Abstrakt

Krztusiec jest zakaźną chorobą dróg oddechowych wywoływaną przez bakterie Gram-ujemne z gatunku Bordetella pertussis. Pomimo powszechnych szczepień przeciwkrztuścowych, w ostatnich latach obserwuje się wzrost zachorowań na krztusiec. Pełnokomórkowe szczepionki przeciwkrztuścowe są skuteczne, lecz reaktogenne, dlatego obecnie stosowane, ulepszone szczepionki zawierają wyłącznie izolowane i zinaktywowane antygeny B. pertussis. Mniejsza odporność wywołana szczepionkami bezkomórkowymi wskazuje, że są one jednak pozbawione ważnych ochronnych antygenów B. pertussis. Szczepionka zawierająca zinaktywowaną toksynę krztuśca pobudza wytwarzanie przeciwciał neutralizujących toksynę, lecz nie prowadzi do destrukcji komórki bakteryjnej. Ze względu na to, że w patogenezę krztuśca zaangażowanych jest wiele czynników wirulencji, oprócz aktywności neutralizującej toksynę, w odporności przeciwkrztuścowej niezbędna jest bezpośrednia aktywność bakteriobójcza. Lipooligosacharyd, jest głównym składnikiem powierzchniowym B. pertussis i celem bakteriobójczych przeciwciał podczas zakażenia. Ze względu na endotoksyczność, LOS jest usuwany z bezkomórkowych szczepionek chroniących przeciwko B. pertussis, dlatego też szczepionka otrzymana z wykorzystaniem składników LOS nie jest dotychczas stosowana. Nietoksyczna część LOS B. pertussis – oligocukier w połączeniu z białkiem nośnikowym, stanowi immunogenny glikokoniugat o potencjalnym zastosowaniu jako składnik szczepionki przeciwkrztuścowej.W pracy omówiono przyczyny wzrostu zachorowań na krztuśca. Przedstawiono sytuację epidemiologiczną krztuśca na przestrzeni kilkudziesięciu lat świadczącą o nieskuteczności obecnie stosowanych, bezkomórkowych szczepionek przeciwkrztuścowych. Porównano procesy odpornościowe wywołane zakażeniem B. pertussis i indukowane szczepionkami przeciwkrztuścowymi. Wykazano istotny udział przeciwciał bakteriobójczych skierowanych przeciwko lipooligosacharydowi B. pertussis w wywołaniu skutecznej ochrony odpornościowej. Opisano immunogenność i właściwości ochronne antygenów glikokoniugatowych zawierających oligocukrowy składnik LOS B. pertussis sugerując jego zastosowanie jako niezbędnego składnika szczepionki przeciwkrztuścowej.

Wstęp

Krztusiec najczęściej występuje u  niemowląt oraz małych dzieci, u  których objawia się długotrwałym, napadowym kaszlem („whooping cough”) z  towarzyszącymi wymiotami, sinicą i bezdechem. W epoce przedszczepionkowej, powszechnie występujący krztusiec był jedną z najczęstszych przyczyn zgonów wśród dzieci do 9 roku życia [9]. Od wielu lat krztuścowi zapobiega się przez powszechne szczepienia, jednak w ostatnich latach obserwuje się wzrost zapadalności na tę chorobę. Badania przyczyn wzrostu zachorowań na krztusiec oraz identyfikacja składników B. pertussis niezbędnych w ochronnej odpowiedzi immunologicznej są prowadzone w celu zdefiniowania optymalnego składu antygenowego skutecznej szczepionki przeciwkrztuścowej.

Stan epidemiologiczny krztuśca

Pomimo powszechnych szczepień, krztusiec nadal stanowi na świecie jedną z 10 głównych przyczyn zgonów wśród dzieci poniżej 5 roku życia [5]. Według najnowszych ustaleń Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), B. pertussis jest odpowiedzialna za około 300 tys. przypadków śmiertelnych wśród dzieci każdego roku. W 2008 r. odnotowano 16 mln przypadków krztuśca na całym świecie, natomiast 195 tys. dzieci zmarło z powodu tej choroby [9,78]. Największa liczba przypadków śmiertelnych z powodu krztuśca występuje w południowej Azji oraz Afryce, w krajach o niskim poziomie zaszczepienia [5]. W ciągu ostatnich lat pojawiły się jednak lokalne epidemie krztuśca w Australii, Irlandii, Anglii i Stanach Zjednoczonych, a zatem w krajach, w których od kilkudziesięciu lat stosowana jest powszechna immunizacja przeciwkrztuścowa.

Według danych statystycznych Centrum Zwalczania i Zapobiegania Chorobom (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) wprowadzenie pełnokomórkowej szczepionki przeciwkrztuścowej w Stanach Zjednoczonych w 1940 r. spowodowało, że liczba przypadków zachorowań przekraczająca 100 tys. rocznie spadła poniżej 10 tys. w 1965 r. (ryc. 1). Od roku 1980 liczby zaczęły stopniowo wzrastać i do 2013 r. odnotowywano więcej niż 24 tys. przypadków rocznie. Szczepionkę bezkomórkową wprowadzono w tym kraju do powszechnego użytku w latach 90 ub.w. Obecnie krztusiec jest chorobą powracającą w krajach, w których od wielu lat są stosowane ochronne szczepienia przeciwkrztuścowe [5].

W Stanach Zjednoczonych jest to choroba endemiczna ze szczytem zachorowań występującym co 2-5 lat. W 2010 r. w Kalifornii odnotowano 7200 przypadków krztuśca, w tym 10 było śmiertelnych wśród niemowląt [79]. Wówczas liczba zachorowań była tam najwyższa od 1947 r. [34]. W 2014 r. liczba wzrosła do 11164 przypadków. W roku 2012 epidemia krztuśca wybuchła również w Waszyngtonie [11]. W Stanach Zjednoczonych w 2014 r. odnotowano 48277 przypadków krztuśca. W krajach Europy Zachodniej krztusiec postrzegany jest również jako choroba powracająca, obecnie z częstością zakażeń wynoszącą 1-9% [56]. W Polsce, na podstawie danych Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – PZH, zaobserwowano od połowy lat 90 ub.w. wzrost zachorowań na krztusiec (ryc. 2). W 2013 r. stwierdzono 2185 przypadków, a w 2012 roku wykazano najwyższą prawie od 40 lat liczbę zachorowań, tj. 4684. Był to około trzykrotny wzrost liczby zachorowań w porównaniu z rokiem 2011 (1669 przypadków) [59,84].

Zwiększająca się liczba zachorowań na krztusiec w  latach 1980-2000 w  Stanach Zjednoczonych wynikała pośrednio z  pojawienia się ruchów antyszczepionkowych, które przeciwstawiały się stosowaniu szczepionki przeciwkrztuścowej z  powodu obserwowanych działań niepożądanych [52]. Działania te oraz reaktogenność pełnokomórkowej szczepionki (wP) przyczyniły się do wprowadzenia szczepionek bezkomórkowych (aP) [9,52,78]. Problem nawrotu krztuśca w  następstwie wprowadzenia szczepionek aP, może być związany z niewystarczającą i krótkotrwałą odpornością wywołaną przez te szczepionki [13]. Długoterminowe badania odporności poszczepiennej wykazały, że szczepionki aP są mniej skuteczne niż pełnokomórkowe [13,14,26,39,40,41,63,78]. Za powód zwiększającej się zachorowalności na krztusiec uznaje się również pojawienie się zmienionych antygenowo szczepów B. pertussis, przed którymi nie chronią stosowane szczepionki [55,65]. Rosnąca liczba odnotowanych przypadków krztuśca wynika także ze stosowania w diagnostyce zakażeń ulepszonych metod wykrywania B. pertussis (m.in. zastosowanie PCR i badań serologicznych w detekcji bakterii). Rozważanych jest wiele przyczyn, jednak wzrost zachorowań na krztusiec w przypadku pojawienia się populacji o zbyt małym odsetku osób zaszczepionych lub o obniżonej odporności przeciwkrztuścowej może doprowadzić do epidemii.

Największa liczba zachorowań na krztusiec występuje wśród niemowląt. W  epidemiologii krztuśca obserwuje się także wzrost zachorowań wśród osób w wieku 9 lat i powyżej [4]. W USA odsetek przypadków krztuśca u dzieci w wieku 10 lat zwiększał się stopniowo od 15% w  latach 1977-1979 do 49% w  latach 1997-2000 [61]. Występowanie zachorowań na krztusiec wśród wszystkich grup wiekowych, potwierdza krótkotrwałą odporność przeciwkrztuścową wywołaną zarówno zakażeniem bakteriami, jak i  indukowaną szczepionkami. Z tego powodu w programie szczepień przeciwkrztuścowych w wielu krajach wprowadzono dawkę przypominającą [25,28]. W Polsce od 2005 r. zaobserwowano poprawę sytuacji epidemiologicznej krztuśca, związaną z wprowadzeniem w 2003 r. szczepionki przypominającej u dzieci w 6 roku życia. Liczba przypadków zachorowań na krztusiec może być zaniżona ze względu na to, że wśród nastolatków oraz osób dorosłych, objawy krztuśca często przypominają wirusowe zakażenie dróg oddechowych. W takich przypadkach, szeroko akceptowane kryterium kliniczne – napadowy kaszel jest nieodpowiednim wskaźnikiem zakażenia B. pertussis. Diagnoza krztuśca oparta jedynie na objawach klinicznych sprawia, że 1 na 5 przypadków jest błędnie identyfikowany, co przyczynia się do rozprzestrzeniania krztuśca w populacji, szczególnie wśród nieuodpornionych dzieci poniżej 1 roku życia [75]. Rozwiązaniem może być rozszerzenie programu szczepień na wszystkie grupy wiekowe [14].

Próby ulepszenia szczepionek przeciwkrztuścowych, polegają na poszerzaniu ich właściwości ochronnych, w celu wywołania długotrwałej i skutecznej odporności poszczepiennej. Modyfikacje składu szczepionek są możliwe dzięki postępom w poznaniu mechanizmów wirulencji B. pertussis. W  ulepszaniu szczepionek są także pomocne informacje wynikające z odczytania sekwencji całego genomu B. pertussis szczepu Tohama [60].

