w tym lipidów, białek i kwasów nukleinowych [34,40,42].

Uważa się, że zagrożeniom tym zapobiega nie tylko wspomniany antyoksydacyjny system obronny organizmu, ale także substancje przeciwutleniające spożywane z pokarmami, szczególnie pochodzenia roślinnego. Przeciwutleniacze można zdefiniować jako substancje redukujące i/lub antyrodnikowe, które przeciwdziałają powstawaniu w komórkach zniszczeń spowodowanych działaniem RFT. Definicja dotyczy niskocząsteczkowych związków chemicznych o wysokim potencjale redukcyjnym. Jednak również makrocząsteczki mogą przeciwdziałać szkodliwym skutkom utleniania, takie jak enzymy, czy pewne struktury komórkowe. Są również określane mianem antyoksydantów, pojęcie to zaczerpnięte z języka angielskiego odnosi się do wszystkich cząsteczek zdolnych do wychwytu i/lub redukcji prooksydantów. Wyróżnia się 5 mechanizmów działania antyoksydantów:
• antyoksydanty tworzące fizyczną barierę przeciwdziałającą powstawaniu RFT i ich wnikaniu do ważnych struktur biologicznych, np. substancje redoks aktywne w błonie komórkowej czy filtry UV,
• pułapki chemiczne absorbujące energię bądź wiążące elektrony pochodzące z RFT, czyli związki najbardziej kojarzące się z podaną definicją przeciwutleniaczy, do których należą np. karotenoidy czy antocyjany,
• systemy katalityczne odpowiedzialne za neutralizację RFT, np. enzymy antyoksydacyjne, takie jak dysmutaza ponadtlenkowa, peroksydaza glutationowa czy katalaza,
• antyoksydanty zdolne do chelatowania jonów metali i w wyniku tego zapobiegające powstawaniu RFT, np. katechiny,
• antyoksydanty przerywające łańcuch reakcji utleniania przez wyłapywanie RFT, np. kwas askorbinowy czy tokoferole [21].

Zrozumienie roli zaburzonej homeostazy redoksowej w patogenezie nieinfekcyjnych chorób przewlekłych, takich jak miażdżyca, nadciśnienie, cukrzyca, choroby neurodegeneracyjne, czy nawet nowotwory, zwróciło uwagę naukowców na znaczenie przeciwutleniaczy w przeciwdziałaniu i/lub spowalnianiu rozwoju oraz wspomaganiu leczenia tych chorób. Biomarkerami stresu oksydacyjnego in vivo są zazwyczaj produkty utleniania lipidów, produkty oksydatywnej modyfikacji białek i cukrów, pęknięcia nici DNA oraz produkty utlenienia zasad azotowych, jak również utlenienia endogennych przeciwutleniaczy. Wykorzystanie próbek ludzkich potwierdziło wpływ przeciwutleniaczy oraz diety w nie bogatej na obniżenie poziomu biomarkerów stresu oksydacyjnego w ludzkim organizmie [14]. Wpływ był bardziej widoczny, gdy obiektem badań były osoby narażone na podwyższony poziom stresu oksydacyjnego, np. cierpiące na nadciśnienie, niż gdy badano osoby zdrowe [21]. Przeciwutleniacze dostarczane z pożywieniem zaczęto zalecać w profilaktyce wspomnianych chorób przewlekłych, jako wsparcie naturalnego antyoksydacyjnego systemu obronnego przed uszkodzeniami wywołanymi stresem oksydacyjnym. Na przykład większość leków stosowanych w chemioterapii przeciwnowotworowej charakteryzuje się działaniem toksycznym na mięsień sercowy. Sugeruje się, że odpowiada za to stres oksydacyjny stymulowany w kardiomiocytach pod wpływem przyjmowanych leków. Dieta wzbogacona w fitozwiązki o aktywności przeciwutleniającej, podobnie jak syntetyczne związki antyoksydacyjne, może ograniczać niepożądane działania chemioterapii, takie jak kardiotoksyczność, jednocześnie nie obniżając terapeutycznej skuteczności leku [32].

Trzeba jednak podkreślić, iż w chorobach przewlekłych terapia z użyciem fitozwiązków nie może być podstawą leczenia, a jedynie wspomagać terapię środkami farmaceutycznymi. Natomiast w chorobach infekcyjnych, takich jak np. grypa, przeziębienie czy stany zapalne, preparaty lecznicze na bazie naturalnych ekstraktów o dużej zawartości przeciwutleniaczy mogą jednak być podstawą terapii i cieszą się rosnącą popularnością wśród pacjentów.

Chemiczne metody oznaczania właściwości przeciwutleniających

Aktywność przeciwutleniająca różnych substancji pochodzenia naturalnego, m.in. preparatów ziołowych czy składników żywności, była oznaczana w niezliczonej liczbie eksperymentów z użyciem wielu metod i w różnych warunkach. Niestety, często brakuje korelacji między wynikami uzyskanymi dla tego samego materiału z użyciem różnych metod, a nawet między wynikami uzyskanymi dla tego samego materiału i tą samą metodą w różnych laboratoriach badawczych [30]. Chemiczne metody oznaczania zdolności przeciwutleniającej są oparte na pomiarze wpływu przeciwutleniaczy na szybkość procesów utlenienia zachodzących w próbce (ORAC i TRAP), redukcji jonów metali, np. żelaza (FRAP), czy miedzi (CUPRAC), zdolności wyłapywania syntetycznego rodnika (ABTS, DPPH) lub też pomiarze ilości produktów utlenienia lipidów lub frakcji LDL [17]. Informacje o klasyfikacji chemicznych metod i mechanizmach wykorzystywanych do oznaczania właściwości przeciwutleniających zestawiono na rycinie 2.

Ryc. 2. Klasyfikacja klasycznych metod in vitro oznaczania właściwości przeciwutleniających

Ze względu na wspomnianą wcześniej dużą różnorodność RFT i mechanizmów ich działania (ryc. 1) żadnej z powyższych metod oznaczania aktywności przeciwutleniającej nie można uznać za uniwersalną. Co najważniejsze, mimo powszechnego stosowania testów chemicznych możliwość przewidywania na ich podstawie aktywności przeciwutleniającej w warunkach in vivo jest kwestionowana z kilku powodów. Testy chemiczne, jak już wspomniano, są wykonywane w niefizjologicznym zakresie pH i temperatury, ponadto żaden z nich nie uwzględnia wpływu biodostępności, dawki, ani przemian metabolicznych badanego przeciwutleniacza w żywej komórce.

