Abstrakt

Gruźlica stanowiła i nadal stanowi jedną z głównych przyczyn zachorowalności i umieralności na świecie. Jej zwalczanie pozostaje priorytetem zdrowia publicznego, trudnym do zrealizowania bez zastosowania nowo opracowanej szczepionki. Jedyna dostępna szczepionka przeciw gruźlicy (BCG) jest stosowana od prawie 100 lat. Na świecie do jej produkcji są wykorzystywane różne siostrzane podszczepy, pochodzące od rodzicielskiego szczepu Mycobacterium bovis. Wyjaśnienie mechanizmów atenuacji, które doprowadziły do uzyskania wyjściowego szczepu szczepionkowego, a także zidentyfikowanie markerów mikroewolucji szczepów siostrzanych związanej z dystrybucją i odmiennymi warunkami produkcji różnych szczepionek BCG na całym świecie, może przyczynić się do zrozumienia różnic w obserwowanej skuteczności szczepionek produkowanych z wykorzystaniem poszczególnych podszczepów. Najistotniejszym markerem związanym z atenuacją zjadliwego szczepu M. bovis jest utrata regionu RD1 zidentyfikowana u wszystkich podszczepów BCG. Wśród pozostałych markerów atenuacji, dotychczas nie w pełni poznanych, istotną rolę przypisuje się swoistej kumulacji mutacji typu SNP. Odmienne warunki pasażowania rodzicielskiego szczepu szczepionkowego, podczas wytwarzania szczepionki BCG w różnych krajach, doprowadziły do wyodrębnienia około 50 różnych siostrzanych podszczepów BCG. Wśród nich wyróżnia się podszczepy „wczesne”, stosowane do 1927 r. oraz podszczepy „późne”, mające dodatkowo delecję RD2, pozyskane w latach 1927‑1961. Retrospektywne badania wykazały, że podczas rozsyłania podszczepów siostrzanych w okresie 1924‑1966 doszło do utraty 22 regionów genomu, zawierających łącznie 52 geny. Zmienność genetyczna wywołana presją selekcyjną w postaci wieloletnich swoistych procesów wytwarzania szczepionki, może stanowić jedną z przyczyn obserwowanych różnic w immunogenności lub resztkowej zjadliwości podszczepów BCG.

Gruźlica

Czynnikiem etiologicznym gruźlicy jest patogen wewnątrzkomórkowy Mycobacterium tuberculosis, który zidentyfikował Robert Koch w 1882 r. Badania szczątków antycznych mumii wykazały obecność prątków gruźlicy, co dowodzi, że choroba pojawiła się wśród ludzi co naj‑ mniej kilka tysięcy lat temu. Od połowy XIX w. zapadal‑ ność i śmiertelność wywołana gruźlicą w Europie zaczęła spadać. Poprawiające się warunki socjoekonomiczne i leczenie sanatoryjne wpłynęły na spadek współczyn‑ nika umieralności z powodu gruźlicy do 200 w 1900 r., a następnie do 26 przypadków na 100 tys. mieszkańców w 1950 r. [39]. W ostatnich dekadach zachorowalność i umieralność obniżyła się znacznie, co może się wiązać z szybszym przyrostem populacji na świecie w porów‑ naniu do częstości występowania gruźlicy. Z tych wzglę‑ dów analiza wartości bezwzględnych liczby zachorowań w ciągu ostatniej dekady niekoniecznie musi wskazywać na jej spadek [19]. W Polsce od 2000 r. wskaźniki zapa‑ dalności na gruźlicę utrzymują się na stałym poziomie około 20 przypadków na 100 tys. mieszkańców [47].

Gruźlica była i nadal jest jedną z głównych przyczyn zachorowalności i umieralności na świecie, a jej zwal‑ czanie pozostaje priorytetem dla zdrowia publicznego [37]. Z powodu gruźlicy rocznie umiera prawie 2 mln ludzi, a liczba nowo rejestrowanych przypadków, się‑ gająca ponad 9 mln, jest najwyższą spośród odnotowy‑ wanych w ostatnich latach [45]. Obecnie szacuje się, że 1/3 światowej populacji jest zakażona prątkami gruź‑ licy, co stanowi rezerwuar M. tuberculosis, a także źró‑ dło nowych przypadków gruźlicy [33,44]. Ponad 80% zachorowań rejestrowanych jest w 22 krajach rozwijających się, gdzie często dochodzi do współzakażenia M. tuberculosis/HIV [24]. Prawie 80% przypadków gruźlicy wśród osób zakażonych HIV zamieszkuje Afrykę. Sku‑ teczność obecnie prowadzonej kontroli nad zachorowa‑ niami na gruźlicę na świecie napotyka wiele przeszkód związanych przede wszystkim z brakiem odpowiednio szybkiej diagnostyki oraz możliwością zastosowania bardziej efektywnej szczepionki. Zdolność opanowania sytuacji epidemiologicznej dodatkowo pogarszają częste współzakażenia wirusem HIV oraz wzrost występowa‑ nia szczepów wielolekoopornych (multi drug resistant – MDR), ekstensywnie opornych (extensively drug resi‑ stant – XDR), a od niedawna także całkowicie lekoopor‑ nych (totally drug resistant – TDR). Z tych powodów światowy cel wyeliminowania gruźlicy jako zagrożenia zdrowia publicznego do 2050 r., wytyczony przez WHO (World Health Organization), bez zastosowania nowej zoptymalizowanej szczepionki, może być jednak trudny do zrealizowania [45].