Krztusiec – molekularne podstawy patogenezy i czynniki wirulencji Bordetella pertussis

Zakażenie B. pertussis rozpoczyna się od kolonizacji dróg oddechowych gospodarza (ryc. 3, kolejne etapy oznaczano A-E) [19,69]. Bakteria oddziałuje z komórkami nabłonka błony śluzowej wykorzystując czynniki wirulencji czego wynikiem jest adhezja B. pertussis do komórek urzęsionych (A). Do adhezyn B. pertussis należą białka – hemaglutynina włókienkowa (FHA), fimbrie (Agg, Fim) i pertaktyna (PRN). FHA i fimbrie wiążą usulfonowane cukry rozpowszechnione na komórkach dróg oddechowych i  w  wydzielinach. Bakteria wytwarza również białkowe toksyny ułatwiające adhezję i transmisję, do których należą toksyna krztuśca (PT), cyklaza adenylowa (ACT, AC-Hly) i system wydzielniczy typu III (T3SS). PT ułatwia adhezję B. pertussis do makrofagów naśladując eukariotyczne P- i E-selektyny i zwiększając ekspresję receptora dopełniacza typu 3 (CR3), do którego wiąże się FHA. Peptydoglikan uwalniany ze ściany komórkowej B. pertussis – cytotoksyna tchawicza (TCT) oraz składnik zewnętrznej błony komórkowej – lipooligosacharyd (LOS) działając synergistycznie niszczą urzęsione komórki nabłonka układu oddechowego przez inicjację uwalniania reaktywnych form tlenu (ROS), takich jak tlenek azotu (NO˙), w wyniku aktywacji syntazy tlenku azotu typu II indukowanej interleukiną 1 (iNOS) w sąsiadujących komórkach nieurzęsionych – komórkach wydzielających śluz (B) [24]. Uszkodzone i sparaliżowane rzęski nie usuwają śluzu, który gromadzi się w drogach oddechowych uniemożliwiając mechaniczne usuwanie bakterii. LOS aktywuje szlak sygnałowy TLR-4 wywołując także wytwarzanie cytokin prozapalnych (IL-1, IL-6). TCT hamuje syntezę DNA w komórkach nabłonkowych tchawicy powodując cytotoksyczne zmiany w komórkach urzęsionych. Toksyna dermonekrotyczna (DNT) – polipeptyd cytoplazmatyczny, który wywołuje stan zapalny, skurcz naczyń krwionośnych oraz patologiczne zmiany martwicze w miejscu kolonizacji. B. pertussis jest również zdolna do bezpośredniej inwazji komórek nabłonkowych (C) za pośrednictwem FHA, która zwiększając ekspresję cząsteczki adhezyjnej ICAM-1 umożliwia wniknięcie bakterii do komórki. Podobnie do innych patogenów błon śluzowych, B. pertussis również tworzy biofilm na powierzchni nabłonka oddechowego (D), który powstaje w następstwie ekspansji klonalnej przy- łączonych bakterii tworzących makrokolonie w materiale składającym się z  egzopolisacharydów, białek, lipidów i DNA. Utworzenie biofilmu ułatwia komórkom bakteryjnym kolonizację i przeżycie w drogach oddechowych, chroniąc przed siłami obronnymi organizmu. ACT oraz T3SS wraz z białkiem efektorowym BteA zaburzają wewnątrznabłonkowe szlaki sygnałowe wywołując cytotoksyczność, która zwiększa dostępność alternatywnych źródeł żelaza (Fe+3) niezbędnych w procesach komórkowych bakterii oraz ekspozycję miejsc wiążących krypt w błonie podstawnej, pozwalając na silniejsze przyłączenie patogenu (E).

Adhezyny i toksyny B. pertussis działając synergistycznie umożliwiają bakterii kolonizację nosogardła, tchawicy i płuc gospodarza oraz wywołanie uogólnionych zmian zapalnych i patologicznych. Składniki te powodują unieczynnienie ruchu rzęsek prowadzące do niezdolności usuwania śluzu z  dróg oddechowych, co jest główną przyczyną długotrwałego kaszlu. Większość z czynników wirulencji B. pertussis jest jednocześnie antygenami dla przeciwciał i komórek T umożliwiając eliminację patogenu z organizmu.

Podczas zakażeń dróg oddechowych, B. pertussis wiążąca urzęsione komórki nabłonka, jest rozpoznawana przez rezydujące i infiltrujące komórki wrodzonego układu odpornościowego [34]. Receptory PRR (pattern recognition receptor) tych komórek rozpoznają ewolucyjnie konserwatywne składniki B. pertussis. I tak receptor Toll- -like 4 (TLR-4) komórek dendrytycznych (DC) wiąże lipooligosacharyd B. pertussis. Antygeny immunomodulujące B. pertussis – LOS, PT, ACT i TCT wywołują wytwarzanie cytokin prozapalnych, głównie IL-1 i TNF-α, które stymulując fagocytozę zapoczątkowują eliminację bakterii. Komórki dendrytyczne przetwarzają i prezentują antygeny bakteryjne komórkom T. Wytwarzanie interleukiny 12 przez komórki odporności wrodzonej wywołuje polaryzację odpowiedzi komórek T w kierunku komórek T pomocniczych typu 1 (Th1), natomiast IL-1β i IL-23 powodują różnicowanie do komórek Th17. IFN-γ jest wydzielany przez DC oraz komórki NK w początkowej fazie zakażenia, a następnie przez Th1 stymuluje rekrutację makrofagów i neutrofilów oraz aktywuje komórki B do wytwarzania przeciwciał opsonizujących i wiążących dopełniacz (IgG2a). Opsonizowane i nieopsonizowane bakterie są wiązane przez neutrofile i makrofagi, a następnie zabijane w wyniku działania reaktywnych form tlenu i azotu.

W zakażeniu wywołanym B. pertussis stosuje się terapię antybiotykową [9]. Erytromycyna jest zazwyczaj stosowana, gdy toksyny wydzielone przez bakterię wywoały już miejscowe oraz układowe uszkodzenia, które zagrażają życiu. Wynika to z tego, że choroba zwykle jest diagnozowana na podstawie objawów klinicznych (długotrwały, napadowy kaszel) [9,31,37,53,81]. Erytromycyna zastosowana w fazie napadowej krztuśca usuwa bakterie jedynie z górnych dróg oddechowych, zmniejszając transmisję, lecz nie zmienia przebiegu choroby [61,78]. Rozwiązaniem jest zapobieganie zakażeniom B. pertussis przez immunizację. Powszechna i skuteczna immunizacja chroniąca przeciwko B. pertussis, pozwoli uzyskać kontrolę nad infekcją. Badania nad patogenezą krztuśca umożliwiają lepsze zrozumienie mechanizmów wirulencji B. pertussis i ulepszania szczepionek przeciwkrztuścowych w celu skutecznego zapobiegania zakażeniom i transmisji tej bakterii [31,52,62,64,70].

Szczepionki przeciwkrztuścowe

Szczepionkę przeciwkrztuścową wprowadzono do powszechnego użycia w 1940 r. Objęcie szczepieniami ochronnymi mieszkańców wielu krajów, spowodowało gwałtowny spadek liczby zachorowań i śmiertelności związanej z krztuścem. Spadek wynikał wówczas z pojawienia się odporności „stada” („herd immunity”), która występuje, gdy w populacji jest przynajmniej 80% osób zaszczepionych. Zmniejsza się wówczas rezerwuar bakterii B. pertussis i w ten sposób chronione są przed zakażeniem osoby z  niewykształconą odpornością (m.in. niemowlęta).

Szczepionka pełnokomórkowa jest zawiesiną inaktywowanych chemicznie i/lub termicznie bakterii szczepów B. pertussis różniących się typem aglutynogenów 2 i 3 (Agg2 i Agg3). Charakteryzuje się dużą efektywnością (70-90%), lecz jest reaktogenna. Zaobserwowano odczyny miejscowe, takie jak bolesność, obrzęk, rumień w miejscu podania oraz reakcje ogólnoustrojowe o częstości mniejszej niż 1 na 100 podań szczepionki (drgawki gorączkowe, nieprzerwany płacz) i o częstości mniejszej niż 1 na 1000-2000 (zapaść – epizody hipotensyjno-hiporeaktywne). Występowanie encefalopatii, trwałego uszkodzenia mózgu lub ciężkich zaburzeń neurologicznych w następstwie przyjęcia szczepionki pełnokomórkowej nie potwierdzono [78]

Szczepionka przeciwkrztuścowa stosowana powszechnie do immunizacji dzieci w Polsce jest szczepionką peł- nokomórkową skojarzoną z antygenami błonicy i tężca (DTP, DTwP, wP). Początkowo (od 1969 r.) do produkcji szczepionki wykorzystywano 6 wyselekcjonowanych szczepów B. pertussis. Liczbę szczepów zredukowano w 1978 r. do trzech (186, 606 i 629) stosowanych do chwili obecnej [27]. Szczepionki pełnokomórkowe są przygotowywane z namnożonych komórek B. pertussis poddanych inaktywacji chemicznej lub termicznej i odtoksycznieniu formaldehydem. Dawka szczepienna o objętości 0,5 ml zawiera około 20 mld pałeczek krztuśca.

Ze względu na reaktogenność, szczepionki pełnokomórkowe zastąpiono w wielu krajach szczepionkami bezkomórkowymi (acelularnymi), które zawierają oczyszczone i inaktywowane czynniki wirulencji B. pertussis. Dostępnych jest wiele preparatów szczepionek bezkomórkowych (DTaP, aP) różniących się składem i zawartością antygenów [22]. Produkowane są szczepionki monowalentne (zawierające PT), biwalentne (PT, FHA), triwalentne (PT, FHA, PRN) i pentawalentne (PT, FHA, PRN, Agg2, Agg3) [25,52,61,71,78]. Szczepionki te oprócz antygenów krztuśca zawierają inaktywowane toksyny – toksoidy tężca (TTd) i błonicy (DTd). Dostępne są także szczepionki DTaP łączone z antygenami wirusa polio (IPV), Haemophilus influenzae typu b (Hib) lub wirusa zapalenia wątroby typu B (HepB). Toksoid krztuśca użyty w tych preparatach jest otrzymywany w wyniku chemicznej inaktywacji nadtlenkiem wodoru, formaldehydem i/lub glutaraldehydem. Szczepionki DTwP oraz większość z DTaP są podawane w 5 dawkach i są rekomendowane do szczepień dzieci w wieku od 6 tygodni do 6 lat. Program szczepień zakłada immunizację trzykrotną w 6, 10 i 14 tygodniu życia (szczepienia pierwotne, „primary series”) oraz pojedynczą dawkę w drugim roku życia (szczepienie uzupełniające, „booster dose”). Natomiast pierwsza dawka przypominająca jest rekomendowana w 6 roku życia. Odporność przeciwkrztuścowa wykształca się około pierwszego roku życia. W pierwszym roku życia dzieci są zatem szczególnie podatne na zakażenia krztuścem. Rezerwuarem krztuśca mogą być osoby dorosłe, wśród których obserwuje się wzrost zachorowań. Z tego powodu dostępne są także szczepionki bezkomórkowe DTap o zredukowanej zawartości antygenów, które są stosowane jako dawki przypominające u osób dorosłych. Preparaty aP są przygotowane w postaci sterylnych roztworów lub zawierają konserwanty (2-fenoksyetanol, tiomersal). Składniki szczepionek są adsorbowane na wodorotlenku lub solach glinu (adiuwantach). Dodatkowe składniki szczepionek, takie jak formaldehyd, glutaraldehyd, 2-fenoksyetanol, tiomersal, związki glinu mogą wywoływać miejscowe reakcje nadwrażliwości [30].

