Streszczenie

Uwalnianie ATP występuje we wszystkich typach komórek i tkanek, jest uznawane za główny element powszechnego, starego ewolucyjnie systemu komunikacji międzykomórkowej. Uważa się też, że regulowane uwalnianie ATP uczestniczy w mechanizmie ułatwiającym utrzymanie równowagi między podażą a popytem na tlen w tkankach. W artykule omówiono sygnalizację z udziałem ATP, przedstawiono zarys regulacji zaopatrzenia tkanek w tlen oraz koncepcję przypisującą erytrocytom udział w tym procesie przez uwalnianie ATP. Wysycenie hemoglobiny tlenem w erytrocytach wędrujących przez tkanki odzwierciedla poziom zużycia tlenu przez te tkanki. Erytrocyty mogą zatem pełnić rolę miejscowego czujnika poziomu tlenu. Według zaproponowanego mechanizmu, w wyniku odtlenowania hemoglobiny aktywacji ulega białko Gi w błonie komórkowej erytrocytu. W ten sposób uruchomiony zostaje zależny od cAMP szlak sygnałowy prowadzący do wypływu ATP przez kanały paneksynowe. Zewnątrzkomórkowy ATP działa wazodylatacyjnie poprzez receptory P2Y na powierzchni komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, co zwiększa przepływ krwi w rejonach o podwyższonym zużyciu tlenu. Mimo wielu przekonujących dowodów, które mogą potwierdzać przedstawioną koncepcję, pewne szczegóły pozostają niewyjaśnione, zwłaszcza sposób aktywacji białka Gi. Kontrowersje budzi też udział cAMP i ostateczna droga wypływu ATP z erytrocytów. Dalszych badań in vivo wymagać będzie określenie faktycznego znaczenia fizjologicznego proponowanego mechanizmu regulacyjnego.

Wprowadzenie

Długo sądzono, że funkcja erytrocytów w zaopatrywaniu tkanek w tlen sprowadza się do biernego przenoszenia gazów oddechowych. Wiele dowodów wskazuje jednak, że ich rola może być bardziej złożona. Podobnie jak komórki innych typów, erytrocyty zdolne są do uwalniania adenozyno-5ʹ-trifosforanu (ATP) do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. ATP oraz produkty jego rozkładu działają tu jako cząsteczki sygnałowe i za pośrednictwem receptorów nukleotydowych mogą oddziaływać autokrynowo i parakrynowo, na same erytrocyty i na inne komórki krwi oraz na komórki śródbłonka naczyń. Uważa się, że erytrocyty uwalniając ATP mogą aktywnie uczestniczyć w kontroli zaopatrzenia tkanek w tlen przez regulację światła naczyń krwionośnych, za pośrednictwem receptorów nukleotydowych na powierzchni komórek śródbłonka [34].

ATP jako cząsteczka sygnałowa

Fizjologiczne działanie ATP

Działanie fizjologiczne pochodnych adeniny dostrzeżono już w 1929 r. – tym samym, w którym Karl Lohmann i Cyrus Hartwell Fiske niezależnie odkryli rolę ATP jako źródła energii w mięśniach [36, 56]. Obserwacji tej dokonano w eksperymentach wykazujących występowanie bradykardii zatokowej i spadek ciśnienia krwi u psów, którym dożylnie podawano nukleozydy i nukleotydy adeninowe [28, 61]. Badania te uznaje się za pierwsze, w których dostrzeżono regulacyjne działanie pozakomórkowych puryn. W latach pięćdziesiątych XX w. po raz pierwszy opisano wazodylatacyjne działanie ATP [29]. W następnej dekadzie natomiast wykazano rolę adenozyny jako czynnika regulującego przepływ krwi w naczyniach wieńcowych [3]. Zaproponowano wtedy mechanizm negatywnego sprzężenia zwrotnego, w którym wzrost zapotrzebowania na tlen w kardiomiocytach (np. podczas wysiłku fizycznego), odzwierciedlany przez spadek ciśnienia cząstkowego tlenu (pO2) w tych komórkach, doprowadza do wypływu adenozyny, która działa na swoiste receptory na powierzchni komórek mięśni gładkich ściany tętniczek wieńcowych, powodując wazodylatację. Wywołuje to wzrost przepływu krwi, dzięki czemu pO2 w kardiomiocytach wraca do równowagi. W latach siedemdziesiątych ub.w. odkryto rolę sygnałową ATP w układzie nerwowym. W 1972 r. Goeffrey Burnstock przedstawił koncepcję neurotransmisji purynergicznej (nazwa utworzona przez analogię do sygnalizacji cholinergicznej i adrenergicznej) z udziałem nukleotydów purynowych, a następnie przedstawił dowody na to, że ATP działa jako kotransmiter w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym [6, 11]. Ze względu na dobrze ugruntowaną wiedzę o roli ATP jako przenośnika energii w układach biologicznych, do koncepcji przypisującej ATP rolę cząsteczki sygnałowej długo odnoszono się ze sceptycyzmem [10]. Obecnie jednak rola sygnałowa ATP nie budzi wątpliwości i uważa się, że ATP, inne nukleotydy oraz nukleozydy purynowe, są uwalniane przez komórki wszystkich typów i działają zarówno w neurotransmisji, jak i w oddziaływaniach autokrynowych i parakrynowych [69]. Funkcja sygnałowa ATP i innych nukleotydów purynowych opisano zarówno u kręgowców jak i bezkręgowców, tak w świecie zwierząt jak i roślin, grzybów, protistów i bakterii, co skłania do uznania puryn za najpowszechniejsze cząsteczki sygnałowe [15, 18, 85].