BCG – historia powstania szczepionki

Atenuowany szczep BCG uzyskano ze zjadliwego szczepu Mycobacterium bovis już prawie sto lat temu, a mimo to nadal szczepionka BCG wytwarzana z jego udziałem jest jedyną dostępną na świecie szczepionkę przeciw gruź‑ licy. Wirulentny M. bovis, wyizolowany od krowy z obja‑ wami gruźliczego zapalenia przewodów mlecznych, został przesłany w 1901 r. do Instytutu Pasteura w Lille we Francji, w którym Albert Calmette oraz Camille Guérin prowadzili badania nad gruźlicą. W celu zmniej‑ szenia aglutynacji bakterii, do hodowli szczepu nazwa‑ nego Nocard prowadzonej na pożywce ziemniaczanej, dodawano wołową żółć. Po 15 pasażach szczepu zauważono zmiany morfologii kolonii i obniżenie zjadliwości obserwowanej u zakażanych świnek morskich in vivo. Ostatecznie w wyniku 230 pasaży M. bovis wykonanych w latach 1908‑1921 otrzymano atenuowany szczep szczepionkowy, którego bezpieczeństwo i skuteczność potwierdzono na modelu zwierzęcym (świnki morskie, króliki, psy, krowy, konie, kurczaki, naczelne) [4,27]. W 1921 r. szczepionkę BCG po raz pierwszy podano czło‑ wiekowi dożylnie (44 tys. prątków/dawkę), a do 1924 r. zaszczepiono ponad 600 dzieci [4,43]. Następnie szcze‑ pionkę podawano w trzech dawkach po 2 mg (6 mg; ~ 2,4 x 108 CFU) doustnie niemowlętom, później też nowo‑ rodkom. Obserwowana ówcześnie kliniczna skuteczność szczepionki oceniana była na 90%, a jej akceptowalny profil bezpieczeństwa wpłynął na pozytywne rokowania o możliwości wyeliminowania problemu gruźlicy przez jej powszechne zastosowanie [4,27]. Od 1974 r. szcze‑ pienia BCG weszły do Rozszerzonego Programu Szcze‑ pień Światowej Organizacji Zdrowia (WHO, Expanded Program on Immunization). Szacuje się, że do chwili obecnej szczepionkę BCG podano ponad 4 mld ludzi na świecie, co w porównaniu do innych szczepionek klasy‑ fikuje ją na pierwszym miejscu pod względem częstości zastosowania [25,39]. Oszacowano, że ostre miejscowe reakcje, tj. owrzodzenie lub zapalenie węzłów chłon‑ nych występują u mniej niż 1/1 000 zaszczepionych osób. Natomiast rozsiane zakażenie wywołane przez szczep szczepionkowy obserwowane jest u mniej niż 2/1 000 000 zaszczepionych i dotyczy głównie pacjentów z niedoborami odporności [37]. Mimo tak długiej histo‑ rii stosowania szczepionki BCG sporną kwestią pozostaje rzeczywista ocena jej zdolności do ochrony przeciw zachorowaniom na gruźlicę [6]. Metaanaliza dostęp‑ nych danych klinicznych potwierdza jej wysoką, ponad 80%, skuteczność przeciw gruźliczemu zapaleniu opon mózgowym i prosówce u dzieci, jednak w przypadku młodzieży i osób dorosłych, u których występuje naj‑ większe ryzyko gruźlicy płucnej, skuteczność jest szaco‑ wana na 0‑80% w zależności od badanej populacji [13,27]. Przyczyny tak dużych różnic w klinicznej skuteczności szczepionki BCG nie zostały jednoznacznie wyjaśnione i pozostają przedmiotem licznych debat naukowych. Na taką rozbieżność wyników mogą wpływać różne czyn‑ niki, do których można zaliczyć stosowany podszczep szczepionkowy, sposób podania szczepionki, schemat szczepień, zjadliwość prątków M. tuberculosis występu‑ jących na danym obszarze, częstość ekspozycji na śro‑ dowiskowe szczepy prątków (NTM ‑ non‑tuberculous mycobacteria), suplementacja, genetyczne podłoże różnic międzypopulacyjnych, częstość występowania przewlekłych zakażeń pasożytniczych jelit, stężenie witaminy D i żelaza u osób szczepionych oraz indywi‑ dualne predyspozycje genetyczne [27,33]. Ze względu na obserwowane różnice w skuteczności, a także przeciw‑ wskazania do szczepień BCG u nosicieli wirusa HIV lub osób z innymi zaburzeniami odporności, prowadzone są intensywne prace nad opracowaniem nowej szczepionki, która umożliwiłaby skuteczniejszą walkę z gruźlicą. Potencjalnymi szczepionkami są zarówno szczepionki żywe zawierające rekombinowane szczepy BCG lub M. tuberculosis; wektorowe szczepionki konstruowane na bazie wirusa krowianki lub adenowirusa; szczepionki podjednostkowe z adiuwantem, zawierające antygeny M. tuberculosis oraz szczepionki całokomórkowe, zawie‑ rające szczepy M. indicus pranii, M. vaccae lub M. tubercu‑ losis. W czasie badań laboratoryjnych znajduje się ponad 20 preparatów, z których co najmniej 16 jest na etapie badań przedklinicznych, natomiast 14 w fazie badań klinicznych [13,19,21,23,45]. Prace nad opracowaniem nowej szczepionki przeciwgruźliczej są żmudne, długo‑ trwałe, kosztowne i wymagają międzynarodowej współ‑ pracy. Powołanie organizacji non‑profit „Inicjatywa na rzecz szczepień przeciwko gruźlicy” (TBVI TuBerculo‑ sis Vaccine Intiative), która wspiera i integruje działania badawczo‑rozwojowe mające na celu opracowanie nowej szczepionki przeciw gruźlicy jest istotnym elementem strategii walki z tą chorobą [33]. Profil bezpieczeństwa szczepionki BCG i jej potwierdzona skuteczność przeciw najcięższym postaciom gruźlicy, uzasadnia konieczność jej nieprzerwanego i powszechnego stosowania do czasu opracowania udoskonalonej wersji, zwiększającej sku‑ teczność szczepień [21].