Badania kliniczne wskazały nietoksyczność, immunogenność (obecność swoistych przeciwciał po upływie 1 miesiąca od podania ostatniej dawki) oraz skuteczność szczepionek bezkomórkowych [10]. W tych badaniach krztusiec definiowano na podstawie objawów klinicznych – wystąpienia kaszlu utrzymującego się przez co najmniej 21 dni z przynajmniej jednym z objawów (napadowy kaszel, „pianie” związane z kaszlem lub wymioty po atakach kaszlu), które następnie potwierdzano w oparciu o hodowlę bakteryjną, serologię oraz epidemiologię. Skuteczność szczepionek Acel-Imune® i Infanrix® była odpowiednio na poziomie 81 i 89%, natomiast porównawczej szczepionki pełnokomórkowej 91-98% [10]. Skuteczność szczepionek ze względu na przyjętą nieprecyzyjną definicję przypadków krztuśca (nie uwzględniano przypadków kaszlu utrzymującego się przez co najmniej 7 dni oraz choroby o łagodnym przebiegu) uważana jest jednak za zawyżoną [14]. Mię- dzynarodowe badania potwierdzają zmniejszającą się skuteczność szczepionek z  każdym rokiem po pięciu dawkach DTaP [40,63] oraz zmniejszającą się odporność po DTap [41]. Wykazano 8-krotny spadek poziomu przeciwciał przeciwko głównemu antygenowi szczepionki aP pomiędzy kolejnymi dawkami szczepień, tj. 3 a  4 dawką [14]. Badania u niemowląt wskazały skuteczność szczepionek bezkomórkowych na poziomie 75-85% [26]. Wykazano także słabszą ochronę przeciwkrztuścową wśród nastolatków w wieku 10-17 lat, którzy otrzymali w dzieciństwie szczepionkę bezkomórkową w porównaniu z tymi, którzy przyjęli szczepionkę pełnokomórkową [39]. Badania te prowadzono podczas epidemii w Kalifornii w latach 2010-2011. Skuteczność szczepionki Tdap u dzieci powyżej 13 roku życia wynosi jedynie 53% [62]. Potencjalne strategie zwiększenia kontroli nad krztuścem obejmują zmiany w programie szczepień, ulepszenie szczepionek bezkomórkowych w celu dodatkowego dawkowania oraz rozwój nowych szczepionek wywołujących długotrwałą odporność.

Ze względu na wieloczynnikowość patogenezy krztuśca nie ustalono dotychczas odpowiedniego markera immunologicznego do oceny skuteczności szczepionek w zapobieganiu krztuścowi [22]. Oznaczenie poziomu przeciwciał nie jest w pełni standaryzowane, dlatego nie jest znaczące w porównywaniu do odporności wywołanej przez szczepionki [78]. Z tego powodu podejmowane są nadal wysiłki w celu identyfikacji i charakterystyki determinant antygenowych B. pertussis oraz poznania antygenów odpowiedzialnych za indukcję ochronnej odporności przeciwkrztuścowej.

Najważniejszym antygenem w szczepionkach przeciwkrztuścowych jest inaktywowana toksyna krztuśca, ponieważ jest najbardziej immunogennym składnikiem B. pertussis oraz czynnikiem wirulencji wywołują- cym większość objawów krztuśca [6,67,80]. Immunizacja szczepionką aP powoduje wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciwko toksynie krztuśca [4,80,81]. Duże stężenie przeciwciał anty-PT wiąże się ze zmniejszoną podatnością na zakażenie tym patogenem [62]. Przeciwciała przeciwko PT chronią dzieci przed rozwojem ciężkiej postaci krztuśca [34]. Skuteczność trójwalentnej szczepionki DTaP jest jednak niższa przeciwko krztuścowi niż przeciwko tężcowi oraz błonicy [73]. W przeciwieństwie do tężca i błonicy, w przypadku których wszystkie objawy chorób wywołują toksyny, w patogenezę krztuśca jest zaangażowanych wiele czynników wirulencji. W celu zapewnienia optymalnej odpowiedzi ochronnej szczepionka przeciwkrztuścowa, powinna być kompozycją wielu ochronnych antygenów B. pertussis. Z powodu ich różnorodności oraz złożonych mechanizmów patogenezy krztuśca, w odporności przeciwkrztuścowej jest wymagane zapewnienie szerokiej ochrony – w postaci neutralizacji toksyn, blokowania adhezji bakterii, opsonizacji, aktywacji dopełniacza i zabijania bakterii.

Antygeny stosowane w  szczepionkach przeciwkrztu- ścowych to białkowe czynniki wirulencji. Białka te, a zwłaszcza toksyna krztuśca i pertaktyna, ulegają dryfowi antygenowemu, który polega na wytwarzaniu nowych, zmienionych antygenowo postaci białek w celu uniknięcia odpowiedzi odpornościowej gospodarza [21,27,55]. Zmienność strukturalna powoduje, że białka szczepów wywołujących krztusiec różnią się strukturalnie od białek będących składnikami szczepionek, zarówno pełnokomórkowej jak i aP. Wówczas B. pertussis ze zmienionymi głównymi epitopami antygenów może unikać odpowiedzi przeciwkrztuścowej gospodarza indukowanej szczepionkami. W Polsce, mimo stosowania od 1960 r. obowiązkowych szczepień przeciw krztu- ścowi, odnotowano w  latach 1997-1998 epidemiczny wzrost zachorowań [83]. W okresie 1996-2001 skuteczność szczepionki wP u dzieci w wieku 2-5 lat zmniejszyła się z 97 do 73%, natomiast u dzieci w wieku 6-9 lat obni- żyła się z 84 do 69% [78]. Wówczas wzrost zachorowań nie był powiązany ze spadkiem poziomu zaszczepienia, lecz wynikał z  pojawienia się szczepów, na które nie działały skutecznie mechanizmy odporności organizmu indukowane podaniem szczepionek. Były to szczepy B. pertussis o odmiennych profilach genetycznych pertaktyny i podjednostki S1 toksyny krztuśca [27]. Zmiany w genomach krążących szczepów B. pertussis izolowanych w latach 1999-2005 wykryto również w Finlandii [21], Holandii (badano izolaty z okresu 1949-2008) [55] oraz Australii. Natomiast brak znaczących zmian genetycznych wśród izolatów z  lat 1935-2009 wykazano w USA [65]. Identyfikowane są także szczepy B. pertussis, które nie syntezują PT, PRN oraz FHA, czyli trzech antygenów wchodzących w skład preparatów aP i w ten sposób szczepy te unikają odpowiedzi wywołanej szczepionkami [55]. Rozpowszechnione są również szczepy o allelach ptxP3 (zastępujące ptxP1) wykazujące zwiększone wytwarzanie PT, które mogą opóźniać odpowiedź immunologiczną, pogarszać stan chorego oraz zwiększać transmisję B. pertussis [55]. Adaptacja bakterii przez zmiany genetyczne wynika m.in. z  presji selekcyjnej wywołanej stosowaniem szczepionek. Szczepionka wP indukuje odpowiedź immunologiczną przeciwko wielu antygenom B. pertussis, lecz o względnie niskim poziomie przeciwciał, natomiast aP wywołuje reakcję jedynie przeciwko kilku antygenom, lecz uzyskiwane miano przeciwciał jest wysokie [55]. Zatem zastosowanie wP zapoczątkowało adaptacyjne mutacje B. pertussis, natomiast szczepionki aP potęgują zmiany w antygenach, PT, FHA, Fim i PRN. Badania polimorfizmu antygenowego izolatów klinicznych wskazują zatem na potrzebę okresowej zmiany szczepów stosowanych do produkcji szczepionek (zastosowanie szczepów przeważających obecnie w populacji) [16,55] lub zastosowania antygenu charakteryzującego się stabilnością ewolucyjną [8].

Badania nad stosowanymi szczepionkami wskazują na potrzebę wprowadzenia szczepionki, która wykazywałaby minimalne działania niepożądane, efektywność porównywalną do szczepionki pełnokomórkowej, skład pozwalający na zminimalizowanie wpływu zjawiska dryfu antygenowego oraz zdolność do indukcji przeciwciał ochronnych. Spadek odporności wywołanej bezkomórkowymi szczepionkami przeciwkrztuścowymi wskazuje, że brakuje w nich ważnych antygenów ochronnych B. pertussis.