Zalety prowadzenia oznaczania aktywności przeciwutleniającej w układach komórkowych

Ograniczenia w interpretacji wyników uzyskanych metodami chemicznymi do oznaczania aktywności przeciwutleniającej sprawiły, że rozpoczęto poszukiwania metod, które zapewnią możliwość uzyskania wyników lepiej odzwierciedlających los przeciwutleniaczy w komórkach i żywych organizmach. Jedną z pierwszych metod zaproponowanych do oceny wpływu przeciwutleniaczy na poziom stresu oksydacyjnego w komórkach był tzw. test kometowy (elektroforeza pojedynczych komórek w żelu agarozowym). Test służący do wykrywania fragmentacji jądrowego DNA, po odpowiednich modyfikacjach pozwala wykazać ochronne działania przeciwutleniaczy. W tym przypadku w komórkach traktowanych czynnikiem wywołującym stres oksydacyjny, co może spowodować indukcję uszkodzeń nici DNA, obserwuje się zmniejszenie fragmentacji (ogona komety) w obecności substancji przeciwutleniającej [22,34]. Przeprowadzenie badań z użyciem testu kometowego umożliwia uzyskanie wyników, które mogą być źródłem informacji czy dana substancja jest zdolna do przeciwdziałania genotoksycznym uszkodzeniom wywołanym przez RFT. Uzyskane wyniki nie mogą być jednak podstawą do ilościowej oceny aktywności przeciwutleniającej różnych próbek czy też jednoznacznego stwierdzenia czy ochronne działanie wynikało z neutralizacji prooksydantów, czy też np. z indukcji naprawy DNA [22]. Bezpośrednimi metodami umożliwiającymi ocenę aktywności przeciwutleniającej w warunkach komórkowych są metody, w których zastosowane zostało zjawisko chemiluminescenji i fluorescencji i to one będą tematem dalszych rozważań.

Informacje, które można traktować jako porównanie głównych cech metod chemicznych i biologicznych stosowanych w oznaczeniach aktywności przeciwutleniającej zestawiono w tabeli 1. Na aktywność przeciwutleniającą w układach biologicznych wpływa wiele czynników, które muszą być uwzględniane podczas prowadzenia oznaczeń, jednym z głównych jest biodostępność. Aby spełnić swoją rolę przeciwutleniacze muszą zostać zaabsorbowane, przetransportowane do komórek czy tkanek i zakotwiczone w błonach biologicznych lub rozpuszczone w płynach ustrojowych. Dlatego też biodostępność oraz dawkę aktywną wyznacza się w wyniku analizy płynów ustrojowych (np. krew, mocz, ślina) i tkanek ludzkich bądź zwierzęcych po spożyciu przeciwutleniaczy, oznaczając zarówno stężenia natywnych substancji, jak również produktów ich metabolizmu. W niektórych przeciwutleniaczach obserwuje się znaczące różnice aktywności antyoksydacyjnej w przypadku jej oznaczania w warunkach bezkomórkowych i in vivo.

Tabela 1. Porównanie stosowanych do oceny aktywności przeciwutleniającej metod chemicznych i metod umożliwiających pomiar w systemach komórkowych [17]

Odpowiednio użyte układy komórkowe stosowane w badaniach mechanizmów stresu oksydacyjnego oraz ochronnego działania przeciwutleniaczy mogą być alternatywą dla badań klinicznych. Zaletami stosowania kultur komórkowych są możliwości porównania różnych linii komórkowych i różnych czynników stresogennych do oceny efektywności działania przeciwutleniaczy, jak również to, iż kultur komórkowych nie dotyczą ograniczenia (m.in. nie jest potrzebna zgoda komisji bioetycznych na prowadzenie badań), jakie należy brać pod uwagę prowadząc badania z udziałem ludzi. Zastosowanie modeli komórkowych pozwala również na szybką i stosunkowo niedrogą ocenę biodostępności, metabolizmu i bioaktywności przeciwutleniaczy. Do skutków działania przeciwutleniaczy monitorowanych w hodowli komórkowej zalicza się przede wszystkim zmniejszenie intensywności powstawania RFT, zahamowanie szybkości procesu utleniania lipidów, białek i DNA, jak również spowolnienie śmierci komórkowej. Przeciwutleniacze są dodawane do hodowli komórkowej jednocześnie z czynnikiem stresogennym lub komórki są z nimi preinkubowane w celu wniknięcia przeciwutleniaczy do wnętrza komórki [21].

Najczęściej stosowane metody oznaczania poziomu RFT w układach biologicznych polegają na pomiarze chemiluminescencji lub fluorescencji produktów powstałych w wyniku reakcji RFT z sondami, które wskutek utlenienia nabywają zdolności emitowania promieniowania [9,10,12,33]. Może to służyć detekcji prooksydantów generowanych w komórce, gdzie wzrost promieniowania jest skorelowany ze stężeniem RFT. Natomiast po wprowadzeniu antyoksydanta, można ocenić jego skuteczność w neutralizacji RFT, co będzie się objawiało tłumieniem promieniowania.

Wykorzystanie chemiluminescencji w metodach pomiaru aktywności przeciwutleniającej

Termin „chemiluminescencja” jest stosowany do określenia procesu emisji światła, która towarzyszy niektórym reakcjom chemicznym. W przypadku RFT z jej pomocą można m.in. wykryć tlen singletowy powstający w układach biologicznych. Wykorzystywane jest w tym przypadku to, że powrotowi tlenu singletowego do trypletowego stanu podstawowego towarzyszy emisja kwantu promieniowania elektromagnetycznego o długości fali około 1270 nm. Poza tlenem singletowym żadna inna cząsteczka występująca w układach biologicznych nie emituje światła w jednym wąskim pasmie o tej długości fali, ale ponieważ przypada ono na zakres podczerwieni, jego wykrycie wymaga stosowania specjalnych detektorów [20]. Inne RFT mogą być wykrywane metodami chemiluminescencyjnymi wyłącznie w wyniku reakcji z substancjami, których utlenione formy mają zdolność luminescencji. Także luminescencja emitowana przez tlen singletowy obecny w próbce jest zbyt niska, aby mogła być podstawą metody pomiaru. Istnieje jednak możliwość wzmocnienia (w przypadku obecności tlenu singletowego w roztworze) lub wywołania chemiluminescencji (w przypadku RFT innych niż tlen singletowy) przez przeprowadzenie pomiarów w roztworze związku – luminoforu, który po reakcji z RFT charakteryzuje się dużą wydajnością emisji światła. Po zastosowaniu luminoforów natężenie promieniowania może być mierzone za pomocą spektrofluorymetru zaopatrzonego w światłoszczelną przystawkę do  pomiaru luminescencji lub licznika scyntylacyjnego. Typowymi związkami o dużej wydajności emisji światła używanymi w tym badaniu są luminol i lucygenina (tabela 2).

Tabela 2. Luminofory stosowane jako źródła chemiluminescencji

Luminol ulega wzbudzeniu w  mieszaninach reakcyjnych, w których są generowane różne rodzaje RFT. Przy czym najpierw trzeba przeprowadzić luminol do postaci rodnikowej, która następnie może przereagować z substratem. Wykorzystanie luminolu do wykrywania O₂^•- – ważnego biologicznie rodnika – jest natomiast problematyczne, bo mogą reagować bezpośrednio. Co więcej rodnikowa postać luminolu może redukować O₂ do O₂ ^•-, co powoduje zafałszowanie wyników pomiarów [15]. Aby przezwyciężyć te trudności zsyntetyzowano analog luminolu – związek L-012 – wykazujący większą czułość od związku wyjściowego w stosunku do O₂ ^•- oraz ONOO^– .