Sygnalizację purynergiczną uważa się za mechanizm stary ewolucyjnie. Dowiedziono, że ATP działa jako chemorepelent u dwóch przedstawicieli protistów: Tetrahymena thermophila i Paramecium tetraurelia. W organizmach tych ATP wywołuje depolaryzację błony i działa poprzez zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie jonów Ca2+ [52, 89]. Wydaje się prawdopodobne, że sygnalizacja z udziałem ATP wyewoluowała z wczesnych układów, w których zewnątrzkomórkowy ATP, uwalniający się z uszkodzonych komórek był sygnałem o niebezpieczeństwie [20]. Wykazany w badaniach z użyciem mysich tymocytów i komórek linii Jurkat wypływ ATP z komórek apoptotycznych działa jako stymulujący fagocytozę, sygnał parakrynowy, uczestniczący w rekrutacji monocytów i makrofagów [30]. Wykazano też, że ATP ukierunkowuje migrację ludzkich i mysich neutrofilów na zasadzie oddziaływań autokrynowych. Uwalniany na czele komórki (w rejonie umiejscowionym najbliżej źródła sygnału chemotaktycznego), wzmacnia pierwotny sygnał chemotaktyczny i wyznacza kierunek migracji [17].

Sygnalizacja purynergiczna działa w układzie nerwowym [9], w odpowiedzi immunologicznej [12, 48], stanach zapalnych [43], przewodnictwie bólowym [51], agregacji płytek [14], wazodylatacji z udziałem komórek śródbłonka [22] oraz regulacji proliferacji [75] i śmierci komórek [60, 86]. Ekspresję receptorów nukleotydowych wykryto w błonie komórek nabłonkowych, mięśni gładkich budujących ścianę naczyń krwionośnych, w błonie erytrocytów oraz na powierzchni komórek wszystkich układów i narządów [14, 42, 71, 80]. Wyczerpujący przegląd literatury donoszącej o występowaniu poszczególnych podtypów receptorów przedstawili G. Burnstock i G. E. Knight [13].

Receptory nukleotydowe

Uwalnianie ATP z komórek

Sposób, w jaki ATP pokonuje barierę błony komórkowej w wielu przypadkach pozostaje niewyjaśniony [8]. Bez względu na typ komórki, uwalnianie ATP może być wynikiem lizy komórki, nekrozy lub apoptozy, odbywać się na drodze transportu przez pory lub kanały błonowe, albo transportu z udziałem swoistych przenośników błonowych lub dokonywać się w procesie egzocytozy. Lityczny wypływ ATP w badaniach nad kontrolowanym uwalnianiem ATP jest na ogół pomijany, bo większość badaczy nie przypisuje tej drodze dużego znaczenia w warunkach fizjologicznych. Sugeruje się najwyżej, że mogłaby odgrywać rolę w stanach patologicznych [69].

W układzie nerwowym mechanizm uwalniania ATP został stosunkowo dobrze poznany; odbywa się w wyniku egzocytozy pęcherzyków na błonie presynaptycznej [6]. Natomiast w doniesieniach na temat możliwych dróg nielitycznego wypływu ATP z komórek innych typów obok egzocytozy sugeruje się przenośniki błonowe, takie jak białka mające kasetę wiążącą ATP (ABC transporters), a w szczególności CFTR, MDR (multidrug resistance protein) oraz receptory sulfonylomocznika (SUR), a ponadto półkanały koneksynowe oraz kanały paneksynowe, anionowe (VSOAC, pl-VDAC-1) i receptor P2X7 [54, 76]. Wydaje się, że wzrost zewnątrzkomórkowej puli ATP może zachodzić też w procesie syntezy de novo przez F1-F0 ATP-azę obecną w błonie komórkowej niektórych typów komórek [64].

Rola CFTR

Jednym z kanałów błonowych, który – jak sugerowano – mógłby uczestniczyć w mechanizmie wypływu ATP z erytrocytów jest przezbłonowy regulator transportu jonów (CFTR, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Białko to, samo będące kanałem dla jonów Cl–, odpowiada w komórkach epitelialnych za regulację przepływu tych jonów przez ORCC – kanały usuwające jony chlorkowe z komórki (out wardly rectifying chloride channels). Oprócz komórek epitelialnych obecność tego transportera wykazano w błonie komórek mięśni gładkich, komórkach śródbłonka, a także w błonie erytrocytów. Mimo przesłanek o uczestnictwie CFTR w uwalnianiu ATP, jego właściwa rola w tym procesie pozostaje niewyjaśniona. Dowodzono, że aktywacja CFTR pod wpływem kinazy białkowej A (PKA), zależna od cAMP, powoduje wypływ ATP przez CFTR, co wywołuje stymulację wypływu Cl- przez ORCC za pośrednictwem receptorów P2 [77]. Jednak w późniejszych badaniach nie zdołano potwierdzić występowania wypływu ATP bezpośrednio przez CFTR [41, 78]. Mimo to, udział tego kanału na jakimś etapie uwalniania ATP został potwierdzony w eksperymentach z udziałem inhibitorów farmakologicznych oraz w doświadczeniach na erytrocytach osób chorych na mukowiscydozę, w wyniku mutacji pozbawionych aktywnego CFTR. U chorych tych nie występował, stwierdzany u osób zdrowych wypływ ATP z krwinek czerwonych pod wpływem deformacji mechanicznej [81]. Wydaje się zatem, że sam CFTR nie jest drogą, którą wypływa ATP, natomiast może pełnić rolę regulatora innego szlaku uwalniania tej cząsteczki. Podejrzewano, że rola CFTR mogłaby polegać na regulacji równowagi jonowej po obu stronach błony erytrocytu, podczas uwalniania silnie ujemnie naładowanych cząsteczek ATP [2]. Przede wszystkim jednak, upatruje się rolę CFTR w kontroli kanałów paneksynowych (Panx1) [83].