Odporność przeciwkrztuścowa. Odporność przeciwko B. pertussis podczas zakażenia

Podczas zakażenia, drobnoustroje B. pertussis przylegają do komórek urzęsionych nabłonka oddechowego gospodarza. Zewnątrzkomórkowa bakteria może być zniszczona za pośrednictwem aktywacji dopełniacza (C) z  udziałem przeciwciał, które rozpoznają i  wiążą antygeny powierzchniowe [76]. Zakażenie B. pertussis indukuje wytwarzanie IgG przeciwko składnikom powierzchniowym – LOS, FHA, PRN w  surowicy i  IgA w tkance limfoidalnej oraz wydzielanie na powierzchnię błon śluzowych. Przeciwciała te są obecne również w  płucach. Przeciwciała takie są obecne w  surowicy pacjentów podczas zakażenia oraz po ozdrowieniu. Weiss i wsp. [76] wykryli obecność immunoglobulin G3 (IgG3) swoistych dla LOS u pacjentów z zakażeniem wywołanym B. pertussis oraz wykazali ich aktywność bakteriobójczą. Badania Trollfors i wsp. [72] przeprowadzone wśród dzieci z zakażeniem B. pertussis potwierdziły, że układ odpornościowy gospodarza reaguje na LOS B. pertussis wykazując bakteriobójczą aktywność przeciwciał skierowanych przeciwko LOS. Przeciwciała przeciwko B. pertussis działają przez neutralizację toksyn, hamowanie wiązania bakterii do komórek nabłonkowych dróg oddechowych, ułatwienie pochłonięcia bakterii oraz destrukcji przez makrofagii i neutrofile. Przeciwciała zdolne do związania antygenu bakteryjnego i aktywacji dopełniacza stanowią przeciwciała bakteriobójcze, które są niezbędne w odporności przeciwbakteryjnej.

Antygeny powierzchniowe bakterii B. pertussis, takie jak lipooligosacharyd w wyniku związania TLR-4 aktywują wytwarzanie interleukin prozapalnych (IL-1, IL-6, IL-12, IL-23, IFN-γ) przez komórki dendrytyczne i makrofagi [34,54] (ryc. 4 A). Cytokiny te promują indukcję i dojrzewanie komórek T pomocniczych typu 1 (Th1) i Th17 z  komórek T naiwnych. Cytokiny wydzielane przez komórki T, interferon-γ przez komórki Th1 oraz IL-17 przez komórki Th17 wzmagają wytwarzanie przeciwciał opsonizujących oraz przyciągają i aktywują makrofagi i neutrofile do pochłonięcia i wewnątrzkomórkowego zabicia bakterii w wyniku działania NO [34,76].

Odpowiedź odpornościowa gospodarza wywołana zakażeniem B. pertussis obejmuje zarówno ochronę skierowaną przeciwko bakteriom krążącym pozakomórkowo, jak i  przeciwko bakteriom, które pokonały mechanizmy odporności gospodarza i wniknęły do komórek. Do oddziaływań bakterii znajdujących się w cytoplazmie komórek z sIgA może dochodzić podczas transcytozy tych immunoglobulin. Skuteczna ochrona immunologiczna wywołana aktywnością komórek układu odporności wrodzonej, a zapoczątkowana obecnością przeciwciał bakteriobójczych i  aktywacją dopełniacza, zapobiega cytotoksyczności spowodowanej wniknięciem B. pertussis do komórek. Szczepionka przeciwkrztuścowa powinna zatem wywoływać wytwarzanie przeciwciał o aktywności bakteriobójczej zdolnej do bezpośredniej eliminacji bakterii z dróg oddechowych.

Odporność indukowana przeciwkrztuścową szczepionką pełnokomórkową

Szczepionka pełnokomórkowa wywołuje wytwarzanie bakteriobójczych przeciwciał o ochronnych właściwościach podobnie jak czynią to komórki B. pertussis podczas zakażenia. Wytworzone przeciwciała rozpoznają antygeny powierzchniowe i promują zabijanie bakterii z udziałem dopełniacza. Badania Weiss i wsp. [76] potwierdziły, że mimo rozwiniętych mechanizmów adaptacji B. pertussis do układu odpornościowego gospodarza, przeciwciała bakteriobójcze mogą pokonać bariery ochronne bakterii (m.in. mechanizmy oporności BrkA) prowadząc do ich unieszkodliwienia i zabicia.

Szczepionka pełnokomórkowa składa się z  zabitych bakterii B. pertussis, których antygeny powierzchniowe stanowią wzorce molekularne związane z patogenem (PAMPs). Antygeny te włączając lipooligosacharyd (LOS) będący głównym składnikiem eksponowanym na powierzchni tej bakterii, aktywują komórki dendrytyczne i makrofagi do wytwarzania prozapalnych interleukin (IL-12, IL-23) [33,50] (ryc. 4 A). Pod ich wpływem są wytwarzane przeciwciała opsonizujące oraz są aktywowane makrofagi i neutrofile zdolne do pochłonięcia i zabicia bakterii. Van den Berg i wsp. [74] wykazali, że immunizacja myszy szczepionką wP, które następnie zakażono donosowo B. pertussis wywołując wytwarzanie przeciwciał IgG2a o wysokim mianie, eliminuje bakterie z tchawicy. LOS jako główny składnik B. pertussis odpowiedzialny za wytwarzanie IL-12 przez makrofagi jest powodem dużej skuteczności wP. W badaniach nad żywą, atenuowaną szczepionką (zawierająca inaktywowaną genetycznie toksynę krztuśca, DNT poddaną delecji oraz B. pertussis ampG zastąpioną przez E. coli ampG), Skerry i wsp. [68] wykazali, że wP indukuje wytwarzanie limfocytów B pamięci immunologicznej oraz przeciwciał z dominującą klasą IgG2a zapewniając długotrwałą odporność przeciwkrztuścową. Mutant ten indukuje także odporność komórkową przez wytwarzanie IFN-γ i  IL-12. Skuteczność ochrony wP zmniejszająca się u myszy z defektem IFN-γR lub na skutek neutralizacji IL-17 potwierdza udział LOS w odporności indukowanej wP przez indukcję Th1 i Th17 [68].

Ochrona immunologiczna wywołana szczepionką wP zmniejsza się z czasem. Po upływie 4-12 lat od ostatniej dawki DTP obserwuje się małą odporność przeciwkrztuścową lub jej brak. Ochrona wywołana zakażeniem B. pertussis również nie jest długotrwała i wynosi 4-20 lat [4,13]. Na skutek obniżającej się z wiekiem odporności, zwiększa się populacja młodzieży i osób dorosłych podatnych na zakażenie B. pertussis. Z tego powodu jest zalecana jako dawka przypominająca. Reaktogenność szczepionki pełnokomórkowej oraz występowanie miejscowych reakcji poszczepiennych nasilających się wraz z liczbą podanych dawek sprawiają, że u osób dorosłych jest wymagane stosowanie preparatu bezkomórkowego jako szczepionki przypominającej [78].

Odporność wywołana przeciwkrztuścową szczepionką bezkomórkową

Stosowane obecnie bezkomórkowe szczepionki przeciwkrztuścowe (aP) zawierają 3-5 antygenów białkowych B. pertussis – inaktywowaną toksynę krztuśca, hemaglutyninę włókienkową, pertaktynę, fimbrie serotypów 2 i 3. Szczepionki aP w przeciwieństwie do wP i żywych komórek B. pertussis nie aktywują makrofagów (brak odpowiedzi typu Th1) oraz nie wywołują wytwarzania przeciwciał opsonizujących IgG2a [34,54,74] (ryc. 4). Gzyl i wsp. [29] potwierdzili, że u myszy zakażonych drogą oddechową lub immunizowanych wP występuje odporność na ponowne zakażenie B. pertussis z odpowiedzią cytokin IFN-γ, IL-12, TNF-β i odpowiedzią przeciwciał klasy IgG2a (ryc. 4 A). Szczepionki aP aktywują komórki dendrytyczne do wytwarzania interleukin (IL- 1, IL-6, IL-23) promujących indukcję komórek Th17 (ryc. 4 B). Następnie wydzielane IL-17 i IL-22 przez komórki Th17 przyciągają i aktywują neutrofile do wewnątrzkomórkowego zabijania bakterii. Zaktywowane komórki dendrytyczne wydzielają również IL-4 i promują aktywację eozynofilów oraz indukcję przeciwciał IgG1 neutralizujących toksynę (ryc. 4 B). Badania Mahon i wsp. [50] dowodzą, że pod wpływem PT, FHA lub PRN nie jest również wydzielana IL-12, która jest wytwarzana przez makrofagi w wyniku zakażenia B. pertussis, stymulacji przez wP lub LOS B. pertussis. Zatem, wP wywołuje odpowiedź typu komórkowego z udziałem limfocytów Th1, natomiast szczepionki aP indukują odpowiedź humoralną charakteryzującą się profilem cytokin spolaryzowanym w kierunku Th2 [52], która opóźnia usunięcie bakterii. Szczepionki aP nie aktywują TLR-4, natomiast pobudzane są jedynie receptory NLR (NOD-like receptors) [54]. W badaniach z zastosowaniem myszy Gzyl i wsp. [29] wykazali, że szczepionki aP opóźniają eliminację bakterii z płuc (16-27 dni) po zakażeniu w porównaniu do eliminacji bakterii u  zwierząt uprzednio immunizowanych wP (3-7 dni).

Odporność indukowaną szczepionką aP stanowią przeciwciała antytoksynowe, a więc działające przez neutralizację toksyn B. pertussis. Nie zapewnia ona udziału przeciwciał opsonizujących komórkę bakteryjną oraz zabijania bakterii z udziałem makrofagów. Szczepionka aP nie dostarcza zatem pełnej odporności przeciwkrztuścowej. Brak aktywności bakteriobójczej w odporności indukowanej szczepionką bezkomórkową [77] może być jednym z powodów małej skuteczności tej szczepionki. Ochrona immunologiczna przeciwko krztuścowi u dzieci zaszczepionych preparatem aP jest krótkotrwała i  zmniejsza się w  kolejnych latach od immunizacji. Powodem krótkotrwałej odporności indukowanej przez stosowane szczepionki jest szybki spadek poziomu produkowanych przeciwciał w czasie od 3 do 5 lat [15,17]. W  badaniach podczas epidemii krztuśca w  Kalifornii w  2010 r. wykazano 98% ochrony wywołanej 5 dawkami szczepionki DTaP w pierwszym roku od jej podania wśród dzieci w wieku 4-10 lat. Obserwowano, że ochrona zmniejszała się do < 90% po 3 latach oraz 71% po 5 latach [17]. Odporność utraciło 15% osób w ciągu 5 lat od przyjęcia szczepionki aP [55]. Zmniejszająca się odporność wywołana szczepionką przeciwkrztuścową przyczynia się do zwiększenia populacji osób podatnych na zachorowanie zwiększając ryzyko epidemii.

Badania nad stosowanymi obecnie szczepionkami bezkomórkowymi wskazują zatem na potrzebę otrzymania szczepionki zdolnej do wytwarzania przeciwciał o aktywności bakteriobójczej i generowania długotrwałej odpowiedzi immunologicznej. Odporność wywołana na skutek aktywacji komórek pamięci immunologicznej przy kontakcie z bakterią powinna zapewnić opsonizację i zniszczenie komórki, a przez to zwiększać skuteczność szczepionek przeciwkrztuścowych.