Lucygenina jest uważana za bardziej swoisty luminofor od luminolu w detekcji O₂^•-. Jednak również ona nie reaguje z tym anionorodnikiem bezpośrednio. Musi najpierw zostać zredukowana do kationorodnika lucygeniny, który następnie reaguje z O₂^•- dając luminescencyjny produkt [15].

Luminol i lucygenina są obecnie wykorzystywane głównie do śledzenia komórkowych procesów generujących RFT. Oba wymienione luminofory mogą być także wykorzystane do oceny aktywności przeciwutleniającej badanych próbek. Przeciwdziałając procesom prooksydacyjnym lub neutralizując RFT, przeciwutleniacze będą miały wpływ na obniżenie chemiluminescencji badanej próbki. Oznaczony stopień tłumienia natężenia chemiluminescencji w stosunku do próbki kontrolnej bez przeciwutleniacza będzie miarą jego aktywności antyoksydacyjnej.

Zjawisko chemiluminescencji do wykrywania RFT, jak również oznaczania aktywności przeciwutleniającej próbek wykorzystała firma Promega, która w 2015 r. wypuściła na rynek nowy test (ROS-Glo^TM) służący do wykrywania RFT z użyciem luminoforu, który pod wpływem H₂ O₂ obecnego w próbce przekształca się do prekursora lucyferyny. Lucyferyna reaguje z odczynnikiem lucyferyny ROS-Glo (zawierającym m.in. lucyferazę). Bierze udział w przekształcaniu prekursora lucyferyny do jej aktywnej luminescencyjnej postaci i emitowany jest sygnał świetlny proporcjonalny do stężenia H₂ O₂ . Jest to oczywiście słuszne przy założeniu, że większość RFT pod wpływem enzymów znajdujących się w komórkach (np. dysmutazy ponadtlenkowej) jest przekształcana do H₂ O₂ , który ze względu na stosunkowo długi okres półtrwania jest dobrym markerem stresu oksydacyjnego. W związku z tym spadek stężenia H₂ O₂ w komórkach, a co za tym idzie spadek luminescencji po dodaniu do próbki związku o potencjalnym charakterze przeciwutleniającym, świadczy o jego aktywności antyoksydacyjnej. Dodatkową zaletą tego testu jest to, iż może być stosowany zarówno w systemach bezkomórkowych, jak i komórkowych umożliwiając porównania aktywności antyoksydacyjnej danej substancji in vivo i in vitro.

Wykorzystanie zjawiska fluorescencji w metodach pomiaru aktywności przeciwutleniającej

Kontrolowane źródła RFT

Niski poziom naturalnie występujących RFT uniemożliwia dokładny pomiar aktywności przeciwutleniającej. Dlatego aby ocenić zdolność przeciwutleniaczy do zmiatania wolnych rodników w systemach komórkowych in vitro stosuje się kontrolowane źródła tych reaktywnych cząsteczek. Powinny się charakteryzować stałą szybkością tworzenia, znanym okresem półtrwania oraz swoistym umiejscowieniu w obrębie komórki [2]. Takimi inicjatorami wolnych rodników mogą być związki azowe, które z powodzeniem są stosowane w wielu badaniach prowadzonych zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo ze względu na łatwość kontrolowania wymienionych parametrów. Najczęściej wykorzystywanym źródłem wolnych rodników w środowisku hydrofilowym jest dihydrochlorek 2,2’-azobis(amidynopropanu), określany skrótem AAPH lub ABAP, natomiast w środowisku lipofilowym 2,2’-azobis(2,4-dimetylowaleronitryl) – AMVN. AAPH ulega homolitycznemu rozpadowi pod wpływem temperatury do azotu cząsteczkowego i dwóch rodników amidynopropanowych (ryc. 3), które reagując z tlenem przekształcają się w rodniki nadtlenkowe [51].

Ryc. 3. Termiczny rozkład AAPH

Okres półtrwania AAPH jest stosunkowo długi w porównaniu do innych kontrolowanych źródeł RFT (tabela 3), dzięki czemu szybkość tworzenia wolnych rodników w ciągu pierwszych kilku godzin jest stała. AAPH znajduje również zastosowanie do oznaczania peroksydacji lipidów w zawiesinach wolnych kwasów tłuszczowych. AMVN natomiast jest stosowany jako źródło rodników w badaniach nad peroksydacją miceli lipidowych lub błon komórkowych. Pomiar hamowania tych procesów oksydacyjnych przez potencjalne przeciwutleniacze może być miarą ich skuteczności redukcyjnej.

Tabela 3. Najczęściej stosowane kontrolowane źródła RFT

Inna pochodna azowa, mianowicie dihydrochlorek 2,2’-azobis[2-(2-imidazol-2-yl)propanu] – AIPH, generuje dwa razy więcej wolnych rodników niż AAPH w tych samych warunkach (tabela 3). Stwierdzono, że AIPH można stosować w badaniach utleniania miceli, frakcji LDL cholesterolu, osocza oraz hodowli komórkowej in vitro, a zatem również potencjalnie w ocenie aktywności antyoksydacyjnej substancji [55].

Różnorodność dostępnych eksperymentalnych źródeł RFT umożliwia wybór takiego związku, który najlepiej odpowiada potrzebom przeprowadzanej procedury badawczej.

Zastosowanie sond fluorescencyjnych do oznaczania aktywności przeciwutleniającej

Akumulacja RFT wewnątrz komórek oraz zdolność przeciwutleniaczy do ich neutralizacji może być mierzona z użyciem sond fluorescencyjnych. Najnowszą i najlepiej dopracowaną metodą określania aktywności przeciwutleniającej związków bioaktywnych w hodowli komórkowej jest test CAA (Cellular Antioxidant Activity), którego autorami są Wolf i wsp. [52]. Test powstał w celu zastąpienia chemicznych metod oznaczania aktywności antyoksydacyjnej, na podstawie których, jak wykazało doświadczenie, na ogół nie można przewidzieć skutku działania związków przeciwutleniających w warunkach in vivo. Badania z wykorzystaniem testu CAA są prowadzone w układach komórkowych, czyli w fizjologicznym zakresie pH i temperatury. Dodatkowo uwzględniono w nim biodostępność, dystrybucję oraz metabolizm przeciwutleniaczy w obrębie komórki, zatem w dużym stopniu odzwierciedla zachowanie badanych związków w warunkach in vivo [3,8,48,52].

W teście CAA jako marker stresu oksydacyjnego wykorzystuje się niepolarną sondę dioctan 2’,7’-dichlodihydrorofluorescyny (DCFH-DA). Sonda DCFH-DA w wyniku dyfuzji biernej wnika do wnętrza komórki ulegając w wyniku działania esteraz błonowych deacetylacji do bardziej polarnej postaci 2’,7’-dichlorodihydrofluorescyny (DCFH). DCFH zostaje następnie uwięziona wewnątrz komórki i jeśli są obecne w otoczeniu RFT natychmiast jest przez nie utleniana do 2’,7’-dichlorofluoresceiny (DCF) wykazującej właściwości fluorescencyjne (ryc. 4).