Atenuacja 1908‑1921

Dokładne odtworzenie procedur, które doprowadziły do atenuacji rodzicielskiego M. bovis stało się niemożliwe, ponieważ oryginalny szczep uzyskany przez Calmette oraz Guérin został utracony podczas I Wojny Świato‑ wej [43]. Badania porównawcze genomów wirulentnego szczepu M. tuberculosis H37Rv, atenuowanego szczepu M. tuberculosis H37Ra, wirulentnego szczepu M. bovis i atenu‑ owanego szczepu szczepionkowego M. bovis BCG, podjęto w latach 90 ub.w., przy czym dokładność zastosowanych metod m.in. hybrydyzacji subtraktywnej oraz mikroma‑ cierzy była zbyt mała, aby zaobserwować różnice typu mutacji punktowych (SNP – Single Nucleotide Polymor‑ phism) [25]. Pierwszymi zidentyfikowanymi markerami obniżonej zjadliwości szczepu M. bovis BCG były opisane przez Mahairas i wsp. [29] trzy delecje w regionach RD (region of deletion): RD1, RD2 oraz RD3. Wykazano, że wszystkie przebadane podszczepy BCG były pozbawione regionu RD1, który był obecny u zjadliwych szczepów M. bovis i M. tuberculosis. Niedawne badania potwier‑ dziły, że wśród 124 epitopów zdolnych do interakcji z ludzkimi komórkami T, większość (117) została zloka‑ lizowana w obrębie RD1, a zatem nie była obecna wśród wszystkich badanych podszczepów BCG [46]. Region RD1 obejmuje fragment genomu o wielkości około 9,5 kpz i składa się z dziewięciu genów (Rv3871‑Rv3879c), kodu‑ jących jeden z pięciu występujących u M. tuberculosis białkowych systemów sekrecji typu VII – system ESX‑1 [11,14,27]. Dwa geny Rv3874 i Rv3875 położone w obrębie locus RD1, odpowiadające za syntezę niskocząsteczko‑ wych białek sekrecyjnych, odpowiednio białka przesą‑ czu hodowli CFP‑10 (Culture Filtrate Protein 10) oraz wczesnego białka antygenowego ESAT‑6 (Early Secre‑ tory Antigenic 6‑kDa), są uznawane za główne media‑ tory wirulencji prątków. Transport obu białek odbywa się za pośrednictwem aparatu sekrecyjnego, w skład którego wchodzą m.in. białko transbłonowe (Rv3877) i dwie ATPazy (Rv3870 i Rv3871). Rola systemu sekrecyj‑ nego należącego do extRD1 (extended RD1) w interakcji z komórkami gospodarza jest bardzo różna i obejmuje m.in. wpływ na lizę komórek, formowanie ziarniniaków, hamowanie wydzielania cytokin, blokowanie dojrzewa‑ nia fagosomów, hamowanie sygnalizacji makrofagów czy też funkcji komórek dendrytycznych i limfocytów T [14]. Inaktywacja genów cfp‑10 i esat‑6 lub genów apa‑ ratu sekrecyjnego wywołuje skutek obserwowany pod‑ czas usunięcia całego locus RD1, wyrażający się obniżoną zjadliwością M. tuberculosis [27,41]. Interesujące jest to, że delecja RD1 odgrywająca główną rolę w atenuacji BCG, nie jest funkcjonalnie odwracalna. Doświadczalne wbudowanie utraconego fragmentu RD1 do genomu szczepu szczepionkowego nie przywracało pełnej zja‑ dliwości, a zmutowany szczep M. tuberculosis z usunię‑ tym z genomu regionem RD1 charakteryzował się nadal większą wirulencją niż BCG, co potwierdza, że istnieją inne dodatkowe mechanizmy składające się na cało‑ kształt atenuacji szczepu szczepionkowego [15,26,27]. Jeden z nich może być związany z występowaniem muta‑ cji zmiany ramki odczytu powodującej inaktywację genu phoT, związanego z wirulencją M. bovis [12]. Porównanie zsekwencjonowanych genomów M. bovis BCG Pasteur [8], M. bovis AF2122/97 [16] i M. tuberculosis H37Rv [11], wyka‑ zało liczne różnice w postaci delecji, duplikacji i mutacji punktowych. Według Liu i wsp. [27] utrata zjadliwości szczepu M. bovis wywołana 230 pasażami była związana zarówno z delecją w regionie RD1 jak i kumulacją muta‑ cji typu SNP. Wykazano, że niektóre mutacje punktowe typowe dla BCG miały znaczenie funkcjonalne, np. SNP w genie pykA umożliwiał wzrost BCG na podłożu z gli‑ cerolem [20], SNP w genie mmaA3, kodującym metylo‑ transferazę kwasu mikolowego, hamował wytwarzanie kwasu metoksy-mikolowego u „późnych” podszczepów BCG [3], a SNP w genie sigK zmniejszał syntezę białek MPB83 i MPB70 [9]. W celu sprawdzenia, które z wykry‑ tych różnic mogą być markerami pierwotnej atenuacji wszystkich szczepów BCG, przeprowadzono analizę porównawczą 21 genomów M. bovis i 13 genomów pod‑ szczepów szczepionkowych. Ze zidentyfikowanych 186 mutacji typu SNP, 115 może mieć potencjalny związek z obniżoną wirulencją (m.in. mutacje w genach kdpD, senX3, regX3, pks12), to jednak wymaga dalszych badań funkcjonalnych [15]. Badania nad wyjaśnieniem pro‑ cesu atenuacji BCG obejmują poza analizami sekwencji DNA badania różnic syntezy poszczególnych białek BCG [8,30]. Podstawową rolę w adaptacji M. bovis BCG wywo‑ łanej selekcyjną presją pasażowania, związaną z wyko‑ rzystaniem glicerolu jako źródła węgla, przypisuje się występowaniu SNP w genie pykA w obecności funkcjo‑ nalnej kinazy pirogronianowej i wysokiej transkrypcji glpD2 [20]. Zmiany metaboliczne zostały także zaobser‑ wowane w genach związanych z degradacją i modyfi‑ kacją kwasów tłuszczowych, ponieważ ekspresja genów fadD2, fadE35 i fadAB, a także desA1 i desA3 została znacz‑ nie obniżona u BCG w porównaniu do prątków zjadliwych [8].