Optymalna odpowiedź przeciwkrztuścowa. Udział endotoksyny w odpowiedzi odpornościowej

Badania nad odpornością przeciwkrztuścową wskazują, że skuteczna szczepionka powinna dostarczać odporności funkcjonalnej głównie w postaci neutralizacji toksyn i zabijania bakterii [76]. Ograniczona skuteczność obecnie stosowanych szczepionek przeciwkrztuścowych wynika z tego, że ich składniki nie wywołują pełnej ochronnej odpowiedzi immunologicznej. Główny antygen szczepionek bezkomórkowych, toksoid krztuśca jest niezbędny jako antygen wywołujący wytwarzanie przeciwciał neutralizujących toksynę [67]. Szczepionki bezkomórkowe indukują wytwarzanie przeciwciał swoistych dla PT na poziomie porównywalnym lub wyższym niż wP [20]. Szczepionka pełnokomórkowa zapewnia wytwarzanie przeciwciał przeciwko wielu czynnikom wirulencji B. pertussis zwiększając skuteczność ochrony przeciwkrztuścowej. Niepełna odpowiedź immunologiczna wywołana szczepionką aP wynika z tego, że przeciwciała skierowane przeciwko toksynie krztuśca zmniejszają toksyczne działanie B. pertussis na komórki gospodarza, lecz nie zabijają bakterii [76]. Z tego powodu stosowane obecnie szczepionki chronią przed rozwojem ostrych stanów chorobowych w  krztuścu, jednak nie zapewniają usunięcia bakterii z zakażonego organizmu. Eliminacja bakterii jest najlepszą obroną przeciw krztuścowi, gdyż np. zapobiega przekazywaniu bakterii wśród niemowląt, u których w wyniku zakażenia B. pertussis rozwija się ta zagrażająca życiu choroba.

Do uzyskania efektywnej szczepionki przeciwkrztuścowej rozwiązaniem jest wykorzystanie jako antygenu składnika powierzchniowego komórki bakteryjnej. Wówczas w odpowiedzi immunologicznej na ten antygen są generowane przeciwciała, które rozpoznają struktury powierzchniowe bakterii i z udziałem dopełniacza atakują błonę zewnętrzną wykazując aktywność bakteriobójczą. Celem ataku bakteriobójczego skierowanego przeciwko B. pertussis może być eksponowany na powierzchni komórki bakteryjnej lipooligosacharyd (LOS), gdyż jest głównym antygenem powierzchniowym B. pertussis (ryc. 5) [8]. Znany również jako endotoksyna, LOS nie jest wydzielany przez komórkę bakteryjną i jest cząsteczką ciepłostabilną [8]. LOS B. pertussis składa się z  lipidu A  zakotwiczającego cząsteczkę w  błonie zewnętrznej komórki bakteryjnej oraz eksponowanego do środowiska zewnętrznego oligocukru (OS).

W surowicy pacjentów po przebytym zakażeniu B. pertussis są znajdowane przeciwciała skierowane przeciwko lipooligosacharydowi [72,76]. Niektóre z  przeciwciał przeciwko LOS wykazują aktywność lityczną wobec komórek bakteryjnych i są ochronne w zakażeniach B. pertussis [76]. Aktywność bakteriobójcza koreluje z obecnością IgG3 skierowanych przeciwko LOS. Badania z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych wykazały, że aktywność bakteriobójczą mają te przeciwciała, które są swoiste dla oligocukrowego fragmentu LOS B. pertussis [2,47,57]. Mountzouros i wsp. [57] wykazali, że monoklonalne IgG3 swoiste dla oligocukru chroniły myszy przed śmiertelnym zakażeniem wywołanym przez podanie zawiesiny bakterii B. pertussis w aerozolu.

Połączenie dwóch aktywności przeciwciał – zdolności do neutralizacji toksyny krztuśca oraz bakteriobójczości wydaje się niezbędne w odporności przeciwkrztuścowej (ryc. 6, kolejne etapy oznaczono A-C). Przeciwciała antyendotoksynowe rozpoznają i wiążą antygeny powierzchniowe B. pertussis – LOS (A), a następnie inicjują kaskadę reakcji obronnych prowadzących do zniszczenia komórki bakteryjnej z udziałem kompleksu atakującego błonę (MAC, B). Natomiast przeciwciała skierowane przeciwko toksynie krztuśca neutralizują skutki toksyczne B. pertussis (C). Endotoksyna B. pertussis ma strukturę lipopolisacharydu typu półszorstkiego (S/R-LPS), który zawiera jedną podjednostkę oligocukrową, natomiast jest pozbawiony polisacharydu łańcucha O-swoistego i dlatego jest określany jako lipooligosacharyd [7,48]. LOS jest zbudowany z lipidu A i dodekasacharydu, który składa się z oligocukru rdzenia podstawionego dystalnym trójcukrem. Lipid A jest regionem odpowiedzialnym za endotoksyczność lipopolisacharydu [7], która wyklucza zastosowanie LOS jako antygenu szczepionkowego w natywnej postaci.

Lipopolisacharydy w  postaci wolnej i  związanej z komórką bakteryjną są toksyczne i reaktogenne. LPS są antygenami T-niezależnymi – nie są zdolne do aktywacji limfocytów Th i wywołania wytwarzania komórek pamięci immunologicznej. Wytworzone przeciwciała przeciwko LPS są w  większości immunoglobulinami klasy IgM [7]. Przeciwciała otrzymane w wyniku immunizacji LOS B. pertussis nie chronią podczas ponownego kontaktu z bakteriami B. pertussis [12]. Lipopolisacharydy w tej postaci są nieodpowiednimi kandydatami do wykorzystania jako antygeny szczepionkowe.

Immunogenne postacie lipooligosacharydu B. pertussis – glikokoniugaty

W  celu wykorzystania inaktywowanych postaci cząsteczek lipopolisacharydów jako antygenów szczepionkowych, są pozbawiane toksycznych aktywności z  zachowaniem struktury epitopów przez usunięcie lipidu A – izolację poli- lub oligosacharydów oraz modyfikowane do antygenów T-zależnych poprzez koniugację z  białkami [35,36]. Oligocukry endotoksyn bakteryjnych są zbudowane z reszt cukrowych, których różnorodność strukturalna przewyższa bogactwo struktur aminokwasowych i  wpływa na swoistość odpowiedzi immunologicznej. Z tego powodu przeciwciała antyendotoksynowe odznaczają się wysokim powinowactwem i swoistością oddziaływania. Ponadto lipooligosacharydy są składnikami ewolucyjnie stabilnymi. Oligocukier B. pertussis występuje w niezmienionej postaci w izolatach klinicznych [1,51]. Konserwatywność tej struktury obserwowano wśród szczepów z okresu przed- i poszczepionkowego. Albitar-Nehme i wsp. [1] oraz Marr i wsp. [51] wykazali brak modyfikacji w strukturze dodekasacharydowej i całej cząsteczce LOS. Oligocukier w przeciwieństwie do białkowych antygenów B. pertussis nie ulega dryfowi antygenowemu. Ewolucyjna stabilność oraz unikatowość struktury OS B. pertussis powoduje, że oligocukier jest właściwym kandydatem szczepionkowym.

Oligocukier wyizolowany z lipooligosacharydu B. pertussis połączony z białkiem nośnikowym może stanowić immunogenny i T-zależny antygen. Surowice antykoniugatowe odznaczają się wysokim stężeniem przeciwciał klasy IgG reagujących swoiście z endotoksyną [49]. Szczepionki glikokoniugatowe indukują przeciwciała o wysokim powinowactwie i stymulują pamięć immunologiczną. Glikokoniugaty oligocukrów i  nośników białkowych stosuje się jako antygeny w szczepionkach przeciwbakteryjnych [23].

Otrzymanie immunogennego glikokoniugatu w wyniku przyłączenia polisacharydu do białka opisali po raz pierwszy Oswald Avery i Walter Goebel w 1929 r. [3].

W 1980 r. otrzymano pierwszą szczepionkę glikokoniugatową toksoidu błonicy i polisacharydu otoczkowego Haemophilus influenzae typu b [25]. Wykazano, że glikokoniugaty oligocukru i nośnika białkowego wykazują cechy serologiczne zdefiniowane przez strukturę chemiczną oligocukru, w większym stopniu niż przez właściwości białka („efekt nośnika”) [3]. Otrzymane antygeny stanowią nowe, tj. niewystępujące w naturze glikokoniugaty („neoglikokoniugaty”) gwarantujące wywołanie swoistej odpowiedzi immunologicznej. Otrzymywanie antygenów w postaci glikokoniugatów zapewnia uzyskiwanie przeciwciał swoistych dla oligocukru i wykazujących aktywność bakteriobójczą [35,36].

Przeciwciała klasy IgG skierowane przeciwko oligocukrowi rdzenia bakterii Gram-ujemnych są ochronne u ludzi. Jennings i Ługowski [35] wykazali, że koniugaty oligocukrów rdzenia Neisseria meningitidis z toksoidem tężca są immunogenne, a uzyskane surowice mają aktywność bakteriobójczą przeciwko N. meningitidis o identycznym serotypie. Podobnie do N. meningitidis, B. pertussis zawiera endotoksynę pozbawioną typowego antygenu O [7,48]. Lipooligosacharyd ten nie jest zło- żoną polimeryczną cząsteczką, która chroni bakterie przed atakiem bakteriobójczych przeciwciał. Badania Weiss i wsp. [76] wykazały, że przeciwciała klasy IgG3 anty-LOS B. pertussis uczestniczą w zabijaniu zależnym od dopełniacza.