Kanały paneksynowe

Kanały paneksynowe (paneksony) są zbudowane z paneksyn. Białka te występują u człowieka i innych kręgowców, zaklasyfikowano je jako białka tworzące połączenia szczelinowe (gap junctions) ze względu na częściową homologię z ineksynami, białkami tworzącymi tego typu połączenia u bezkręgowców [67]. Strukturalnie paneksyny wykazują cechy wspólne z koneksynami, wcześniej opisaną rodziną białek tworzących połączenia szczelinowe u kręgowców, choć ich sekwencja aminokwasowa nie wykazuje z nimi homologii (ryc. 1). Tak jak koneksyny, paneksyny mają cztery domeny przezbłonowe, dwie pętle zewnątrzkomórkowe, pętlę cytoplazmatyczną i końce N i C po stronie cytoplazmy. W obrębie pętli zewnątrzkomórkowych paneksyny zawierają cztery a koneksyny sześć konserwatywnych reszt cysteinowych. Ponadto, Panx1 i Panx3 mają po jednym rejonie ulegającym glikozylacji w obrębie odpowiednio drugiej i pierwszej pętli. Panx1 w błonie komórkowej tworzą heksamery (paneksony) [74]. Wydaje się, że paneksony, zbudowane z białek ulegających glikozylacji nie tworzą połączeń szczelinowych, ponieważ taka modyfikacja w obrębie fragmentów zewnątrzkomórkowych białka uniemożliwia połączenie z kanałami w błonie sąsiednich komórek. Umożliwiają raczej wymianę cząsteczek między przestrzenią wewnątrz- i zewnątrzkomórkową. Wiele właściwości tych kanałów sprawia, że paneksony (Panx1) są dobrym kandydatem na pośrednika w uwalnianiu ATP: Są nieselektywnie przepuszczalne dla cząsteczek o masie <900 Da [68]. Ponadto, mogą ulegać aktywacji pod wpływem depolaryzacji błony w fizjologicznym zakresie (w odróżnieniu od kanałów koneksynowych, których otwarcie w warunkach eksperymentalnych wymaga bardzo silnej depolaryzacji). Ulegają aktywacji przy zewnątrzkomórkowych stężeniach jonów Ca2+ w zakresie fizjologicznym, mogą ulegać aktywacji pod wpływem stymulacji mechanicznej i w warunkach spadku poziomu energetycznego komórki, a także pod wpływem wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca2+. W eksperymentach na oocytach Xenopus z ekspresją kanałów paneksynowych wykazano przepuszczalność tych kanałów dla ATP pod wpływem depolaryzacji i stymulacji mechanicznej [1].

Ryc. 1. Schemat struktury koneksyn i paneksyn w błonie komórkowej na przykładzie białek Cx43 i Panx1; u góry: mimo braku homologii na poziomie sekwencji aminokwasowej topologicznie oba białka mają wiele cech wspólnych. Zawierają cztery domeny przezbłonowe, dwie pętle po zewnętrznej stronie błony oraz jedną pętlę i domeny N- i C-końcowe po stronie cytoplazmatycznej. Koneksyny mają trzy, a paneksyny dwie reszty cysteinowe w obrębie każdej z pętli zewnątrzkomórkowych (oznaczone symbolem ©). Panx1 ma miejsce glikozylacji w pozycji 254 łańcucha aminokwasowego; u dołu: koneksyny i paneksyny ulegają oligomeryzacji, tworząc heksamery określane mianem koneksonów i paneksonów. Koneksony w błonach dwóch sąsiadujących komórek tworzą połączenia szczelinowe, natomiast paneksony prawdopodobnie tworzą kanały otwierające się do przestrzeni zewnątrzkomórkowej

Zidentyfikowano wiele receptorów nukleotydowych, dla których agonistami są zarówno ATP, jak i inne pochodne adeniny oraz UTP, UDP i UDP-glukoza. Ponieważ działanie nukleotydów pirymidynowych jako ich agonistów zaobserwowano później, w literaturze cały czas funkcjonuje określenie „receptory purynergiczne” (purinergic receptors) [58]. Receptory nukleotydowe dzieli się na dwa typy, P1 dla adenozyny i P2 dla ATP/ADP, UTP/UDP. Ze względu na mechanizm transdukcji sygnału typ P2 dzieli się dalej na rodzinę P2X, do której należą receptory będące kanałami jonowymi bramkowanymi ligandem (jonotropowe) i rodzinę P2Y, do której zalicza się receptory związane z białkiem G (metabotropowe) (tab. 1) [7].

Agonista	Receptor
ATP	P2X1 – P2X7, P2Y2, P2Y11
ADP	P2Y1, P2Y12, P2Y13
UTP	P2Y2, P2Y4
UDP	P2Y6, P2Y14
UDP-glukoza	P2Y14
Adenozyna	A1, A2A, A2B, A3

Tabela 1. Najsilniejsze endogenne agonisty receptorów nukleotydowych człowieka

Aktywacja receptorów rodziny P2X zmienia konformację w obrębie kanału błonowego, która powoduje otwarcie kanału i napływ do wnętrza komórki jonów Na+ i Ca2+ i depolaryzację błony komórkowej. Depolaryzacja aktywuje kanały wapniowe bramkowane napięciem, umożliwiając dalszy napływ jonów Ca2+, wzmagający depolaryzację. Receptory z rodziny P2Y należące do grupy receptorów GPCR (G-protein-coupled receptors) wiążą z różnym powinowactwem i w zależności od podtypu: ATP, ADP lub UTP i UDP. Współdziałają one z białkami Gq, Gi lub Gs, a ich aktywacja zmienia wewnątrzkomórkowe stężenie cAMP lub Ca2+, uwalniane z retikulum endoplazmatycznego przez kanały otwierane z udziałem trifosforanu inozytolu (IP3). Dotąd zidentyfikowano siedem podtypów receptorów w obrębie rodziny P2X (P2X1 – P2X7) i osiem – w obrębie rodziny P2Y (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11 – P2Y14) [53].