Atenuacja po 1924 r

Od 1924 r. rodzicielski szczep M. bovis BCG przesyłano z Instytutu Pasteura do wielu laboratoriów na całym świecie w celu uruchomienia produkcji szczepionki. Do 1927 r. aż 60 krajów otrzymało hodowlę prątków BCG. Uzyskane szczepy poddawano konwencjonalnemu pasa‑ żowaniu co parę tygodni i mimo wysiłków włożonych w standaryzację tego procesu, odmienne warunki pasa‑ żowania w poszczególnych laboratoriach, doprowadziły do wyodrębnienia w wyniku mikroewolucji około 50 róż‑ nych siostrzanych podszczepów BCG (ryc. 1), z których obecnie są stosowane głównie: BCG‑Pasteur (1173P2), BCG‑Japan (Tokyo‑172), BCG‑Danish (Copenhagen‑1331) oraz BCG‑Glaxo (1077) [4,25,27]. Około 1924 r. rozpoczął się zatem drugi etap mikroewolucji genomów, związany z dystrybucją szczepów i różnymi warunkami produkcji szczepionki BCG. Po kilku dekadach i setkach pasaży dal‑ sze różnicowanie szczepów zostało zakończone dopiero dzięki zaleceniu wprowadzenia do procesu wytwarzania zwalidowanego systemu serii siewnych. Z tego powodu rozważania dotyczące różnic w resztkowej zjadliwo‑ ści, efektywności i mechanizmów atenuacji muszą być prowadzone w różnych podszczepach BCG. Pierwszym uzyskanym w 1924 r. podszczepem siostrzanym był BCG‑Russia. Kolejne podszczepy „wczesne” to BCG‑Japan (1925), BCG‑Moreau (1925), BCG‑Sweden (1926) oraz BCG‑Birkhaug (1927). Dalsza dystrybucja doprowa‑ dziła do powstania podszczepów tzw. „późnych”, do których zalicza się m.in. BCG‑Tice (1934), BCG‑Frap‑ pier (1937), BCG‑Phipps (1938), BCG‑Prague (1946), BCG‑China (1947), BCG‑Glaxo (1954), BCG‑Danish (1961) oraz BCG‑Pasteur (1961). Badania porównawcze genomu M. bovis, 7 szczepów szczepionkowych i 5 szczepów M. tuberculosis pod kątem delecji pozwoliły na identyfika‑ cję 25 regionów RD, przy czym jedynie 3 delecje (RD1, RD3, Del_Mb2377c) powiązano z pierwotną atenuacją szczepu BCG, występującą w latach 1908‑1921. Pozostałe 22 regiony, zawierające łącznie 52 geny, zostały utracone podczas dystrybucji podszczepów siostrzanych w okre‑ sie 1924‑1966 [46]. Występowanie delecji w określonych regionach RD jest swoiste dla poszczególnych grup pod‑ szczepów BCG. Zidentyfikowana delecja RD2 jest cha‑ rakterystyczna dla wszystkich podszczepów „późnych”, delecja N‑RD18 występuje u podszczepów „późnych” jednak wyłącznie grupy IV (podział szczepów na grupy omówiono w dalszej części pracy), delecja RD14 doty‑ czy tylko podszczepu BCG‑Pasteur, RD15 BCG‑Frappier a RD16 BCG‑Moreau [2,5,8,27].

W analizach porównawczych opublikowanych przez Zhanga i wsp. w 2013 r. wykazano podobną wielkość genomu (~4,2 M) i zawartość par GC (~0,65) u 13 bada‑ nych podszczepów BCG, a także statystycznie zna‑ miennie niższą średnią zmienność SNP między dwoma szczepami szczepionkowymi (0,018 SNP/kb) w porów‑ naniu ze zmiennością wśród badanych szczepów M. tuberculosis (0,25 SNP/kb). Jednocześnie udowodniono, że presja selekcyjna w warunkach laboratoryjnych, jakiej poddane były podszczepy BCG, w porównaniu z presją naturalną wywieraną przez system immunolo‑ giczny na szczepy M. tuberculosis, wpłynęła na większą liczbę utraconych sekwencji RD w ich genomach. Zmien‑ ność potwierdzono także podczas porównań genomów szczepu dzikiego M. tuberculosis ze szczepami laborato‑ ryjnymi M. tuberculosis H37Rv oraz M. tuberculosis H37Ra. Różnice genetyczne wywołane ponad 50‑letnią presją selekcyjną mogą tłumaczyć zmienność w immunogen‑ ności i resztkowej zjadliwości poszczególnych szczepion‑ kowych podszczepów BCG [46].