Ryc. 4. Schemat przemian 2’,7’-dichlorofluorescyny zachodzących w komórkach podczas testu CAA na podstawie [52]; AOx – przeciwutleniacz, DCFH-DA – dioctan 2’,7’-dichlorofluorescyny, DCFH – 2’,7’-dichlorofluorescyna, DCF – dichlorofluoresceina, ABAP – dichlorowodorek 2,2’-azobis(2-amidynopropanu), RFT – reaktywne formy tlenu, ROO• – rodnik nadtlenkowy

W pomiarach aktywności antyoksydacyjnej w komórkach celowo, w sposób kontrolowany jest stymulowany stres oksydacyjny. Syntetycznym źródłem RFT stosowanym w teście CAA jest opisywany wcześniej dichlorowodorek 2,2’-azobis(2-amidynopropanu) (ABAP), który po wniknięciu do komórki ulega samorzutnemu rozpadowi z wytworzeniem RFT. Powstałe nadtlenki atakują lipidy błonowe, co indukuje peroksydację lipidów i powstanie jeszcze większej ilości RFT. Poziom fluorescencji DCF jest proporcjonalny do poziomu indukowanych przez ABAP utleniaczy, które utleniły sondę DCFH do jej fluorescencyjnej postaci DCF [48,52]. Przeciwutleniacze czy zawierające je ekstrakty roślinne oraz inne związki o charakterze przeciwutleniaczy chronią DCFH, a często także lipidy błonowe, przed utlenieniem przez co zmniejszają fluorescencję traktowanych ABAP hodowli komórkowych w porównaniu z próbkami kontrolnymi [46,48,52].

Monitorowanie kinetyki neutralizacji RFT przez związki o charakterze przeciwutleniaczy prowadzi się przez pomiar zmian fluorescencji stosując wzbudzenie przy długości fali λ=485 nm i śledzenie emisji przy λ=538 nm w stałej temperaturze 37°C przez 1 godzinę w odstępach 5-minutowych dla kilku stężeń przeciwutleniacza. Uzyskane w ten sposób wyniki przedstawia się na wykresie kinetyki zmian fluorescencji [RFU] = f (czas pomiaru [min]) i na ich podstawie wyznacza krzywą inhibicji utleniania sondy fluorescencyjnej DCFH w funkcji stężenia próbki. W tym celu oblicza się pola powierzchni pod wykresami krzywych i na ich podstawie dla poszczególnych stężeń wyznacza wartość tzw. jednostek CAA z poniższego wzoru [52].

Jednostka CAA,

Jako substancja odniesienia, której stężenie jest jednocześnie miarą jednostek CAA, jest stosowana kwercetyna, ponieważ w czasie badań z wykorzystaniem testu CAA stwierdzono dużą zdolność tego związku do neutralizacji RFT w porównaniu z innymi popularnymi przeciwutleniaczami. Uzyskane wyniki są wyrażane w mikromolach równoważników kwercetyny na 100 μmoli badanej substancji albo w mikromolach równoważników kwercetyny na 100 g świeżych owoców (lub suchej masy) czy innej próbki zawierającej składniki wykazujące właściwości przeciwutleniające [52].

Mimo wielu zalet sondy DCFH-DA, ma ona również pewne ograniczenia. Przede wszystkim w przypadku testów komórkowych z jej użyciem nie powinno się stosować pożywek zawierających surowicę, gdyż mogą się w niej znajdować endogenne esterazy powodujące deestryfikację DCFH-DA do DCFH, która jak już wspomniano nie może migrować przez błony komórkowe, przez co zdolność wnikania sondy do wnętrza komórki zostaje osłabiona [1,15]. Pojawiły się również doniesienia wskazujące, że po hydrolizie przez wewnątrzkomórkowe esterazy, utleniony produkt, tzn. DCF, może się wydostać z niektórych typów komórek [18].

Należy też wspomnieć, że DCFH-DA nie może służyć jako selektywny wskaźnik tworzenia określonych RFT czy RFA w komórkach [1,11], choć w literaturze często spotyka się błędne stwierdzenie, że system DCFH/DCF może zostać użyty do selektywnego monitorowania wewnątrzkomórkowego poziomu H₂ O₂ . W rzeczywistości sonda nie reaguje z nim bezpośrednio. Fluorescencja emitowana przez sondę może wynikać z jej utleniania przez H₂ O₂ , który powstaje w wyniku reakcji katalizowanej przez jony metali (reakcja Fentona) oraz peroksydazy (np. hemową). Jednak DCFH reaguje także z OH^• , nadtlenkami organicznymi, NO₂ , CO₃ ^•- HOCl i RFT powstałymi z rozkładu nadtlenoazotynu (ONOO^– / ONOOH) [6,11,19,29,43].

Test CAA jest jedynym komercyjnie dostępnym testem, który można wykorzystać do badania aktywności przeciwutleniającej w systemach komórkowych z zastosowaniem sond fluorescencyjnych, jednak pomiar aktywności antyoksydacyjnej w układzie komórkowym może teoretycznie być przeprowadzany również z zastosowaniem innych sond fluorescencyjnych (tabela 4) w połączeniu z różnymi kontrolowanymi źródłami RFT. Odpowiedni dobór obu reagentów może pozwalać na oznaczanie wpływu danego przeciwutleniacza na poziom swoistych RFT [2,23].

Tabela 4. Sondy fluorescencyjne stosowane do wykrywania RFT w systemach komórkowych

Tabela 4. cd

*pełne nazwy chemiczne w tekście

Wśród sond fluorescencyjnych (tabela 4), które potencjalnie mogłyby zostać wykorzystane w badaniach aktywności przeciwutleniającej na szczególną uwagę – ze względu na dużą selektywność w stosunku do rodnika OH^• – zasługują pochodne fluoresceiny – HPF (kwas 2-[6-(4V-hydroksy)fenoksy-3H-ksanten-3-on-9-yl] benzoesowy) oraz APF (kwas 2-[6-(4V-amino)-fenoksy- -3H-ksanten-3-on-9-yl] benzoesowy). Setsukinai i wsp. [41] badali reaktywność tych dwóch sond w stosunku do różnych RFT i RFA. Obie sondy okazały się zdolne do detekcji OH^• powstającego w wyniku reakcji Fentona. W wyniku O-dearylacji APF i HPF indukowanej OH^• powstają pochodne charakteryzujące się silną fluorescencją przy długości fali 520 nm (tabela 4) [41]. Zauważono jednak, że obecność DMSO w układzie reakcyjnym ma wpływ na spowolnienie wzrostu fluorescencji. Sonda APF okazuje się reaktywna w stosunku do HOCl, w przeciwieństwie do HPF. W obu przypadkach odnotowano wzrost fluorescencji także pod wpływem ONOO^– [41].