Nośnikami białkowymi stosowanymi w szczepionkach przeciwbakteryjnych są inaktywowane toksyny bakteryjne (toksoidy). Do nośników szczepionkowych należą: toksoid tężca (TTd), toksoid błonicy (DTd) oraz nietoksyczny wariant toksyny błonicy – CRM197 (otrzymany w wyniku mutacji polegającej na zmianie jednego aminokwasu w  regionie fragmentu A  toksyny błonicy). Białko CRM197, które nie jest poddawane działaniu formaldehydu, odznacza się silniejszym „efektem nośnika” i większą immunogennością tworzonych glikokoniugatów niż toksoid błonicy, gdyż jego epitopy dla komórek T są zachowane. Podczas łączenia wielu różnych antygenów szczepionkowych – glikokoniugatów i antygenów białkowych obserwuje się zjawisko interferencji, polegające na zmniejszeniu odpowiedzi immunologicznej na polisacharyd („carrier-induced-epitopic suppresion, CIES) lub antygen białkowy („bystander interference”) [18]. Rozwiązaniem jest wprowadzenie nowego nośnika białkowego niewywołującego zjawiska interferencji immunologicznej.

Najpowszechniejszą, dopuszczoną do stosowania u ludzi metodą glikokoniugacji jest reakcja reduktywnej aminacji [32]. Reakcja wymaga obecności aktywnej grupy aldehydowej, która może być wytworzona podczas aktywacji oligocukru pod wpływem reakcji łagodnego utleniania nadjodanem [82]. Grupa aldehydowa reaguje następnie z grupą aminową białka prowadząc do utworzenia stabilnego wiązania kowalencyjnego (zredukowanej zasady Schiffa) w obecności czynnika redukującego. W zależno- ści od liczby dostępnych grup aminowych białka nastę-puje przyłączenie kilku lub kilkudziesięciu cząsteczek oligocukru. W przypadku toksoidu tężca stosunek oligocukru do białka wynosi zwykle 8-10 cząsteczek OS na cząsteczkę białka. Utworzony typ wiązania w postaci drugorzędowej aminy jest wiązaniem powszechnym w  naturalnie występujących białkach. W  ten sposób z toksycznej, reaktogennej i T-niezależnej cząsteczki LPS otrzymywany jest nietoksyczny glikokoniugat oligocukru z nośnikiem białkowym o właściwościach immunogennego i T-zależnego antygenu [35]. Spośród składników B. pertussis w postaci glikokoniugatów zastosowano oligocukier izolowany z  lipooligosacharydu B. pertussis w wyniku hydrolizy kwaśnej (dodekasacharyd, kompletny OS). Kimura i wsp. [38] oraz Kübler-Kielb i wsp. [43,44,45,46] opisali otrzymanie odpowiednio immunogennych koniugatów OS B. pertussis i hemaglutyniny włókienkowej oraz OS i albuminy wołowej (BSA). Immunogennym składnikiem okazał się również fragment oligocukru B. pertussis – pentasacharyd skoniugowany z toksoidem tężca w wyniku reduktywnej aminacji, który został opisany przez Niedzielę i wsp. [58]. Zastosowane w  glikokoniugacie pentasacharyd- -TTd, typ wiązania oraz nośnik białkowy są powszechnie akceptowane w antygenach szczepionkowych. Glikokoniugat OS-BSA indukował swoiste przeciwciała u myszy [46], natomiast pentasacharyd-TTd był immunogenny u królików [58].

Wszystkie otrzymane koniugaty oligocukru B. pertussis i białka nośnikowego wywoływały odpowiedź immunologiczną swoistą dla oligocukru. Reaktywność surowic antykoniugatowych wykazano w testach immunofluorescencyjnych z wykorzystaniem sortera komórek (FACS) zarówno na zabitych jak i żywych komórkach B. pertussis [58]. Przeciwciała antyglikokoniugatowe zmniejszały zdolność lipooligosacharydu do indukcji TNF-α, IL-6 i NO w komórkach linii makrofagowej, neutralizując endotoksyczne działanie tego składnika i w  konsekwencji zmniejszając proces zapalny [58]. Przeciwciała antykoniugatowe wykazywały aktywność bakteriobójczą swoistą dla LOS B. pertussis, prowadząc do zabicia bakterii z udziałem dopełniacza [46]. Bakteriobójcze przeciwciała anty-OS B. pertussis powodują in vivo eliminację bakterii z zakażonego organizmu [57].

Badania glikokoniugatów oligocukru i nośnika białkowego [58] wskazują, że zastosowanie fragmentu oligocukrowego w tej postaci zapewnia generowanie przeciwciał rozpoznających struktury powierzchniowe B. pertussis, podobnie jak czynią to przeciwciała skierowane przeciwko LOS. Glikokoniugat zawierający nietoksyczny oligocukier B. pertussis zdolny do indukcji przeciwciał bakteriobójczych jest zatem odpowiednim kandydatem szczepionkowym. W  celu wywołania optymalnej odpowiedzi przeciwkrztuścowej istotne może się także okazać połączenie aktywności bakteriobójczej i neutralizującej przeciwciał przeciwko B. pertussis generowanych w odpowiedzi na antygen szczepionkowy. Taka neutralizacja toksycznych skutków B. pertussis może być zapewniona przez użycie odpowiedniego białka nośnikowego. Stosowane w glikokoniugatach nośniki białkowe, np. najczęściej używany toksoid tężca, służą jako immunogenne składniki glikokoniugatów, lecz nie wnoszą wkładu w pulę przeciwciał skierowanych przeciwko B. pertussis. BSA jest modelowym nośnikiem białkowym i nie jest stosowana w antygenach szczepionkowych. Natomiast, FHA jest adhezyną B. pertussis, a zatem podobnie jak LOS składnikiem powierzchniowym. Opisane antygeny przeciwkrztuścowe nie łączą zatem cech składników zapewniających jednoczesną odpowiedź immunologiczną o aktywności neutralizującej i bakteriobójczej skierowanej przeciwko B. pertussis.

Takim białkowym składnikiem B. pertussis możliwym do zastosowania w neoglikokoniugacie jest toksyna krztu- śca. Schneerson i wsp. [66] opisali połączenie toksyny krztuśca z  polisacharydem otoczkowym Streptococcus pneumoniae (Pn14-PT). Uzyskany nietoksyczny glikokoniugat generuje odpowiedź immunologiczną swoistą dla polisacharydu Pn14. Zjawisko odtoksycznienia toksyny krztuśca zastosowanej jako nośnik białkowy koniugatu nasuwa wniosek, że inaktywacja tej toksyny następuje w  wyniku połączenia z  fragmentem oligocukrowym. W  przypadku koniugatu Pn14-PT, toksyna stanowiła efektywny nośnik białkowy wzmacniający odpowiedź skierowaną przeciwko polisacharydowi.

Połączenie nietoksycznego fragmentu wyizolowanego z LOS B. pertussis – oligocukru oraz toksyny krztuśca w postać glikokoniugatu, umożliwia otrzymanie antygenu wywołującego wytwarzanie przeciwciał o aktywnościach neutralizujących i bakteriobójczych. Koj i wsp. [42] uzyskali nietoksyczny i immunogenny glikokoniugat przez kowalencyjne połączenie OS B. pertussis i PT w wyniku reakcji reduktywnej aminacji (ryc. 7). Dotychczas przeprowadzone badania aktywności przeciwciał wytworzonych w  odpowiedzi przeciwko antygenowi OS-PT dowodzą ich właściwości ochronnych przeciwko B. pertussis w warunkach in vitro [42]. Glikokoniugat ten może zwiększyć skuteczność szczepionki przeciwkrztuścowej złożonej z antygenów białkowych B. pertussis, o antygen indukujący przeciwciała o aktywności bakteriobójczej.

Mimo wykazywanych właściwości potencjalnego antygenu szczepionkowego, tj. immunogenności i zdolności do indukcji przeciwciał o właściwościach ochronnych, dotychczas nie zastosowano glikokoniugatów zawierających składniki B. pertussis w preparatach przeciwkrztuścowych. Te właściwości wraz ze zdolnością do wywołania długotrwałej pamięci immunologicznej sprawiają, że te glikokoniugaty mogą stanowić składniki skutecznej szczepionki przeciwkrztuścowej.

Podsumowanie

Przedstawione informacje wskazują bardzo ważną rolę endotoksyny Bordetella pertussis w ochronie odpornościowej organizmu przeciwko krztuścowi – bardzo zakaźnej chorobie dróg oddechowych. Krztusiec znany również jako koklusz, szczególnie zagraża zdrowiu i życiu niemowląt oraz małych dzieci, u których rozwija się długotrwały i uporczywy kaszel mogący prowadzić do sinicy i bezdechu. Od kilkudziesięciu lat krztuścowi zapobiega się przez szczepienia, jednak zakażenia wywołane przez B. pertussis nadal są powszechne.

Dane epidemiologiczne dotyczące krztuśca świadczą o bardzo dobrej skuteczności szczepionek pełnokomórkowych, które gwałtownie zmniejszyły zachorowalność w latach 1960-1980. Jednak w latach 90 ub.w., z powodu reaktogenności szczepionkę pełnokomórkową w wielu krajach zastąpiono szczepionkami bezkomórkowymi, które zawierają wyizolowane antygeny białkowe B. pertussis. W ostatnich latach obserwuje się wzrost częstości zachorowań na krztusiec w wielu krajach Europy, Kanadzie i  USA [11,56,79,84]. Niewystarczająca skuteczność szczepionek bezkomórkowych jest uznawana za główny powód zwiększającej się zachorowalności na krztusiec. Porównanie odporności wywoływanej zakażeniem B. pertussis i szczepionkami przeciwkrztuścowymi wskazało, że odpowiedź odpornościowa wzbudzana szczepionką pełnokomórkową przypomina odporność powstającą w wyniku zachorowania na krztusiec oraz jest odmienna od procesów odpornościowych przebiegających w organizmie w wyniku immunizacji szczepionką bezkomórkową. Szczepionki pełnokomórkowe wywołują odpowiedź immunologiczną z udziałem interleukin prozapalnych (IL-1, -6, -12, -23, IFN-γ) oraz przeciwciał opsonizujących IgG2. Szczepionki bezkomórkowe zawierają antygeny, które wywołują wytwarzanie przeciwciał klasy IgG1 neutralizujących skutki toksyczne B. pertussis, lecz nie indukują wytwarzanie przeciwciał bakteriobójczych, które są niezbędne do eliminacji bakterii. Liczne badania wykazują, że przeciwciała bakteriobójcze są wytwarzane w odpowiedzi odpornościowej na główny składnik powierzchniowy bakterii Gram-ujemnych – lipooligosacharyd. Wykazano, że w odporności wywołanej zakażeniem B. pertussis i szczepionką pełnokomórkową, główną rolę odgrywa także aktywność bakteriobójcza przeciwciał skierowanych przeciwko lipooligosacharydowi. Odporność z udziałem przeciwciał antyendotoksynowych eliminuje bakterie z udziałem dopełniacza i chroni organizm gospodarza przed wniknięciem patogenu do komórek, zapobiegając cytotoksycznym uszkodzeniom i zapewniając w ten sposób skuteczną ochronną odporność przeciwkrztuścową.