Poznanie sekwencji genomu szczepu M. bovis BCG Pasteur 117P2 umożliwiło zidentyfikowanie około 4 tys. genów kodujących białka, z których 58 występowało w dwóch kopiach jako skutek obecności dwóch niezależ‑ nych duplikacji DU1 oraz DU2. Pierwsza z nich obejmuje fragment wielkości niespełna 30 kpz i jest charaktery‑ styczna wyłącznie dla podszczepu BCG‑Pasteur, nato‑ miast druga występuje u wszystkich podszczepów BCG, jednak w różnych postaciach, dzielących podszczepy na cztery grupy (od DU2‑I do DU2‑IV) [7,8]. Duplika‑ cje DU2‑I i DU2‑II występują u podszczepów „wcze‑ snych” (DU2‑I: BCG‑Moreau, BCG‑Japan, BCG‑Russian; DU2‑II: BCG‑Sweden, BCG‑Birkhaug), a DU2‑III i DU2‑IV wyłącznie „późnych” (DU2‑III: BCG‑China, BCG‑Prague, BCG‑Glaxo, BCG‑Danish; DU2‑IV: BCG‑Tice, BCG‑Frap‑ pier, BCG‑Pasteur, BCG‑Phipps) [8,27]. Dla wszystkich duplikacji typu DU2, wspólne są jedynie trzy geny: Rv3300c, kodujący syntetazę pseudourydyny; phoY1, kodujący regulator systemu transportu fosforanów oraz glpD2, kodujący dehydrogenazę glicerol‑3‑fosfora‑ nową [8]. Badania porównawcze 13 podszczepów BCG z użyciem mikromacierzy, doprowadziły do identyfika‑ cji dwóch innych duplikacji [25]. Pierwsza z nich, swo‑ ista wyłącznie dla podszczepu Tice, tj. DU‑Tice, obejmuje obszar 22 kpz i zawiera geny Rv1782‑Rv1800, kodujące m.in. system sekrecji ESX‑5, czyli jedyny poza ESX‑1 sys‑ tem związany z wirulencją prątków. W genomie pod‑ szczepu BCG‑Birkhaug wykryto duplikację regionu od trxB/Rv3913 do rodA/Rv0017c, zawierającego geny zaanga‑ żowane w replikację DNA oraz podziały komórkowe [25].

Znaczące zróżnicowanie genetyczne podszczepów BCG zaobserwowano także w regionie phoP‑phoR. PhoP‑PhoR tworzy 11‑składnikowy system odgrywający zasadniczą rolę w wirulencji M. tuberculosis. PhoR jest kinazą histy‑ dynową, tj. transbłonowym białkiem przekazującym sygnały ze środowiska za pośrednictwem autofosfory‑ lacji, natomiast PhoP jest regulatorem pośredniczącym w ekspresji wielu genów, w tym odpowiedzialnych za biosyntezę lipidów ściany komórkowej oraz genów sys‑ temu ESX‑1 [8,25,27]. Obszar charakteryzuje duży poli‑ morfizm w obrębie rodziny podszczepów BCG, co może mieć związek z różnicami w ich resztkowej zjadliwości. Szczepy „wczesne” z grupy I mają insercję IS6110 (1 356 pz) w promotorze genu phoP w orientacji przeciwnej. Jak już wykazano, sekwencja IS6110 w orientacji zgod‑ nej z orientacją genu phoP zwiększa jego ekspresję, co potwierdzono wśród szczepów M. bovis B wyizolowa‑ nych od chorych podczas epidemii gruźlicy w Hiszpa‑ nii w latach 1995‑1998 [25,40]. Podszczepy BCG‑Moreau, BCG‑Japan, BCG‑Russian charakteryzują się zwiększoną ekspresją phoP, jednak ze względu na odmienną orien‑ tację insercji IS6110, mechanizm zaobserwowanej nadekspresji nie został jeszcze wyjaśniony. Może to jednak tłumaczyć większą resztkową zjadliwość rosyjskiego podszczepu w porównaniu do innych. Mechanizm nie ma jednak charakteru dominującego, gdyż w przypadku BCG‑Moreau oraz BCG‑Japan (zaliczanych do podszcze‑ pów mało reaktogennych) ważniejszymi markerami ate‑ nuacji wydają się utrata zdolności do wytwarzania takich czynników wirulencji jak dimikolany trehalozy (PDIMs phthiocerol dimycocerosates) oraz glikolipidy fenolowe (PGLs phenolic glycolipids). Pozostałe podszczepy BCG i aktualnie izolowane szczepy M. bovis oraz M. tuberculosis nie mają insercji IS6110 w regionie promotora genu phoP. Naturalnym mutantem pod względem genu phoP oka‑ zał się podszczep BCG‑Prague, natomiast w genomach BCG‑Glaxo, BCG‑Danish, BCG‑Frappier, BCG‑Sweden oraz BCG‑Birkhaug wykryto delecje w genie phoR [25].

Wykazano ponadto, że blisko spokrewnione z sobą pod‑ szczepy ”wczesne” należące do grupy II (BCG‑Sweden oraz BCG‑Birkhaug) jako jedyne zawierają dwie swoiste delecje, do których doszło przed 1926 r. Pierwsza z nich obejmuje fragment 110 pz w regionie whiB3 (Rv3416/ BCG3486). Białko WhiB należy do rodziny siedmiu czynni‑ ków transkrypcyjnych M. tuberculosis, które odpowiadają za regulację ekspresji genów w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne, w tym na stężenie tlenu i tlenku azotu oraz dostępność węgla [25,38]. Druga zidentyfikowana delecja dotyczy utraty fragmentu 245 pz w genie trcR. Białko TrcR jest regulatorem dwuskładnikowego sys‑ temu TrcR‑TrcS. Jak wykazano w badaniach z użyciem zwierząt laboratoryjnych oba regiony genomu wykazują potencjalny związek z wirulencją [25,34,42].

Badania porównawcze podszczepów BCG z użyciem mikromacierzy pozwoliły na zidentyfikowanie dwóch delecji swoistych dla podszczepu BCG‑Moreau. Pierw‑ sza z nich wiązała się z utratą końcowego fragmentu genu fadD26 (Rv2930/BCG2952) i początkowego fragmentu genu ppsA (Rv2931/BCG2953), które są częścią locus odpo‑ wiedzialnego za syntezę PDIM i PGL, tworzących lipidy ściany komórkowej wirulentnych prątków powiązane z modulacją odpowiedzi immunologicznej gospodarza [18,25,32,35,36]. Brak syntezy tych składników wykazano u trzech dystrybuowanych osobno serii podszcze‑ pów BCG (BCG‑Moreau, BCG‑Japan oraz BCG‑Glaxo). Tylko podszczep BCG‑Moreau ma delecję fragmentu fadD26‑ppsA, a zatem fenotyp ten pojawił się prawdo‑ podobnie niezależnie w wyniku różnych mechanizmów [10,25].