Amplex Red (N-acetylo-3,7-dihydroksyfenoksazyna) jest inną komercyjnie dostępną sondą fluorescencyjną, która w obecności peroksydazy chrzanowej jest utleniana przez H₂ O₂ do fluorescencyjnej rezorufiny charakteryzującej się wzbudzeniem przy długości fali 563 nm oraz emisją fluorescencji przy 587 nm [36]. Sonda nie jest jednak swoista wyłącznie wobec H₂ O₂ , gdyż można ją również stosować do wykrywania O₂^•- w obecności dysmutazy ponadtlenkowej, która katalizuje reakcję dysproporcjonowania anionorodnika ponadtlenkowego, w wyniku której powstaje H₂ O₂ [44,57]. Zaletą Amplex Red jest mała fluorescencja tła, a także stabilność i silna fluorescencja produktu utleniania sondy. Jednak rezorufina per se jest substratem dla peroksydazy chrzanowej i w wyniku dalszego utleniania powstaje resazuryna, która nie wykazuje zdolności do fluorescencji, co może spowodować znaczny spadek intensywności fluorescencji [45].

Inną sondą fluorescencyjną, która może służyć do wykrywania RFT, jak również do oznaczania aktywności przeciwutleniającej próbek, jest dihydroetydyna (DHE). Ze względu na zdolność do swobodnego przenikania przez błony komórkowe, sonda ta jest często wykorzystywana do  monitorowania wytwarzania O₂^•- i jest użyteczna podczas badania wybuchu oddechowego w komórkach (tabela 4) [4,26,37]. Uważano, że DHE w reakcji z O₂^•- tworzy czerwony fluorescencyjny produkt (etydynę), która interkaluje do DNA [6,39]. Jednak późniejsze badania zasugerowały, że produktem tej reakcji jest rzeczywiście 2-hydroksyetydyna [56]. DHE jest uważana za najbardziej swoisty i użyteczny barwnik, bo jest dobrze tolerowaną przez komórki i może nawet wytrzymać łagodne utrwalenie stosowane przy przygotowywaniu preparatów mikroskopowych [5,38]. Istnieją jednak pewne ograniczenia w zakresie korzystania z DHE podczas wykrywania lub ilościowego oznaczania O₂^•-. Jednym z problemów jest utlenianie DHE przez cytochrom c. Aspekt ten jest ważny, gdy jednym ze źró- deł O2 •- jest mitochondrium oraz gdy cytochrom c zostaje uwolniony do cytosolu podczas apoptozy komórki. Gdy stan stresu oksydacyjnego i procesy apoptozy nakładają się, nie jest możliwe ilościowe oznaczenie O2 •- na podstawie pomiaru ilości powstającej utlenionej postaci DHE (E+). Zastosowanie wysokich stężeń sondy może doprowadzić do niezależnego od obecności O₂^•- wzrostu fluorescencji, który jest rezultatem tworzenia E+ w ilościach przekraczających dostępność miejsc interkalacji w DNA mitochondrialnym. Wówczas E+ może interkalować do DNA jądrowego, powodując tym samym znaczny wzrost fluorescencji. DHE może być również utleniona przez H₂ O₂ w reakcji katalizowanej przez nieswoiste peroksydazy, np. peroksydazę chrzanową lub mieloperoksydazę [13].

Dihydrorodamina (DHR) jest sondą o innej swoistości i może być używana do wykrywania OH^• , ONOO^– , NO₂^• , CO3 •- oraz HOCl, natomiast z O₂^•- i H₂ O₂ reaguje jedynie w obecności enzymatycznego katalizatora [47]. DHR jest utleniana do rodaminy 123, która charakteryzuje się silną fluorescencją przy długości fali 536 nm (tabela 4). Rodamina 123 ma charakter lipofilowy, zawiera ładunek dodatni i akumuluje się w mitochondriach [15,53].

C-11-BODIPY to inna szeroko stosowana sonda fluorescencyjna, która w wyniku utleniania zmienia zakres fluorescencji z czerwonego na zielony. Sonda reaguje z różnymi rodnikami np. OH^• , peroksylowym, alkoksylowym, ONOO^– , nie reaguje natomiast z O₂^•-, NO^• , H₂ O₂ , tlenem singletowym ani hydroksynadtlenkami. Dodana do komórek przedostaje się do wnętrza większości organelli bez wyraźnej swoistości [15].

Mimo omówionej wyżej różnorodności, wciąż pojawiają się nowe doniesienia dotyczące poszukiwań idealnej sondy fluorogennej do oznaczania stresu oksydacyjnego w komórkach. W 2014 r. opublikowano wyniki badań, których celem było opracowanie sondy fluorescencyjnej służącej do detekcji wyłącznie H₂ O₂ w komórkach [28,49]. Nadtlenek wodoru wytwarzany w komórce w sposób regulowany odgrywa rolę wewnątrzkomórkowego przekaźnika II rzędu, aktywując szlaki sygnalizacyjne i stymulując proliferację komórek oraz ich różnicowanie i migrację. Jednak w odróżnieniu od klasycznego przekaźnika II rzędu, jakim jest Ca²⁺,H₂ O₂ jest utleniaczem stąd też jego nadmierne wytwarzanie nie tylko zmienia procesy sygnalizacyjne, ale też zaburza homeostazę redoksową i w rezultacie doprowadza do stresu oksydacyjnego. Zatem badanie ochronnego wpływu przeciwutleniaczy w stosunku do H₂ O₂ w komórkach jest niezwykle ważne, jednak większość metod stosowanych do detekcji RFT nie jest swoista wyłącznie dla tej postaci.

W odpowiedzi na zapotrzebowanie na sondę selektywną wobec H₂ O₂ naukowcy z Uniwersytetu Fudan w Szanghaju zaprojektowali nowatorską radiometryczną sondę fluorescencyjną NP1, której struktura opiera się na szkielecie 1,8-naftalimidu oraz estru kwasu borowego jako sensora swoistego dla H₂ O₂ . Sonda zawiera również grupę azydkową, która pozwala na szybkie, efektywne i wydajne łączenie z cząsteczkami biologicznymi. Umożliwia to modyfikowanie swoistości sondy do ukierunkowanego wykrywania cząsteczek H₂ O₂ w określonych miejscach w komórce. Możliwość zastosowania sondy NP1 do detekcji H₂ O₂ w żywych komórkach i tkankach była przetestowana z zastosowaniem skaningowego laserowego mikroskopu konfokalnego.

Sonda pep-NP1 będąca modyfikacją sondy NP1, ma przy- łączony do grupy azydkowej peptyd sygnału lokalizacji jądrowej, umożliwiający jej selektywne wnikanie do jądra komórkowego i swoiste wiązanie się z jądrowym DNA. Komórki inkubowane z pep-NP1 wykazywały silną fluorescencję w kanale niebieskim (445 ± 20 nm) i słabą fluorescencję w kanale żółtym (575 ± 25 nm). W obecności H₂ O₂ następuje wzrost stosunku fluorescencji w kanale żółtym do fluorescencji w kanale niebieskim [49].