Selektywne blokery receptorów nukleotydowych znajdują zastosowanie terapeutyczne. Klopidogrel, nieodwracalnie hamujący receptory P2Y12 na powierzchni płytek krwi jest szeroko stosowany w zapobieganiu zakrzepom w chorobach układu krążenia. Przedmiotem badań jest możliwość wykorzystania związków hamujących inne receptory nukleotydowe, mogących mieć znaczenie w terapii bólu, reumatoidalnego zapalenia stawów, zespołu suchego oka, zespołu jelita nadwrażliwego, chorób zapalnych jelit oraz w terapii nowotworów [51].

Poziom zewnątrzkomórkowego ATP w świetle naczyń krwionośnych jest ściśle kontrolowany, a jego rozkład może być źródłem cząsteczek, które również pełnią funkcje sygnałowe. W degradacji ATP uczestniczą egzonukleotydazy wydzielane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej oraz związane z błoną ektonukleotydazy, których część katalityczna jest umiejscowiona po stronie zewnątrzkomórkowej. Jedną z nich jest ektonukleotydaza difosfohydrolazatrifosforanów nukleozydów – 1 (ENTPDaza-1, CD39) występująca w układzie naczyniowym, katalizująca rozkład ATP do ADP i ADP do AMP. AMP może ulec dalszej degradacji przez defosforylację z udziałem ekto-5ʹ-nukleotydazy (CD73) [27].

Możliwość uwalniania ATP przez erytrocyty

W erytrocytach, brak organelli i przedziałów wewnątrzkomórkowych determinuje niezdolność tych komórek do efektywnej egzocytozy [70]. Zatem, skoro w dojrzałych erytrocytach zjawisko egzocytozy, w takim sensie jak w komórkach jądrzastych nie występuje, jedynym możliwym mechanizmem regulowanego uwalniania ATP wydaje się wypływ przez pory albo kanały błonowe lub transport w poprzek błony przez swoiste przenośniki.

Wiele komórek, w których stwierdzono wypływ ATP przez kanały, wykazuje w błonie obecność Panx1. Należą tu erytrocyty, komórki nabłonka dróg oddechowych, astrocyty, makrofagi, hepatocyty, limfocyty, komórki kanalików nerkowych i komórki przysadki mózgowej. W erytrocytach, astrocytach, komórkach nabłonka dróg oddechowych, makrofagach i komórkach przysadki stwierdzono osłabienie lub całkowite zniesienie wypływu ATP w wyniku wyciszenia lub wyłączenia ekspresji Panx1, co wskazuje na udział paneksonów w uwalnianiu ATP, przynajmniej w niektórych typach komórek [23]. Sridharan i wsp. dostarczyli dowodów potwierdzających hipotezę o pośrednictwie kanałów paneksynowych erytrocytów, w uwalnianiu ATP pod wpływem hipoksji, wykazując, że stymulowany w ten sposób wypływ ATP jest hamowany przez karbenoksolon, probenecyd i peptyd 10panx1 – trzy odmienne strukturalnie inhibitory paneksyny-1. Opisali też brak hamującego działania tych inhibitorów na wypływ ATP stymulowany iloprostem, agonistą receptora prostacykliny (IP), co skłoniło autorów do wniosku, że poza paneksonami w erytrocytach funkcjonuje jeszcze inna droga wypływu ATP [83]. Ci sami autorzy w innej pracy dowodzą, że rolę tę mogłyby pełnić kanały anionowe zależne od napięcia VDAC1, których obecność w błonie erytrocytów wykazano za pomocą swoistych przeciwciał. Hipoteza ta sformułowana została w oparciu o wyniki eksperymentów z udziałem inhibitorów VDAC, Bcl-xL BH44 –23 i TRO19622, w których wykazano hamowanie wypływu ATP z erytrocytów stymulowanych agonistami receptora prostacykliny [84].

Hamujący wpływ karbenoksolonu oraz 10Panx1 na uwalnianie ATP przez erytrocyty stwierdzono też w przypadku stymulacji przez zwiększenie stężenia cAMP (wskutek działania forskoliny i papaweryny) [63]. Jednak w cytowanej pracy dostrzeżono również wypływ ATP niewrażliwy na karbenoksolon, który wydawał się występować bez związku ze stymulacją wzrostu poziomu cAMP. Jak twierdzą autorzy, było to raczej rezultatem mechanicznych perturbacji, na które narażone były erytrocyty w zastosowanym układzie eksperymentalnym.

Do wypływu ATP dochodzi też pod wpływem stymulacji receptorów β‑adrenergicznych na powierzchni erytrocytów, za pomocą izoprenaliny (isoproterenol) lub adrenaliny. Znaczenie tego szlaku pozostaje jednak niewyjaśnione. Sugeruje się, że może odgrywać rolę w przebiegu dojrzewania komórek erytroidalnych, przed uwolnieniem ich do krwiobiegu, a w dojrzałych erytrocytach jest pozostałością po wcześniejszych etapach ich rozwoju. Próby ustalenia mechanizmu uwalniania ATP pod wpływem tego rodzaju stymulacji za pomocą inhibitorów farmakologicznych dają częściowo sprzeczne wyniki, niemniej sugerują istnienie innej, jak dotąd niezidentyfikowanej drogi wypływu ATP, niezależnej zarówno od paneksyn jak i kanałów VDAC [63, 84].