Mutacją charakterystyczną wyłącznie dla szczepu BCG‑Moreau opisaną po raz pierwszy przez Leunga i wsp. [25] jest delecja w regionie Rv3887c/BCG3942c. Gen ten jest częścią systemu sekrecji ESX‑2 i koduje błonowe białko transportowe homologiczne do białka, stanowią‑ cego składnik układu wydzielniczego ESX‑1, co wska‑ zuje, że może brać również udział w wydzielaniu rodziny białek Esx [1,25,28]. Późniejsze badania sekwencjonowa‑ nia genomowego wykonane w Brazylii na stosowanym tam do produkcji rodzimej szczepionki – podszczepie BCG‑Moreau (tzw. BCG‑Moreau RDJ) potwierdziły obec‑ ność delecji w genie Rv3887c, jednak innej wielkości niż opisana wcześniej przez Leunga i wsp. (odpowied‑ nio 876 pz oraz 1128 pz) [17,25]. Podszczep brazylij‑ ski BCG‑Moreau w 1951 r. został przesłany z Brazylii do Francji, skąd 1954 r. trafił do Polski, gdzie rok później z jego udziałem rozpoczęto lokalną produkcję szcze‑ pionki BCG [31]. Badania polskich szczepów produk‑ cyjnych z lat 1957‑2010 nie potwierdziły występowania delecji w genie Rv3887c, co świadczy o jej pojawieniu się w Brazylii po 1951 r. i potwierdza odrębną mikroewolu‑ cję podszczepów BCG‑Moreau RDJ oraz BCG‑Moreau PL [22].

Podsumowanie

Uporządkowanie zapisów archiwalnych dotyczących dystrybucji szczepu BCG na świecie i prowadzenia badań porównawczych jest utrudnione, ze względu na 100‑let‑ nią historię szczepionki. Dostępne dane z lat 50 ub.w. wskazują, że od rozpoczęcia lokalnych produkcji szcze‑ pionki BCG w różnych krajach niemal połowa produ‑ centów wymieniła stosowane podszczepy produkcyjne przynajmniej jeden raz. Dodatkowe trudności wiążą się z niejasną nomenklaturą, stosowaniem synonimów lub zmianą nazwy w związku ze zmianą wytwórcy lub miej‑ scem wytwarzania [4]. Mimo to, w ciągu 40 lat badań podszczepów BCG zidentyfikowano wiele markerów róż‑ niących poszczególne podszczepy siostrzane – od zmian typu SNP po duże rearanżacje genomowe. Niektóre z nich dotyczą dobrze opisanych czynników zjadliwości, tj. ESX‑1, phoP, czy PDIM/PGL. Należy podkreślić, że zna‑ czenie zidentyfikowanych markerów może być jedynie elementem zespołu czynników związanych ze skutecz‑ nością i bezpieczeństwem różnych szczepionek BCG i nie pozwala na tym poziomie wiedzy wyciągnąć jednoznacz‑ nych wniosków. Analizy porównawcze skuteczności szczepionek BCG produkowanych z różnych podszcze‑ pów na wspólnym modelu zwierzęcym okazały się zaskakująco rozbieżne. Metaanaliza dostępnych danych klinicznych nie przyniosła oczekiwanego rezultatu ze względu na duże różnice metodologiczne, które nawet przy próbie ich pominięcia, nie pozwalają na wysnucie jednoznacznego wniosku o przewadze któregoś z pod‑ szczepów. Nadal trudno jest przewidzieć jak długo szcze‑ pionka BCG będzie stosowana, ponieważ mimo wielu kontrowersji związanych z dokładnym określeniem jej skuteczności, prace nad opracowaniem preparatu nowej generacji, trwające od wielu lat nie przyniosły jak dotąd wymiernego rezultatu. Istotne dane na temat kolejnych swoistych markerów atenuacji oraz mikroewolucji pol‑ skiego podszczepu M. bovis BCG mogą przynieść wyniki sekwencjonowania genomowego w porównaniu do dostępnych danych dotyczących innych podszczepów.