Bardziej podatne na atak RFT w komórce jest jednak nie DNA jądrowy, ale mitochondrialny (mtDNA). Skłoniło to naukowców do zaprojektowania innej modyfikacji sondy NP1, która polegała na wprowadzeniu do sondy NP1 peptydu (pep3) wiążącego DNA znakowanego dodatnio naładowanym fluoroforem styrylowym wykazującym czerwoną fluorescencję. Ten lipofilowy kation sprzyja akumulacji sondy pep3-NP1 w miochondrium. Gdy sonda zwiąże się z mtDNA, intensywność czerwonej fluorescencji fluoroforu jest znacznie większa od fluorescencji zielonej. W obecności H₂ O₂ natomiast następuje wzrost stosunku fluorescencji zielonej do czerwonej (tabela 4) [48,50].

Istnieje także kilka rodzajów sond służących do oznaczania peroksydacji lipidów błonowych i RFT wewnątrz błon komórkowych. Dobór odpowiedniej sondy oraz eksperymentalnego źródła RFT pozwala na oznaczenie zdolności badanych przeciwutleniaczy do przeciwdziałania peroksydacji lipidów. Jedną z bardziej znanych sond tego rodzaju jest kwas cis-parynarowy (cis-PnA), który w wyniku wiązania się z lipidami ulegającymi peroksydacji sam szybko ulega utlenieniu tracąc przy tym zdolność do fluorescencji (tabela 4). Kwas parynarowy musi być stosowany ze szczególną ostrożnością, ponieważ jest to kwas wielonienasycony i może łatwo ulegać nieswoistym reakcjom utleniania, w związku z czym należy go przechowywać w szczelnie zamkniętych pojemnikach bez dostępu światła, w atmosferze N₂ . Może być stosowany jako wolny kwas bądź związany ze swoistymi fosfolipidami.

Inną sondą pozwalającą wykrywać produkty peroksydacji lipidów jest difenylo-1-pyrenylofosfina (DPPP), która reaguje z produktami peroksydacji lipidów z wytworzeniem związku charakteryzującego się fluorescencją przy długości fali 380 nm (tabela 4). Sonda ta jest niezwykle wrażliwa na działanie światła i dlatego mogą występować problemy z powtarzalnością wyników [15]. Jednak zastosowanie DPPP do detekcji produktów peroksydacji lipidów ma również wiele zalet. Sonda reaguje z wodoronadtlenkami lipidów w stosunku stechiometrycznym, co umożliwia ich ilościowe oznaczenie. DPPP jest silnie lipofilowa i reaguje selektywnie z produktami peroksydacji lipidów wewnątrz błony komórkowej, natomiast w przeciwieństwie do sondy DCFH lub DHR nie reaguje z nadtlenkami w środowisku wodnym. Sonda DPPP jest odporna na kataboliczne i metaboliczne procesy zachodzące w komórkach, dlatego też jest fluoroforem z wyboru w monitorowaniu peroksydacji lipidów błonowych w żywych komórkach [31].

Pomiar fluorescencji

Istnieje kilka metod pomiaru fluorescencji: najprostszą jest wykorzystanie czytnika płytek wielodołkowych z możliwością pomiaru fluorescencji, a dane są przedstawiane jako spadek bądź wzrost fluorescencji w porównaniu z próbką kontrolną. Jednak jakość i czułość komercyjnie dostępnych czytników jest bardzo zróżnicowana, a potrzeba dokupienia specjalnych filtrów sprawia, iż pomiary te są często bardzo kosztowne. Nowsze modele nie wymagają filtrów, ponieważ stosuje się w nich podwójny monochromator, przez co mają zwiększony zakres działania. Ważne jest również, aby sprawdzić czy czytnik podaje pomiar fluorescencji z góry czy z dołu, ponieważ w przypadku tych pierwszych komórki muszą być zawieszone w roztworze, natomiast w drugim pomiar może być dokonywany w warunkach in situ bez konieczności odklejania komórek od podłoża, co może zwiększać w nich stres oksydacyjny. Ponadto czytniki płytek wielodołkowych mierzą całkowitą fluorescencję nie rozróżniając fluorescencji wewnątrzkomórkowej i fluorescencji tła, a to może być problemem w tego typu pomiarach [15].

Cytometria przepływowa rozwiązuje ten problem umożliwiając dokonywanie pomiaru wyłącznie fluorescencji wewnątrzkomórkowej. W wyniku zastosowania tej techniki otrzymuje się dane ilościowe mówiące o liczbie komórek emitujących fluorescencję, zamiast względnej fluorescencji całej próbki. Wadą metody jest to, iż komórki muszą być zawieszone w próbce, a więc wymagana jest ich trypsynizacja bądź zeskrobanie, co jak już wspomniano grozi stymulacją stresu oksydacyjnego i może doprowadzić do zafałszowania wyników testu [15].

Najnowszym rozwiązaniem jest mikroskopia konfokalna, w przypadku której komórki mogą być badane w czasie rzeczywistym in situ, w temperaturze 37°C. Umożliwia to lokalizację RFT wewnątrz komórki, a dzięki barwnikom, np. MitoTracker, pozwala na wizualizację udziału poszczególnych struktur komórkowych, np. mitochondriów w stresie oksydacyjnym bądź jego tłumieniem [15].

Podsumowanie

Obserwowany w ostatnich latach wzrost zainteresowania zarówno badaczy, jak i opinii publicznej reaktywnymi formami tlenu (RFT) jest bez wątpienia spowodowany dualistyczną naturą tych substancji. Z jednej strony RFT w warunkach homeostazy pełnią w organizmie funkcje mediatorów i regulatorów metabolizmu, jednak ich nadmierne wytwarzanie oraz wyczerpanie przez organizm naturalnych rezerw antyoksydacyjnych indukuje stres oksydacyjny, który jak się sugeruje leży u podłoża większości globalnie szerzących się i powszechnie znanych chorób cywilizacyjnych, takich jak miażdżyca, nadciśnienie, czy nawet nowotwory. Wraz ze zrozumieniem mechanizmów odpowiadających za powstawanie stresu oksydacyjnego zaczęto poszukiwać środków zaradczych – substancji redukujących i/lub antyrodnikowych, które mogłyby przeciwdziałać powstawaniu w komórkach zniszczeń spowodowanych działaniem RFT. Szczególną uwagę zwraca się na przeciwutleniacze dostarczane z pożywieniem, które wspierają naturalny antyoksydacyjny system obronny organizmu przed uszkodzeniami wywołanymi zaburzoną homeostazą redoksową, dzięki czemu mogą przeciwdziałać i/lub spowalniać rozwój oraz wspomagać leczenie wspomnianych chorób. Rosnące zagrożenie chorobami cywilizacyjnymi stymuluje poszukiwania lepszych metod oznaczania aktywności przeciwutleniającej w warunkach hodowli komórkowych, które poprawnie odzwierciedlałyby aktywność antyoksydacyjną in vivo. Stosowanie klasycznych metod chemicznych nie zapewnia uzyskania informacji na temat rzeczywistego działania przeciwutleniaczy w żywym organizmie. Biodostępność, dystrybucję i metabolizm substancji przeciwutleniających w  warunkach in vivo odzwierciedlać mogą natomiast testy przeprowadzane w warunkach hodowli komórkowych. Najczęściej stosowane metody oznaczania poziomu RFT oraz zdolności przeciwutleniaczy do ich neutralizacji w układach biologicznych polegają głównie na pomiarze chemiluminescencji lub fluorescencji produktów powstałych w wyniku reakcji RFT z sondami, które wskutek utlenienia nabywają zdolności emitowania promieniowania. Różnorodność dostępnych sond oraz kontrolnych źródeł RFT umożliwia wybór takiego układu, który jest najlepiej dostosowany do oceny aktywności przeciwutleniającej badanych substancji.