Tak więc, za najważniejszą drogę wypływu ATP z erytrocytów uznaje się obecnie kanały paneksynowe. Aktywacja receptora prostacykliny powoduje natomiast wypływ ATP, prawdopodobnie z udziałem kanałów VDAC [84]. Wiele dowodów wskazuje jednak, że wypływ ATP z erytrocytów odbywa się również, jak dotąd niezidentyfikowanymi drogami, niezależnymi od paneksyn i kanałów VDAC. Do potencjalnych mechanizmów uwalniania ATP z erytrocytów należy również hemoliza [40, 55, 57].

Regulacja zaopatrzenia tkanek w tlen

Zapewnienie optymalnego ukrwienia odbywa się przez modulację działania dwóch efektorów, jakimi są mięsień sercowy oraz mięśnie gładkie naczyń krwionośnych. W odpowiedzi na zapotrzebowanie metaboliczne zmienia się ilość krwi tłoczonej przez serce oraz szerokość naczyń krwionośnych. Regulacja ukrwienia odbywa się z udziałem czynników nerwowych i humoralnych. Mechanizmy regulacyjne mają charakter ogólnoustrojowy (układ nerwowy i hormonalny), miejscowy (autoregulacja, metabolity o działaniu wazodylatacyjnym i wazokonstrykcyjnym) i zachodzą z udziałem nerwów okołonaczyniowych, hormonów i komórek śródbłonka i mięśniówki naczyń. Za regulację nerwową odpowiada układ autonomiczny, wysyłający działające antagonistycznie, współczulne i przywspółczulne zakończenia nerwowe do tętniczek, naczyń oporowych i wszystkich naczyń zawierających mięśnie gładkie. Współczulne nerwy noradrenergiczne zwiększają napięcie naczyń, podczas gdy przywspółczulne nerwy cholinergiczne działają rozkurczająco za pośrednictwem mediatorów, takich jak tlenek azotu (NO), uwalnianych przez komórki śródbłonka bądź same komórki mięśniówki naczyń [5, 37]. Na zakończeniach nerwów współczulnych uwalniana jest noradrenalina (NA) oraz ATP, działający synergistycznie, jako kotransmiter. ATP działa tu za pośrednictwem receptorów P2X, wywołując wraz z NA skurcz mięśniówki naczyń [7].

Endokrynowa, ogólnoustrojowa regulacja napięcia naczyniowego odbywa się z udziałem hormonów o działaniu rozkurczającym, takich jak kininy, VIP, przedsionkowy peptyd natriuretyczny (ANP) i naczynioskurczowym – wazopresyna, adrenalina, angiotensyna II [47]. Regulacja miejscowa natomiast odbywa się na zasadzie autoregulacji miogennej (zdolność ścian naczyń do zmiany napięcia w zależności od mechanicznej siły rozciągającej ścianę) oraz z udziałem parakrynowych czynników wazoaktywnych wydzielanych przez komórki śródbłonka naczyniowego [16, 24]. Zalicza się do nich mediatory o działaniu wazodylatacyjnym i wazokonstrykcyjnym, uwalniane pod wpływem stymulacji nerwowej, działania hormonów, substancji pochodzenia płytkowego oraz w wyniku działania siły ścinającej. Do śródbłonkowych czynników rozluźniających (EDRF) należą tlenek azotu, a także prostacyklina (PGI2) i czynnik hiperpolaryzujący pochodzenia śródbłonkowego (EDHF). Natura EDHF pozostaje nieznana. Jego rolę przypisuje się jonom potasu, kwasom epoksyeikozatrienowym (EET) i nadtlenkowi wodoru. Wydaje się też, że za skutki przypisywane EDHF mogą odpowiadać mioepitelialne połączenia szczelinowe [49, 73]. Do śródbłonkowych czynników skurczających (EDCF) zalicza się: endotelinę-1, angiotensynę, tromboksan A2 (TxA2), prostaglandynę H2 i reaktywne formy tlenu (ROS) [65]. Pozakomórkowy ATP pochodzący ze światła naczyń, uwalniany pod wpływem siły ścinającej przez komórki śródbłonka, agregujące płytki, a także przez erytrocyty, wpływa na komórki śródbłonka głównie za pośrednictwem receptorów P2Y działając w tym wypadku wazodylatacyjnie, przez stymulację uwalniania czynników rozkurczających pochodzenia śródbłonkowego (EDRF) [14]. Komórki śródbłonka pośredniczą w stymulacji rozkurczu mięśni gładkich powodującego poszerzenie światła naczyń, równoważąc wazokonstrykcyjne działanie noradrenaliny i uwalnianego wraz z nią ATP z okołonaczyniowych zakończeń nerwowych układu współczulnego. Zatem ATP, w zależności od miejsca uwalniania i typu receptorów na docelowych komórkach, ma działanie wazodylatacyjne lub wazokonstrykcyjne [9, 42].