Przypisy

• 1. Abdallah A.M., Gey van Pittius N.C., Champion P.A.D., Cox J., LuirinkJ., Vandenbroucke‑Grauls C.M., Applmelk B.J., Bitter W.: Type VII secre‑tion ‑ mycobacteria show the way. Nat. Rev. Microbiol., 2007; 5: 883‑891
  Google Scholar
• 2. Bedwell J., Kairo S.K., Behr M.A., Bygraves J.A.: Identification ofsubstrains of BCG vaccine using multiplex PCR. Vaccine, 2001; 19:2146‑2151
  Google Scholar
• 3. Behr M.A.: BCG‑different strains, different vaccines? Lancet In‑fect. Dis., 2002; 2: 86‑92
  Google Scholar
• 4. Behr M.A., Schroeder B.G., Brinkman J.N., Slayden R.A., BarryC.E.: A point mutation in the mma3 gene is responsible for impairedmethoxymycolic acid production in Mycobacterium bovis BCG strainsobtained after 1927. J. Bacteriol., 2000; 182: 3394‑3399
  Google Scholar
• 5. Behr M.A., Small P.M.: A historical and molecular phylogeny ofBCG strains. Vaccine, 1999; 17: 915‑922
  Google Scholar
• 6. Behr M.A., Wilson M.A., Gill W.P., Salamon H., Schoolnik G.K., RaneS., Small P.M.: Comparative genomics of BCG vaccines by whole‑ge‑nome DNA microarray. Science, 1999; 284: 1520‑1523
  Google Scholar
• 7. Brosch R., Gordon S.V., Buchrieser C., Pym A.S., Garnier T., ColeS.T.: Comparative genomics uncovers large tandem chromosomal du‑plications in Mycobacterium bovis BCG Pasteur. Yeast, 2000; 17: 111‑123
  Google Scholar
• 8. Brosch R., Gordon S.V., Garnier T., Eiglmeier K., Frigui W., ValentiP., Dos Santos S., Duthoy S., Lacroix C., Garcia‑Pelayo C., Inwald J.K.,Golby P., Garcia J.N., Hewinson R.G., Behr M.A. i wsp.: Genome plas‑ticity of BCG and impact on vaccine efficacy. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 2007; 104: 5596‑5601
  Google Scholar
• 9. Charlet D., Mostowy S., Alexander D., Sit L., Wiker H.G., BehrM.A.: Reduced expression of antigenic proteins MPB70 and MPB83in Mycobacterium bovis BCG strains due to a start codon mutation insigK. Mol. Microbiol., 2005; 56: 1302‑1313 10 Chen J.M., Islam S.T., Ren H., Liu J.: Differential productions oflipid virulence factors among BCG vaccine strains and implicationson BCG safety. Vaccine, 2007; 25: 8114‑8122
  Google Scholar
• 10. years later. Lancet Infect. Dis., 2011; 11: 633‑640
  Google Scholar
• 11. Cole S.T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D.,Gordon S.V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C.E. 3rd, Tekaia F., Badcock K.,Basham D., Brown D., Chillingworth T., Connor R. i wsp.: Decipheringthe biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genomesequence. Nature, 1998; 393: 537‑544
  Google Scholar
• 12. Collins D.M., Kawakami R.P., Buddle B.M., Wards B.J., de LisleG.W.: Different susceptibility of two animal species infected withisogenic mutants of Mycobacterium bovis identifies phoT as havingroles in tuberculosis virulence and phosphate transport. Microbi‑ology, 2003; 149: 3203‑3212
  Google Scholar
• 13. Frick M.: The TB Vaccines Pipeline. Where are we going, wherehave we been? W: 2013 Pipeline Report, red. T. Horn, S. Morgan. HIVi‑Base/Treatment Action Group, 2013: 263‑283
  Google Scholar
• 14. Ganguly N., Siddiqui I., Sharma P.: Role of M. tuberculosis RD‑1region encoded secretory proteins in protective response and viru‑lence. Tuberc. Edinb. Scotl., 2008; 88: 510‑517
  Google Scholar
• 15. Garcia Pelayo M.C., Uplekar S., Keniry A., Mendoza Lopez P.,Garnier T., Nunez Garcia J., Boschiroli L., Zhou X., Parkhill J., SmithN., Hewinson R.G., Cole S.T., Gordon S.V.: A comprehensive surveyof single nucleotide polymorphisms (SNPs) across Mycobacteriumbovis strains and M. bovis BCG vaccine strains refines the genealogyand defines a minimal set of SNPs that separate virulent M. bovisstrains and M. bovis BCG strains. Infect. Immun., 2009; 77: 2230‑2238
  Google Scholar
• 16. Garnier T., Eiglmeier K., Camus J.‑C., Medina N., Mansoor H.,Pryor M., Duthoy S., Grondin S., Lacroix C., Monsempe C., SimonS., Harris B., Atkin R., Doggett J., Mayes R. i wsp.: The complete ge‑nome sequence of Mycobacterium bovis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2003; 100: 7877‑7882Piśmiennictwo
  Google Scholar
• 17. Gomes L.H.F., Otto T.D., Vasconcellos É.A., Ferrão P.M., MaiaR.M., Moreira A.S., Ferreira M.A., Castello‑Branco L.R.R., DegraveW.M., Mendonca‑Lima L.: Genome sequence of Mycobacterium bovisBCG Moreau, the Brazilian vaccine strain against tuberculosis. J.Bacteriol., 2011; 193: 5600‑5601
  Google Scholar
• 18. Hotter G.S., Wards B.J., Mouat P., Besra G.S., Gomes J., Singh M.,Bassett S., Kawakami P., Wheeler P.R., de Lisle G.W., Collins D.M.:Transposon mutagenesis of Mb0100 at the ppe1‑nrp locus in Myco‑bacterium bovis disrupts phthiocerol dimycocerosate (PDIM) andglycosylphenol‑PDIM biosynthesis, producing an avirulent strainwith vaccine properties at least equal to those of M. bovis BCG. J.Bacteriol., 2005; 187: 2267‑2277
  Google Scholar
• 19. Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc: Biuletyn Instytutu Gruźlicyi Chorób Płuc 2014, http://www.igichp.edu.pl/(18.08.2015)
  Google Scholar
• 20. Kaufmann S.H.: Fact and fiction in tuberculosis vaccine research:
  Google Scholar
• 21. Kaufmann S.H., Hussey G., Lambert P.H.: New vaccines for tu‑berculosis. Lancet, 2010; 375: 2110‑2119
  Google Scholar
• 22. Keating L.A., Wheeler P.R., Mansoor H., Inwald J.K., Dale J., He‑winson R.G., Gordon S.V.: The pyruvate requirement of some mem‑bers of the Mycobacterium tuberculosis complex is due to an inactivepyruvate kinase: implications for in vivo growth. Mol. Microbiol.,2005; 56: 163‑174