Przypisy

• 1. Aranda A., Sequedo L., Tolosa L., Quintas G., Burello E., Castell J.V., Gombau L.: Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: a quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle- -treated cells. Toxicol. In Vitro, 2013; 27: 954-963
  Google Scholar
• 2. Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009
  Google Scholar
• 3. Bender S., Grabiano S.: Evaluation of the antioxidant activity of foods in human cells. Integrated study of biologically active antioxidants from Camellia sinensis. Nutrafoods, 2015; 14: 79-85
  Google Scholar
• 4. Bindokas V.P., Jordán J., Lee C.C., Miller R.J.: Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci., 1996; 16: 1324-1336
  Google Scholar
• 5. Bucana C., Saiki I., Nayar R.: Uptake and accumulation of the vital dye hydroethidine in neoplastic cells. J. Histochem. Cytochem., 1986; 34: 1109-1115
  Google Scholar
• 6. Buettner G.R.: Moving free radical and redox biology ahead in the next decade(s). Free Rad. Biol. Med., 2015; 78: 236-238
  Google Scholar
• 7. Buettner G.R., Jurkiewicz B.A.: Ascorbate free radical as a marker of oxidative stress: an EPR study. Free Radic. Biol. Med., 1993; 14: 49-55
  Google Scholar
• 8. Chen X., Zou L.Q., Niu J., Liu W., Peng S.F., Liu C.M.: The stability, sustained release and cellular antioxidant activity of curcumin nanoliposomes. Molecules, 2015; 20: 14293-14311
  Google Scholar
• 9. Dmitriev R.I., Zhdanov A.V., Jasionek G., Papkovsky D.B.: Assessment of cellular oxygen gradients with a panel of phosphorescent oxygen- -sensitive probes. Anal. Chem., 2012; 84: 2930-2938
  Google Scholar
• 10. Esipova T.V., Karagodov A., Miller J., Wilson D.F., Busch T.M., Vinogradov S.A.: Two new «protected» oxyphors for biological oximetry: properties and application in tumor imaging. Anal. Chem., 2011: 83: 8756-8765
  Google Scholar
• 11. Forman H.J., Augusto O., Brigelius-Flohe R., Dennery P.A., Kalyanaraman B., Ischiropoulos H., Mann G.E., Radi R., Roberts L.J.2nd, Vina J., Davies K.J.: Even free radicals should follow some rules: a guide to free radical research terminology and methodology. Free Radic. Biol. Med., 2015; 78: 233-235
  Google Scholar
• 12. Freeman B.A., Crapo J.D.: Biology of disease: free radicals and tissue injury. Lab. Invest., 1982; 47: 412-426
  Google Scholar
• 13. Gomes A., Fernandes E., Lima J.L.: Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J. Biochem. Biophys. Methods, 2005; 65; 45-80
  Google Scholar
• 14. Gouda M., Moustafa A., Hussein L., Hamza M.: Three week dietary intervention using apricots, pomegranate juice or/and fermented sour sobya and impact on biomarkers of antioxidative activity, oxidative stress and erythrocytic glutathione transferase activity among adults. Nutr. J., 2016; 15: 52
  Google Scholar
• 15. Halliwell B., Whiteman M.: Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? Br. J. Pharmacol., 2004; 142: 231-255
  Google Scholar
• 16. Hernandez L., Grasa L., Fagundes D.S., Gonzalo S., Arruebo M.P., Plaza M.A., Murillo M.D.: Role of potassium channels in rabbit intestinal motility disorders induced by 2,2’-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). J. Physiol. Pharmacol., 2010; 61: 279-286
  Google Scholar
• 17. Honzel D., Carter S.G., Redman K.A., Schauss A.G., Endres J.R., Jensen G.S.: Comparison of chemical and cell-based antioxidant methods for evaluation of foods and natural products: generating multifaceted data by parallel testing using erythrocytes and polymorphonuclear cells. J. Agric. Food Chem., 2008; 56: 8319-8325
  Google Scholar
• 18. Jakubowski W., Bartosz G.: Estimation of oxidative stress in Saccharomyces cerevisae with fluorescent probes. Int. J. Biochem. Cell Biol., 1997; 29: 1297-1301
  Google Scholar
• 19. Kalyanaraman B., Darley-Usmar V., Davies K.J., Dennery P.A., Forman H.J., Grisham M.B., Mann G.E., Moore K., Roberts L.J.2nd, Ischiropoulos H.: Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic. Biol. Med., 2012; 52: 1-6
  Google Scholar
• 20. Kanofsky J.R.: Singlet oxygen production by lactoperoxidase. J. Biol. Chem., 1983; 258: 5991-5993
  Google Scholar
• 21. Karadag A., Ozcelik B., Saner S.: Review of methods to determine antioxidant capacities. Food Anal. Methods, 2009; 2: 41
  Google Scholar
• 22. Klaude M., Eriksson S., Nygren J., Ahnström G.: The comet assay: mechanisms and technical considerations. Mutat. Res., 1996; 363: 89-96
  Google Scholar
• 23. Komatsu H., Yoshihara K., Yamada H., Kimura Y., Son A., Nishimoto S., Tanabe K.: Ruthenium complexes with hydrophobic ligands that are key factors for the optical imaging of physiological hypoxia. Chemistry, 2013; 19: 1971-1977
  Google Scholar
• 24. Koshiishi I., Tsuchida K., Takajo T., Komatsu M.: Radical scavenger can scavenge lipid allyl radicals complexed with lipoxygenase at lower oxygen content. Biochem. J., 2006; 395: 303-309
  Google Scholar
• 25. Koshiishi I., Tsuchida K., Takajo T., Komatsu M.: Quantification of lipid alkyl radicals trapped with nitroxyl radical via HPLC with postcolumn thermal decomposition. J. Lipid Res., 2005; 46: 2506-2513
  Google Scholar
• 26. Li N., Ragheb K., Lawler G., Sturgis J., Rajwa B., Melendez J.A., Robinson J.P.: Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. J. Biol. Chem., 2003; 278: 8516-8525
  Google Scholar
• 27. Lobo V., Patil A., Phatak A., Chandra N.: Free radicals, antioxidants and functional foods: Impact on human health. Pharmacogn. Rev., 2010; 4: 118-126
  Google Scholar
• 28. Meng L., Wu Y., Yi T.: A ratiometric fluorescent probe for the detection of hydroxyl radicals in living cells. Chem. Commun., 2014; 50: 4843-4845
  Google Scholar