Znaczenie śródbłonka w kontroli napięcia ścian naczyń krwionośnych dobrze ilustruje działanie nukleotydów w sytuacji, gdy ulega on uszkodzeniu. W nienaruszonym naczyniu pozakomórkowy ATP, ADP i UTP są rozkładane przez zakotwiczone w błonie komórek śródbłonka ENTPD-azy. AMP, jest dalej rozkładany przez ekto-5ʹnukleotydazę (CD73) do adenozyny, która działa na płytki za pośrednictwem receptorów P1 hamując ich agregację. Działanie hamujące wywierają na płytki również NO i PGI2, uwalniane przez komórki śródbłonka pod wpływem ATP. Uszkodzenie śródbłonka powoduje, że nukleotydy uwalniane przez aktywowane płytki, działając autokrynowo, za pośrednictwem płytkowych receptorów P2Y1, P2Y12 i P2X1, będą stymulować ich dalszą agregację. Adhezji i agregacji płytek pod wpływem uszkodzenia śródbłonka towarzyszy akumulacja leukocytów, które również mogą uwalniać ATP, ADP i UTP. Nukleotydy, które przy nienaruszonym śródbłonku miałyby działanie rozkurczające, promują skurcz naczyń działając bezpośrednio na komórki mięśniowe, przez receptory P2 na ich powierzchni, mogąc się przyczyniać do miejscowego zahamowania przepływu krwi, a także stymulując proliferację miocytów i przebudowę ściany naczynia [14].

Opisane dotąd mechanizmy regulacyjne nie wyjaśniają zdolności organizmu do utrzymania precyzyjnej równowagi między podażą a popytem na tlen w dynamicznie zmieniających się warunkach. Uważa się, że wymaga to istnienia miejscowego „czujnika poziomu tlenu” (oxygen sensor), który wykrywałby stan zachwiania tej równowagi i uruchamiał odpowiedź w postaci rozszerzenia naczyń krwionośnych i wzrostu przepływu krwi w rejonie o zwiększonym zużyciu tlenu [32]. Mimo że miejscowe poszerzenie światła naczyń w odpowiedzi na stan hipoksji po raz pierwszy opisano już w 1879 r. przez Roya i Browna [72], jak dotąd nie udało się jednoznacznie określić, co pełni rolę takiego „czuj­nika” [38]. Część badaczy jego rolę przypisuje samej hemoglobinie. Przejście cząsteczki hemoglobiny z konformacji R (relaxed) do konformacji T (tense) na skutek utraty tlenu miałoby inicjować sygnał wazodylatacyjny [31]. Istnieją przynajmniej trzy hipotezy próbujące wyjaśnić naturę tego sygnału. Dwie z nich, hipoteza sformułowana przez Stamlera i wsp. [45] i postawiona przez Gladwina i wsp. [21] główną rolę w tym procesie przypisują tlenkowi azotu. Uwolnienie tlenu przez hemoglobinę miałoby powodować wypływ NO z erytrocytu i w następstwie rozszerzenie naczyń. Trzecia, funkcję kluczowej cząsteczki w sygnalizacji stanu hipoksji przypisuje ATP uwalnianemu przez erytrocyty, również w rezultacie uwalniania tlenu przez hemoglobinę [38].

Według hipotezy zaproponowanej przez Stamlera i wsp. w płucach, do których hemoglobina dociera w konformacji T, pod wpływem zmiany konformacyjnej dokonującej się w wyniku przyłączenia tlenu dochodzi do S-nitrozylacji hemoglobiny. NO jest w ten sposób transportowany na dalsze odległości w postaci S-nitrozooksyhemoglobiny (SNO-Hb), która osiąga docelowe narządy obwodowe w konformacji R. Utrata tlenu w przedwłośniczkowych naczyniach oporowych powoduje przejście z konformacji R do T, co wiąże się z uwolnieniem tlenku azotu działającego rozkurczająco na naczynia krwionośne. Uwalniany NO może docierać do komórek śródbłonka bezpośrednio lub w postaci małocząsteczkowych S-nitrozotioli, takich jak GSNO (S-nitrozoglutation) uwalnianych przez erytrocyty [45].

Znaczenie fizjologiczne tego mechanizmu zakwestionowali Gladwin i wsp., którzy zaproponowali alternatywny model. Przypisuje się w nim deoksyhemoglobinie aktywność regulowanej allosterycznie reduktazy azotynowej, która redukuje azotyny do tlenku azotu, umożliwiając w ten sposób erytrocytom udział w rozkurczu naczyń krwionośnych w odpowiedzi na spadek poziomu tlenu. Tym samym to azotyny, a nie S-nitrozotiole miałyby pełnić rolę najważniejszych prekursorów aktywnego biologicznie tlenku azotu [21].

Trzecia hipoteza, zaproponowana przez Bergfelda i Forrestera [2], rozwinięta przez Ellsworth i 
Sprague’a, omówiona szczegółowo niżej, zakłada, że przejście hemoglobiny ze stanu R do T skutkuje wypływem ATP z erytrocytów, który następnie wiązany przez receptory nukleotydowe na powierzchni komórek śródbłonka wywołuje rozkurcz naczyń [33, 34]. Pytanie, który z zaproponowanych mechanizmów funkcjonuje in vivo lub, jeśli znaczenie fizjologiczne ma więcej niż jeden z nich – który i w jakich warunkach pełni podstawową rolę, pozostaje jak na razie bez odpowiedzi.