Część cukrowa LOS jest bardzo eksponowana na powierzchni komórki B. pertussis stanowiąc główny cel bakteriobójczych przeciwciał. Liczne badania wskazują na wytwarzanie przeciwciał swoistych dla OS B. pertussis w wyniku immunizacji glikokoniugatami zawierającymi oligocukrowy fragment endotoksyny B. pertussis. Oligocukier izolowany z LOS połączony z nośnikiem białkowym wywołuje wytwarzanie przeciwciał rozpoznających LOS B. pertussis i wykazujących aktywność bakteriobójczą przeciwko B. pertussis. W celu uzupełnienia aktywności bakteriobójczej o aktywność neutralizującą toksynę krztuśca, oligocukier B. pertussis połączono z toksyną krztuśca, uzyskując glikokoniugatowy antygen o  szerokich właściwościach przeciwkrztuścowych. Wszystkie opisane glikokoniugaty zawierające oligocukrowy fragment LOS stanowią immunogenne antygeny o właściwościach ochronnych przeciwko zakażeniom B. pertussis wskazując na możliwość ich zastosowania jako składnika szczepionki przeciwkrztuścowej. Prowadzone badania nad przyczynami wzrostu zachorowań na krztusiec pozwalają zatem na zdefiniowanie skutecznej szczepionki oraz wskazują na potrzebę poszerzenia składu obecnie stosowanych preparatów o antygen zapewniający ochronną odporność przeciwkrztuścową.