• 29. Mills E.M., Takeda K., Yu Z.X., Ferrans V., Katagiri Y., Jiang H., Lavigne M.C., Leto T.L., Guroff G.: Nerve growth factor treatment prevents the increase in superoxide produced by epidermal growth factor in PC12 cells. J. Biol. Chem., 1998; 273: 22165-22168
  Google Scholar
• 30. Niki E.: Assessment of antioxidant capacity in vitro and in vivo. Free Radic. Biol. Med., 2010; 49: 503-515
  Google Scholar
• 31. Okimoto Y., Watanabe A., Nikia E., Yamashita T., Noguchi N.: A novel fluorescent probe diphenyl-1-pyrenylphosphine to follow lipid peroxidation in cell membranes. FEBS Lett., 2000; 474: 137-140
  Google Scholar
• 32. Piasek A., Bartoszek A., Namieśnik J.: Substancje pochodzenia roślinnego przeciwdziałające kardiotoksyczności towarzyszącej chemioterapii nowotworów. Postępy Hig. Med. Dośw., 2009; 63: 142-158
  Google Scholar
• 33. Pryor W.A., Godber S.S.: Noninvasive measures of oxidative stress status in humans. Free Radic. Biol. Med., 1991; 10: 177-184
  Google Scholar
• 34. Rahman T., Hosen I., Islam M.M., Shekhar H.U.: Oxidative stress and human health. J. Adv. Biosci. Biotechnol., 2012; 3: 997-1019
  Google Scholar
• 35. Ray P.D, Huang B.W., Tsuji Y.: Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell. Signal., 2012; 24: 981-990
  Google Scholar
• 36. Reszka K.J., Wagner B.A., Burns C.P., Britigan B.E.: Effects of peroxidase substrates on the Amplex red/peroxidase assay: antioxidant properties of anthracyclines. Anal. Biochem., 2005; 342: 327-337
  Google Scholar
• 37. Rivera A., Maxwell S.A.: The p53-induced gene-6 (proline oxidase) mediates apoptosis through a calcineurin-dependent pathway. J. Biol. Chem., 2005; 280: 29346-29354
  Google Scholar
• 38. Robinson K.M., Janes M..S, Pehar M., Monette J.S., Ross M.F., Hagen T.M., Murphy M.P., Beckman J.S.: Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 15038-15043
  Google Scholar
• 39. Rothe G., Valet G.: Flow cytometric analysis of respiratory burst activity in phagocytes with hydroethidine and 2’,7’-dichlorofluorescin. J. Leukoc. Biol., 1990; 47: 440-448
  Google Scholar
• 40. Schieber M., Chandel N.S.: ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr. Biol., 2014; 24: R453-R462
  Google Scholar
• 41. Setsukinai K., Urano Y., Kakinuma K., Majima H.J., Nagano T.: Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J. Biol. Chem., 2003; 278: 3170-3175
  Google Scholar
• 42. Sies H.: Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biol., 2015; 4: 180-183
  Google Scholar
• 43. Sundaresan M., Yu Z.X., Ferrans V.J., Irani K., Finkel T.: Requirement for generation of H2 O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science, 1995; 270: 296-299
  Google Scholar
• 44. Towne V., Will M., Oswald B., Zhao Q.: Complexities in horseradish peroxidase-catalyzed oxidation of dihydroxyphenoxazine derivatives: appropriate ranges for pH values and hydrogen peroxide concentrations in quantitative analysis. Anal. Biochem., 2004; 334: 290-296
  Google Scholar
• 45. Votyakova T.V., Reynolds I.J.: Detection of hydrogen peroxide with Amplex Red: interference by NADH and reduced glutathione auto-oxidation. Arch. Biochem. Biophys., 2004; 431: 138-144
  Google Scholar
• 46. Wang L.F., Chen J.Y., Xie H.H., Ju X.R., Liu R.H.: Phytochemical profiles and antioxidant activity of Adlay varieties. J. Agric. Food Chem., 2013; 61: 5103-5113
  Google Scholar
• 47. Wardman P.: Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med., 2007; 43: 995-1022
  Google Scholar
• 48. Wen L., Guo X., Liu R.H., You L., Abbasi A.M., Fu X.: Phenolic contents and cellular antioxidant activity of Chinese hawthorn ‘‘Crataegus pinnatifida’’. Food Chem., 2015; 186: 54-62
  Google Scholar
• 49. Wen Y., Liu K., Yang H., Li Y., Lan H., Liu Y., Zhang X., Yi T.: A highly sensitive ratiometric fluorescent probe for the detection of cytoplasmic and nuclear hydrogen peroxide. Anal. Chem., 2014; 86: 9970-9976
  Google Scholar
• 50. Wen Y., Liu K., Yang H., Liu Y., Chen L., Liu Z., Huang C., Yi T.: Mitochondria-directed fluorescent probe for the detection of hydrogen peroxide near mitochondrial DNA. Anal. Chem. 2015; 87: 10579-10584
  Google Scholar
• 51. Werber J., Wang Y.J., Milligan M., Li X., Ji J.A.: Analysis of 2,2′-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride degradation and hydrolysis in aqueous solutions. J. Pharm. Sci., 2011; 100: 3307-3315
  Google Scholar
• 52. Wolfe K.L., Liu R.H.: Cellular antioxidant activity (CAA) assay for assessing antioxidants, foods, and dietary supplements. J. Agric. Food Chem., 2007; 55: 8896-8907
  Google Scholar
• 53. Yazdani M.: Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicol. In Vitro, 2015; 30: 578-582
  Google Scholar
• 54. Ye Z.W., Zhang J., Townsend D.M., Tew K.D.: Oxidative stress, redox regulation and diseases of cellular differentiation. Biochim. Biophys. Acta, 2015; 1850: 1607-1621
  Google Scholar
• 55. Yoshida Y., Itoh N., Saito Y., Hayakawa M., Niki E.: Application of water-soluble radical initiator, 2,2’-azobis-[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride, to a study of oxidative stress. Free Radic. Res., 2004; 38: 375-384
  Google Scholar
• 56. Zhao H., Joseph J., Fales H.M., Sokoloski E.A., Levine R.L., Vasquez- -Vivar J., Kalyanaraman B.: Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005; 102: 5727-5732
  Google Scholar
• 57. Zhou M., Diwu Z., Panchuk-Voloshina N., Haugland R.P.: A stable nonfluorescent derivative of resorufin for the fluorometric determination of trace hydrogen peroxide: applications in detecting the activity of phagocyte NADPH oxidase and other oxidases. Anal. Biochem., 1997; 253: 162-168
  Google Scholar
• 58. Zuo L., Zhou T., Pannell B.K., Ziegler A.C., Best T.M.: Biological and physiological role of reactive oxygen species – the good, the bad and the ugly. Acta Physiol., 2015; 214: 329-348
  Google Scholar

Pełna treść artykułu