ATP uwalniany przez erytrocyty jako regulator napięcia naczyń krwionośnych

Zmiany średnicy naczyń oporowych pod wpływem aktywności autonomicznego układu nerwowego i działania mediatorów wazoaktywnych pochodzenia śródbłonkowego nie wydają się wystarczająco precyzyjne, by zapewnić optymalnie zaopatrzenie w tlen w warunkach dynamicznie zmieniającego się nań zapotrzebowania w pracujących mięśniach szkieletowych, mózgu i innych aktywnych metabolicznie narządach [25, 39]. Koncepcja przypisująca ATP rolę głównego miejscowego regulatora zaopatrzenia tkanek w tlen zakłada, że związek ten jest w kontrolowany w sposób uwalniany przez krążące erytrocyty [2, 35]. Do jego wypływu miałoby dochodzić pod wpływem spadku wysycenia hemoglobiny tlenem oraz działania siły ścinającej i stymulacji mechanicznej erytrocytów podczas przeciskania się tych komórek przez zwężone naczynia oporowe i kapilary, szczególnie w warunkach podwyższonego tempa przepływu krwi [66, 87].

Jako mechanizm inicjujący szlak transdukcji sygnału zaangażowany w uwalnianie ATP pod wpływem obniżonego poziomu tlenu zaproponowano zmiany konformacyjne w cząsteczkach hemoglobiny [44]. Zmiany te, dotyczące szczególnie cząsteczek hemoglobiny umiejscowionych w bezpośrednim sąsiedztwie błony erytrocytu, będące następstwem uwolnienia tlenu, prowadzą do deformacji błony komórkowej i aktywacji białka Gi, co powoduje aktywację cyklazy adenylanowej i wzrost poziomu cyklicznego AMP. Poziom cAMP jest regulowany przez swoiste fosfodiesterazy (PDE3B) hydrolizujące ten związek do 5ʹ-AMP. Pod wpływem cAMP dochodzi do aktywacji kinazy białkowej A (PKA), uruchomienia CFTR i otwarcia paneksonu, co bezpośrednio umożliwia wypływ ATP do przestrzeni zewnątrzkomórkowej (ryc. 2)

Ryc. 2. Proponowany mechanizm regulacji ukrwienia tkanek z udziałem ATP uwalnianego przez erytrocyty pod wpływem niskiego pO2; szczegóły w tekście

Do uwalniania ATP przez erytrocyty może też dochodzić pod wpływem PGI2 uwalnianej przez komórki śródbłonka w wyniku działania siły ścinającej, jak wykazano w doświadczeniach z użyciem analogów PGI2 (iloprost, UT-15C). W procesie tym mogą pośredniczyć receptory prostacykliny związane z białkiem G, obecne w błonie erytrocytu [4, 82]. PGI2 uwolniona pod wpływem siły ścinającej, oprócz tego, że oddziałuje bezpośrednio na naczynia krwionośne, prowadząc od wazodylatacji, jednocześnie działa na erytrocyty, stymulując je do uwalniania ATP, który wpływa na ścianę naczyń krwionośnych, wzmacniając dodatkowo działanie wazodylatacyjne [35]. Pod wpływem PGI2 miałoby dochodzić do aktywacji szlaku, w którym wypływ ATP odbywa się przez kanały VDAC, a więc bez udziału kanałów paneksynowych [84].

Miejscowe działanie ATP

ATP uwolniony przez erytrocyty do światła naczynia krwionośnego może działać na receptory P2Y na powierzchni komórek śródbłonka, których pobudzenie aktywuje kaskadę fosfoinozytolową [32]. Związane z receptorem białko Gq/11 aktywuje fosfolipazę C do uwolnienia 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP­3) wiążącego się z receptorem IP3 w błonie retikulum endoplazmatycznego. Pobudzenie tego receptora uwalnia zmagazynowane w ER jony wapnia, a to prowadzi do wzrostu poziomu Ca2+ w cytoplazmie komórki śródbłonka. Powoduje to dalszy napływ jonów Ca2+ przez błonowe kanały wapniowe aktywowane w wyniku opróżnienia wewnątrzkomórkowych magazynów wapnia (SOC), następuje stymulacja śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS) do wytwarzania NO. Tlenek azotu dyfunduje do sąsiadującej ze śródbłonkiem komórki mięśnia gładkiego ściany naczynia krwionośnego, gdzie działa na część hemową rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej (sGC) powodując jej aktywację i wzrost stężenia cGMP w komórce. Pobudza to aktywność zależnych od cGMP kinaz białkowych, prawdopodobnie fosforylujących pewne białka mięśnia, co ostatecznie powoduje rozkurcz. Ponadto, NO działa na białko Gi w błonie erytrocytów, ograniczając dalszy wypływ ATP z tych komórek. Pod wpływem jonów wapniowych w komórkach śródbłonka aktywacji ulega również cytozolowa fosfolipaza A2 (cPLA2), która uwalnia kwas arachidonowy z fosfolipidów błonowych, będący prekursorem prostacykliny (PGI2) i czynnika hiperpolaryzującego pochodzenia śródbłonkowego (EDHF) [59]. PGI2 działa na komórki mięśni gładkich naczyń, za pośrednictwem receptora IP, stymulując cyklazę adenylanową do syntezy cAMP. Wzrost stężenia cAMP pod wpływem PGI2 wraz ze wzrostem cGMP zainicjowanym działaniem NO działają rozkurczająco na komórkę mięśniówki naczyń. Podobnie EDHF, działając za pośrednictwem kanałów potasowych aktywowanych jonami wapnia (KCa2+, calcium-activated potassium channels) w błonie komórki mięśniowej, wywołuje wypływ jonów K+ powodujący hyperpolaryzację i rozkurcz komórki.

Wydaje się, że ATP uwolniony z erytrocytów działając autokrynowo może również stymulować syntezę i uwalnianie przez same erytrocyty kwasów epoksyeikozatrienowych (EET), o działaniu wazodylatacyjnym [46]. W szlaku tym ATP uwalniany z erytrocytów aktywuje receptory P2X7 na powierzchni erytrocytu, powodując napływ jonów Ca2+ do komórki, aktywację fosfolipazy A2 (PLA2) i syntezę oraz wydzielanie EET. Kwasy EET działają na komórki warstwy mięśniowej naczynia, stymulując otwarcie kanałów KCa2+, powodując ich hiperpolaryzację i rozkurcz [26].