  Google Scholar
• 23. Krysztopa‑Grzybowska K., Brzezińska S., Augustynowicz‑KopećE., Polak M., Augustynowicz E., Lutyńska A.: Descendant of daugh‑ter Brazilian BCG Moreau substrain in Poland. Vaccine, 2012; 30:5512‑5518
  Google Scholar
• 24. Krysztopa‑Grzybowska K., Lutyńska A.: Advances in the devel‑opment of new vaccines against tuberculosis. 100 years after theintroduction of BCG. Postępy Hig. Med. Dośw., 2014; 68: 768‑776
  Google Scholar
• 25. Lawn S.D., Zumla A.I.: Tuberculosis. Lancet, 2011; 378: 57‑72
  Google Scholar
• 26. Leung A.S., Tran V., Wu Z., Yu X., Alexander D.C., Gao G.F., ZhuB., Liu J.: Novel genome polymorphisms in BCG vaccine strains andimpact on efficacy. BMC Genomics, 2008; 9: 413
  Google Scholar
• 27. Lewis K.N., Liao R., Guinn K.M., Hickey M.J., Smith S., Behr M.A.,Sherman D.R.: Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mim‑ics bacille Calmette‑Guérin attenuation. J. Infect. Dis., 2003; 187:117‑123
  Google Scholar
• 28. Liu J., Tran V., Leung A.S., Alexander D.C., Zhu B.: BCG vaccines:their mechanisms of attenuation and impact on safety and protec‑tive efficacy. Hum. Vaccin., 2009; 5: 70‑78
  Google Scholar
• 29. MacGurn J.A., Cox J.S.: A genetic screen for Mycobacterium tu‑berculosis mutants defective for phagosome maturation arrest iden‑tifies components of the ESX‑1 secretion system. Infect. Immun.,2007; 75: 2668‑2678
  Google Scholar
• 30. Mahairas G.G., Sabo P.J., Hickey M.J., Singh D.C., Stover C.K.:Molecular analysis of genetic differences between Mycobacteriumbovis BCG and virulent M. bovis. J. Bacteriol., 1996; 178: 1274‑1282
  Google Scholar
• 31. Mattow J., Jungblut P.R., Schaible U.E., Mollenkopf H.J., LamerS., Zimny‑Arndt U., Hagens K., Müller E.C., Kaufmann S.H.: Identi‑fication of proteins from Mycobacterium tuberculosis missing in at‑tenuated Mycobacterium bovis BCG strains. Electrophoresis, 2001;22: 2936‑2946
  Google Scholar
• 32. Olinto M.: The Brazilian experience in prevention of tuber‑culosis with a concurrent method of BCG vaccination. Pediatrics,1957; 19: 833‑843
  Google Scholar
• 33. Onwueme K.C., Vos C.J., Zurita J., Ferreras J.A., Quadri L.E.: Thedimycocerosate ester polyketide virulence factors of mycobacteria.Prog. Lipid Res., 2005; 44: 259‑302
  Google Scholar
• 34. Ottenhoff T.H., Kaufmann S.H.: Vaccines against tuberculosis:where are we and where do we need to go? PLoS Pathog., 2012; 8:e1002607
  Google Scholar
• 35. Parish T., Smith D.A., Kendall S., Casali N., Bancroft G.J., StokerN.G.: Deletion of two‑component regulatory systems increases thevirulence of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun., 2003; 71:1134‑1140
  Google Scholar
• 36. Reed M.B., Domenech P., Manca C., Su H., Barczak A.K., Kre‑iswirth B.N., Kaplan G., Barry C.E. 3rd.: A glycolipid of hyperviru‑lent tuberculosis strains that inhibits the innate immune response.Nature, 2004; 431: 84‑87
  Google Scholar
• 37. Rousseau C., Winter N., Pivert E., Bordat Y., Neyrolles O., Avé P.,Huerre M., Gicquel B., Jackson M.: Production of phthiocerol dimyco‑cerosates protects Mycobacterium tuberculosis from the cidal activityof reactive nitrogen intermediates produced by macrophages andmodulates the early immune response to infection. Cell. Microbiol.,2004; 6: 277‑287
  Google Scholar
• 38. Rowland R., McShane H.: Tuberculosis vaccines in clinical trials.Expert Rev. Vaccines, 2011; 10: 645‑658
  Google Scholar
• 39. Singh A., Guidry L., Narasimhulu K.V., Mai D., Trombley J., Red‑ding K.E., Giles G.I., Lancaster J.R. Jr, Steyn A.J.: Mycobacterium tuber‑culosis WhiB3 responds to O2 and nitric oxide via its [4Fe‑4S] clusterand is essential for nutrient starvation survival. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 2007; 104: 11562‑11567
  Google Scholar
• 40. Smith K.C., Orme I.M., Starke J.R.: Tuberculosis vaccine. W: S.Plotkin, W. Orenstein, P. Offit (red.) Vaccines. UK, Elsevier Saunders,Oxford, 2008; 857‑886
  Google Scholar
• 41. Soto C.Y., Menéndez M.C., Pérez E., Samper S., Gómez A.B., GarcíaM.J., Martin C.: IS6110 mediates increased transcription of the phoPvirulence gene in a multidrug‑resistant clinical isolate responsiblefor tuberculosis outbreaks. J. Clin. Microbiol., 2004; 42: 212‑219
  Google Scholar
• 42. Stanley S.A., Raghavan S., Hwang W.W., Cox J.S.: Acute infectionand macrophage subversion by Mycobacterium tuberculosis requirea specialized secretion system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100:13001‑13006
  Google Scholar
• 43. Steyn A.J., Collins D.M., Hondalus M.K., Jacobs W.R., KawakamiR.P., Bloom B.R.: Mycobacterium tuberculosis WhiB3 interacts withRpoV to affect host survival but is dispensable for in vivo growth.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002; 99: 3147‑3152
  Google Scholar
• 44. Teo S.S., Shingadia D.: BCG vaccine. Adv. Exp. Med. Biol., 2005;568: 117‑134
  Google Scholar
• 45. Vrba A., Kwiatkowska S.: Mycobacterium tuberculosis jako przy‑kład patogenu wewnątrzkomórkowego. Wzajemne relacje międzymikro‑ i makroorganizmem. Pol. Merkur. Lekarski, 2009; 27: 508‑513
  Google Scholar
• 46. World Health Organization: Global tuberculosis report 2012. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/75938/1/9789241564502_eng.pdf (18.08.2015)
  Google Scholar
• 47. Zhang W., Zhang Y., Zheng H., Pan Y., Liu H., Du P., Wan L., Liu J.,Zhu B., Zhao G., Chen C., Wan K.: Genome sequencing and analysisof BCG vaccine strains. PLoS One, 2013; 8: e71243
  Google Scholar

Pełna treść artykułu