Wypływ ATP z erytrocytów mógłby być regulowany na zasadzie oddziaływań autokrynowych. Postuluje się istnienie pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego, w której ADP powstały w wyniku hydrolizy uwolnionego przez erytrocyt ATP aktywuje receptor P2Y13 na powierzchni erytrocytu, indukując spadek poziomu cAMP w cytoplazmie krwinki i hamowanie wypływu ATP [88].

Należy uwzględniać, że przebieg odpowiedzi na ATP może przebiegać różnie, w zależności od rodzaju naczynia, w którym dochodzi do jego uwolnienia. Rodzaj mediatorów uwalnianych w odpowiedzi na pozakomórkowy ATP zależy od typu receptora, który uległ aktywacji i szlaku sygnałowego funkcjonującego w danym naczyniu krwionośnym [14, 32].

Aby mechanizm regulacyjny mógł skutecznie zwiększać perfuzję dokładnie w miejscu podwyższonego zapotrzebowania na tlen, odpowiedź na bodziec inicjujący rozszerzenie naczynia musiałaby się rozprzestrzeniać w górę w przebiegu naczyń krwionośnych. Występowanie takiego zjawiska pod wpływem ATP wykazano eksperymentalnie [19, 62]. Podanie ATP po stronie żylnej naczyń zaopatrujących mięsień cofacz worka policzkowego chomika rozszerzało światło tętniczek doprowadzających i powodowało wzrost przepływu krwi obserwowany w naczyniach włosowatych. Działanie to było hamowane przez L-NAME (ester metylowy Nω-nitro-L-argininy), inhibitor syntazy tlenku azotu, co wskazuje, że pośredniczy w nim NO. Sposób w jaki dochodzi do obserwowanego rozprzestrzeniania się działania wazodylatacyjnego pozostaje nieznany. Autorzy podejrzewają, że mogłyby uczestniczyć w nim połączenia szczelinowe między komórkami śródbłonka lub połączenia mioepitelialne w obrębie ściany naczyń, którymi może się rozprzestrzeniać hiperpolaryzacja wywołana wypływem jonów K+ [19].

Występowanie propagacji efektu wazodylatacyjnego w górę względem kierunku przepływu krwi, od miejsca, w którym dochodzi do wykrycia spadku poziomu tlenu, stanowi o przewadze koncepcji zakładającej rolę ATP uwalnianego przez erytrocyty w miejscowej regulacji zaopatrzenia w tlen nad wspomnianymi wyżej propozycjami próbującymi wyjaśnić to zjawisko. Podobnego działania nie zaobserwowano ani dla S-nitrozotioli wskazywanych przez Stamlera i wsp. jako prekursory NO stymulującego wazodylatację pod wpływem hipoksji ani dla azotynów, podstawowych w hipotezie Gladwina i wsp., w której fizjologiczne znaczenie w generacji NO przypisuje się deoksyhemoglobinie, wykazującej aktywność reduktazy azotynowej [21, 32, 45].

Podsumowanie

Hipoteza przypisująca ATP uwalnianemu przez erytrocyty znaczenie w regulacji zaopatrzenia mięśni szkieletowych lub innych tkanek w tlen, jak dotąd nie została w pełni potwierdzona w badaniach in vivo. W modelu rozwiniętym przez Ellsworth i Sprague’a, jak przyznają sami autorzy, szczególnym wyzwaniem jest wyjaśnienie w jaki sposób spadek wysycenia hemoglobiny tlenem przekłada się na aktywację białka Gi [33]. Ustalenie drogi jaką ATP opuszcza erytrocyty oraz rola CFTR będą również wymagały dodatkowych badań. Udział kanałów błonowych w uwalnianiu ATP przez erytrocyty budzi kontrowersje. Otwarcie kanałów zdolnych do uwolnienia cząsteczki ATP nieuchronnie musiałoby się wiązać z gwałtownym napływem jonów Ca2+ i Na+ do wnętrza komórki [40]. Rola ATP uwalnianego przez kanały paneksynowe w regulacji perfuzji mięśni szkieletowych została niedawno zakwestionowana w badaniach na mysich mutantach Panx1-/- [50]. Myszy Panx1-/- w testach wytrzymałości na wymuszony wysiłek fizyczny (acute forced exercise capacity test) nie wykazywały różnic względem kontrolnych myszy szczepu dzikiego. Autorzy cytowanej pracy potwierdzają również sygnalizowany wcześniej [79] udział hemolizy w stymulowanym szokiem hipotonicznym wypływie ATP z erytrocytów oraz brak uwalniania ATP pod wpływem wzrostu wewnątrzkomórkowego poziomu cAMP. Wykazują w badaniach in vitro, że w próbkach stymulowanych analogiem cAMP (8Br-cAMP), jeśli wykluczyć wpływ hemolizy, nie dochodzi do wzrostu zewnątrzkomórkowego poziomu ATP, zarówno u myszy szczepu dzikiego jak i Panx1-/-. Wreszcie, potwierdzają brak wypływu ATP stymulowanego wzrostem poziomu cAMP zarówno przez hamowanie jego degradacji, jak i stymulację AC. Ustalenie udziału ATP uwalnianego przez erytrocyty w kontroli zaopatrzenia tkanek w tlen będzie zatem wymagało dalszych badań rozstrzygających pojawiające się sprzeczności.

Pełna treść artykułu