Przypisy

• 1. Albitar-Nehme S., Basheer S.M., Njamkepo E., Brisson J.R., GuisoN., Caroff M.: Comparison of lipopolysaccharide structures of Bordetellapertussis clinical isolates from pre- and post-vaccine era. Carbohydr.Res., 2013; 378: 56-62
  Google Scholar
• 2. Archambault D., Rondeau P., Martin D., Brodeur B.R.: Characterizationand comparative bactericidal activity of monoclonal antibodiesto Bordetella pertussis lipo-oligosaccharide A. J. Gen. Microbiol.,1991; 137: 905-911
  Google Scholar
• 3. Avery O.T., Goebel W.F.: Chemo-immunological studies on conjugatedcarbohydrate-proteins: II. Immunological specificity of syntheticsugar-protein antigens. J. Exp. Med., 1929; 50: 533-550
  Google Scholar
• 4. Bechini A., Tiscione E., Boccalini S., Levi M., Bonanni P.: Acellularpertussis vaccine use in risk groups (adolescents, pregnant women,newborns and health care workers): a review of evidences and recommendations.Vaccine, 2012; 30: 5179-5190
  Google Scholar
• 5. Black R.E., Cousens S., Johnson H.L., Lawn J.E., Rudan I., BassaniD.G., Jha P., Campbell H., Walker C.F., Cibulskis R., Eisele T., Liu L.,Mathers C., Child Health Epidemiology Reference Group of WHO andUNICEF: Global, regional, and national causes of child mortality in2008: a systematic analysis. Lancet, 2010; 375: 1969-1987
  Google Scholar
• 6. Burns D.L., Kenimer J.G., Manclark C.R.: Role of the A subunit ofpertussis toxin in alteration of Chinese hamster ovary cell morphology.Infect. Immun., 1987; 55: 24-28
  Google Scholar
• 7. Caroff M., Brisson J., Martin A., Karibian D.: Structure of the Bordetellapertussis 1414 endotoxin. FEBS Lett., 2000; 477: 8-14
  Google Scholar
• 8. Caroff M., Karibian D.: Structure of bacterial lipopolysaccharides.Carbohydr. Res., 2003; 338: 2431-2447
  Google Scholar
• 9. Centers for Disease Control and Prevention: Pertussis Chapter- Epidemiology of Vaccine-Preventable Diseases. The Pink Book:Course Textbook. 2015
  Google Scholar
• 10. Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Pertussisvaccination: use of acellular pertussis vaccines among infants andyoung children. Recommendations of the Advisory Committee onImmunization Practices (ACIP). MMWR Recomm. Rep., 1997; 46: 1-25
  Google Scholar
• 11. Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Pertussisepidemic – Washington, 2012. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep.,2012; 61: 517-522
  Google Scholar
• 12. Chaby R., Caroff M.: Lipopolysaccharides of Bordetella pertussisendotoxin. W: Pathogenesis and immunity in pertussis. John-Wiley& Sons, Chichester, United Kingdom 1988, 247-271
  Google Scholar
• 13. Cherry J.D.: Epidemic pertussis in 2012 — the resurgence ofa vaccine-preventable disease. N. Engl. J. Med., 2012; 367: 785-787
  Google Scholar
• 14. Cherry J.D.: Why do pertussis vaccines fail? Pediatrics, 2012;129: 968-970
  Google Scholar
• 15. Chodorowska M., Kuklińska D.: Krztusiec u młodzieży i osóbdorosłych. Przegl. Epidemiol., 2001; 55: 189-195
  Google Scholar
• 16. Chodorowska M., Kuklińska D.: Restrykcyjna analiza DNA pa-łeczek Bordetella pertussis wyizolowanych od chorych na krztusiecw 1968 roku i w latach 1995-98 oraz szczepów B. pertussis stosowanychdo produkcji krajowej szczepionki przeciwkrztuścowej. Med.Dośw. Mikrobiol., 2001; 52: 111-117
  Google Scholar
• 17. Clark T.A.: Changing pertussis epidemiology: everything old isnew again. J. Infect. Dis., 2014; 209: 978-981
  Google Scholar
• 18. Dagan R., Poolman J., Siegrist C.A.: Glycoconjugate vaccinesand immune interference: a review. Vaccine, 2010; 28: 5513-5523
  Google Scholar
• 19. De Gouw D., Diavatopoulos D.A., Bootsma H.J., Hermans P.W.,Mooi F.R.: Pertussis: a matter of immune modulation. FEMS Microbiol.Rev., 2011; 35: 441-474
  Google Scholar
• 20. Edwards K.M., Berbers G.A.: Immune responses to pertussis vaccinesand disease. J. Infect. Dis., 2014; 209 (Suppl. 1): S10-S15
  Google Scholar
• 21. Elomaa A., He Q., Minh N.N., Mertsola J.: Pertussis before andafter the introduction of acellular pertussis vaccines in Finland.Vaccine, 2009; 27: 5443-5449
  Google Scholar
• 22. Farizo K.M., Burns D.L., Finn T.M., Gruber M.F., Pratt R.D.: Clinicalevaluation of pertussis vaccines: US Food and Drug Administrationregulatory considerations. J. Infect. Dis., 2014; 209 (Suppl. 1): S28-S31
  Google Scholar
• 23. Finco O., Rappuoli R.: Designing vaccines for the twenty-firstcentury society. Front. Immunol., 2014; 5: 12
  Google Scholar
• 24. Flak T.A., Goldman W.E.: Signalling and cellular specificity ofairway nitric oxide production in pertussis. Cell. Microbiol., 1999;1: 51-60
  Google Scholar
• 25. Guiso N.: Bordetella pertussis and pertussis vaccines. Clin. Infect.Dis., 2009; 49: 1565-1569
  Google Scholar
• 26. Guiso N.: Bordetella pertussis: why is it still circulating? J. Infect.,2014; 68 (Suppl. 1): S119-S124
  Google Scholar
• 27. Gzyl A., Augustynowicz E., Gniadek G., Ślusarczyk J.: Zmiennośćgenetyczna szczepów Bordetella pertussis. Część II. Perspektywy naprzyszłość. Przegl. Epidemiol., 2003; 57: 193-200
  Google Scholar
• 28. Gzyl A., Augustynowicz E., Rabczenko D., Gniadek G., SlusarczykJ.: Pertussis in Poland. Int. J. Epidemiol., 2004; 33: 358-365
  Google Scholar
• 29. Gzyl A., Augustynowicz E., Zawadka M., Rabczenko D., SlusarczykJ.: Ocena efektywności pełnokomórkowych i bezkomórkowychszczepionek przeciw krztuścowi w eliminacji eksperymentalnegozakażenia myszy Bordetella pertussis. Med. Dośw. Mikrobiol., 2007;59: 123-135
  Google Scholar
• 30. Heidary N., Cohen D.: Hypersensitivity reactions to vaccinecomponents. Dermatitis, 2005; 16: 115-120
  Google Scholar
• 31. Heininger U.: Recent progress in clinical and basic pertussisresearch. Eur. J. Pediatr., 2001; 160: 203-213
  Google Scholar
• 32. Hermanson G.T.: The reactions of bioconjugation. W: Techniques(Third Edition). Academic Press, 2013, 229-258
  Google Scholar
• 33. Higgins S.C., Jarnicki A.G., Lavelle E.C., Mills K.H.: TLR4 mediatesvaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis:role of IL-17-producing T cells. J. Immunol., 2006; 177: 7980-7989
  Google Scholar
• 34. Higgs R., Higgins S.C., Ross P.J., Mills K.H.: Immunity to the respiratorypathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunol., 2012; 5:485-500
  Google Scholar
• 35. Jennings H.J., Ługowski C.: Immunochemistry of groups A, B,and C meningococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugates. J.Immunol., 1981; 127: 1011-1018
  Google Scholar
• 36. Jennings H.J., Ługowski C., Ashton F.E.: Conjugation of meningococcallipopolysaccharide R-type oligosaccharides to tetanus toxoidas route to a potential vaccine against group B Neisseria meningitidis.Infect. Immun., 1984; 43: 407-412
  Google Scholar
• 37. Kerr J.R., Matthews R.C.: Bordetella pertussis infection: pathogenesis,diagnosis, management, and the role of protective immunity.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2000; 19: 77-88
  Google Scholar
• 38. Kimura A., Beurret M., Cowell J.L.: Immunogenic conjugates ofnontoxic oligosaccharide derived from Bordetella pertussis lipooligosaccharide.Patent EP0471954. 1992
  Google Scholar
• 39. Klein N.P., Bartlett J., Fireman B., Rowhani-Rahbar A., Baxter R.:Comparative effectiveness of acellular versus whole-cell pertussisvaccines in teenagers. Pediatrics, 2013; 131: e1716-e1722
  Google Scholar
• 40. Klein N.P., Bartlett J., Rowhani-Rahbar A., Fireman B., Baxter R.:Waning protection after fifth dose of acellular pertussis vaccine inchildren. N. Engl. J. Med., 2012; 367: 1012-1019
  Google Scholar
• 41. Koepke R., Eickhoff J.C., Ayele R.A., Petit A.B., Schauer S.L., HopfenspergerD.J., Conway J.H., Davis J.P.: Estimating the effectivenessof tetanus-diphtheria-acellular pertussis vaccine (Tdap) for preventingpertussis: evidence of rapidly waning immunity and differencein effectiveness by Tdap brand. J. Infect. Dis., 2014; 210: 942-953
  Google Scholar
• 42. Koj S., Niedziela T., Ługowski C.: Bordetella pertussis LOS-derivedoligosaccharide with pertussis toxin glycoconjugate and its applicationin the prophylaxis and treatment of infections caused byBordetella pertussis. Patent WO/2014/195881. 11.12.2014
  Google Scholar
• 43. Kubler-Kielb J.: Conjugation of LPS-derived oligosaccharidesto proteins using oxime chemistry. Methods Mol. Biol., 2011; 751:317-327
  Google Scholar
• 44. Kubler-Kielb J., Pozsgay V.: A new method for conjugation ofcarbohydrates to proteins using an aminooxy-thiol heterobifunctionallinker. J. Org. Chem., 2005; 70: 6987-6990
  Google Scholar
• 45. Kubler-Kielb J., Vinogradov E., Ben-Menachem G., Pozsgay V.,Robbins J.B., Schneerson R.: Saccharide/protein conjugate vaccinesfor Bordetella species: preparation of saccharide, development of newconjugation procedures, and physico-chemical and immunologicalcharacterization of the conjugates. Vaccine, 2008; 26: 3587-3593
  Google Scholar
• 46. Kubler-Kielb J., Vinogradov E., Lagergård T., Ginzberg A., KingJ.D., Preston A., Maskell D.J., Pozsgay V., Keith J.M., Robbins J.B.,Schneerson R.: Oligosaccharide conjugates of Bordetella pertussis andbronchiseptica induce bactericidal antibodies, an addition to pertussisvaccine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011; 108: 4087-4092
  Google Scholar
• 47. Le Blay K., Caroff M., Blanchard F., Perry M.B., Chaby R.: Epitopesof Bordetella pertussis lipopolysaccharides as potential markersfor typing of isolates with monoclonal antibodies. Microbiology,1996; 142: 971-978
  Google Scholar
• 48. Le Dur A., Caroff M., Chaby R., Szabó L.: A novel type of endotoxinstructure present in Bordetella pertussis. Isolation of two differentpolysaccharides bound to lipid A. Eur. J. Biochem., 1978; 84: 579-589
  Google Scholar
• 49. Ługowski C., Niedziela T., Jachymek W.: Endotoksyny bakteryjne:struktura, aktywności biologiczne, szczepionki koniugatowe.Mikrobiol. Med., 1996; 4: 28-39
  Google Scholar
• 50. Mahon B.P., Ryan M.S., Griffin F., Mills K.H.: Interleukin-12 isproduced by macrophages in response to live or killed Bordetella pertussisand enhances the efficacy of an acellular pertussis vaccine bypromoting induction of Th1 cells. Infect. Immun., 1996; 64: 5295-5301
  Google Scholar
• 51. Marr N., Novikov A., Hajjar A.M., Caroff M., Fernandez R.C.:Variability in the lipooligosaccharide structure and endotoxicityamong Bordetella pertussis strains. J. Infect. Dis., 2010; 202: 1897-1906
  Google Scholar
• 52. Marzouqi I., Richmond P., Fry S., Wetherall J., Mukkur T.: Developmentof improved vaccines against whooping cough: currentstatus. Hum. Vaccin., 2010; 6: 543-553
  Google Scholar
• 53. Mattoo S., Cherry J.D.: Molecular pathogenesis, epidemiology,and clinical manifestations of respiratory infections due to Bordetellapertussis and other Bordetella subspecies. Clin. Microbiol. Rev.,2005; 18: 326-382
  Google Scholar
• 54. Mills K.H., Ross P.J., Allen A.C., Wilk M.M.: Do we need a newvaccine to control the re-emergence of pertussis? Trends Microbiol.,2014; 22: 49-52
  Google Scholar
• 55. Mooi F.R., Van Der Maas N. A., De Melker H.E.: Pertussis resurgence:waning immunity and pathogen adaptation – two sides of thesame coin. Epidemiol. Infect., 2014; 142: 685-694
  Google Scholar
• 56. Mooi F.R., van Loo I.H., van Gent M., He Q., Bart M.J., HeuvelmanK.J., de Greeff S.C., Diavatopoulos D., Teunis P., Nagelkerke N.,Mertsola J.: Bordetella pertussis strains with increased toxin productionassociated with pertussis resurgence. Emerg. Infect. Dis., 2009;15: 1206-1213
  Google Scholar
• 57. Mountzouros K.T., Kimura A., Cowell J.L.: A bactericidal monoclonalantibody specific for the lipooligosaccharide of Bordetella pertussis reduces colonization of the respiratory tract of mice afteraerosol infection with B. pertussis. Infect. Immun., 1992; 60: 5316-5318
  Google Scholar
• 58. Niedziela T., Letowska I., Lukasiewicz J., Kaszowska M., CzarneckaA., Kenne L., Lugowski C.: Epitope of the vaccine-type Bordetellapertussis strain 186 lipooligosaccharide and antiendotoxin activityof antibodies directed against the terminal pentasaccharide-tetanustoxoid conjugate. Infect. Immun., 2005; 73: 7381-7389
  Google Scholar
• 59. Paradowska-Stankiewicz I., Rudowska J.: Pertussis in Poland in 2010 Przegl. Epidemiol., 2012; 66: 211-214
  Google Scholar
• 60. Parkhill J., Sebaihia M., Preston A., Murphy L.D., Thomson N.,Harris D.E., Holden M.T., Churcher C.M., Bentley S.D., Mungall K.L.,Cerdeño-Tárraga A.M., Temple L., James K., Harris B., Quail M.A.i wsp.: Comparative analysis of the genome sequences of Bordetellapertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica. Nat.Genet., 2003; 35: 32-40
  Google Scholar
• 61. Pichichero M.E., Rennels M.B., Edwards K.M., Blatter M.M., MarshallG.S., Bologa M., Wang E., Mills E.: Combined tetanus, diphtheria,and 5-component pertussis vaccine for use in adolescents andadults. JAMA, 2005; 293: 3003-3011
  Google Scholar
• 62. Robbins J.B., Schneerson R., Kubler-Kielb J., Keith J.M., TrollforsB., Vinogradov E., Shiloach J.: Toward a new vaccine for pertussis.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2014; 111: 3213-3216
  Google Scholar
• 63. Sato H., Sato Y.: Experience with diphtheria toxoid-tetanus toxoid-acellularpertussis vaccine in Japan. Clin. Infect. Dis., 1999; 28(Suppl. 2): S124-S130
  Google Scholar
• 64. Sato Y., Sato H.: Development of acellular pertussis vaccines.Biologicals, 1999; 27: 61-69
  Google Scholar
• 65. Schmidtke A.J., Boney K.O., Martin S.W., Skoff T.H., Tondella M.L.,Tatti K.M.: Population diversity among Bordetella pertussis isolates,United States, 1935-2009. Emerg. Infect. Dis., 2012; 18: 1248-1255
  Google Scholar
• 66. Schneerson R., Levi L., Robbins J.B.: Pertussis toxin used as a carrierprotein with non-charged saccharides in conjugate vaccines.Patent US 5445817 A. 1995
  Google Scholar
• 67. Sheu G.C., Wo Y.Y., Yao S.M., Chou F.Y., Hsu T.C., Ju C.L., Cheng Y.,Chang S.N., Lu C.H.: Characteristics and potency of an acellular pertussisvaccine composed of pertussis toxin, filamentous hemagglutinin,and pertactin. J. Microbiol. Immunol. Infect., 2001; 34: 243-251
  Google Scholar
• 68. Skerry C.M., Mahon B.P.: A live, attenuated Bordetella pertussisvaccine provides long-term protection against virulent challenge ina murine model. Clin. Vaccine Immunol., 2011; 18: 187-193
  Google Scholar
• 69. Smith A.M., Guzmán C.A., Walker M.J.: The virulence factors ofBordetella pertussis: a matter of control. FEMS Microbiol. Rev., 2001;25: 309-333
  Google Scholar
• 70. Tan Y., Fleck R.A., Asokanathan C., Yuen C.T., Xing D., Zhang S.,Wang J.: Confocal microscopy study of pertussis toxin and toxoidson CHO-cells. Hum. Vaccin. Immunother., 2013; 9: 332-338
  Google Scholar
• 71. Tondella M.L., Carlone G.M., Messonnier N., Quinn C.P., MeadeB.D., Burns D.L., Cherry J.D., Guiso N., Hewlett E.L., Edwards K.M.,Xing D., Giammanco A., Wirsing von König C.H., Han L., Hueston L.i wsp.: International Bordetella pertussis assay standardization andharmonization meeting report. Centers for Disease Control andPrevention, Atlanta, Georgia, United States, 19-20 July 2007. Vaccine,2009; 27: 803-814
  Google Scholar
• 72. Trollfors B., Lagergard T., Taranger J., Bergfors E., Schneerson,Robbins J.B.: Serum immunoglobulin G antibody responses to Bordetellapertussis lipooligosaccharide and B. parapertussis lipopolysaccharidein children with pertussis and parapertussis. Clin. Diagn.Lab. Immunol., 2001; 8: 1015-1017
  Google Scholar
• 73. Trollfors B., Taranger J., Lagergård T., Lind L., Sundh V., ZackrissonG., Lowe C.U., Blackwelder W., Robbins J.B.: A placebo-controlledtrial of a pertussis-toxoid vaccine. N. Engl. J. Med., 1995;333: 1045-1050
  Google Scholar
• 74. Van den Berg B.M., David S., Beekhuizen H., Mooi F.R., van FurthR.: Protection and humoral immune responses against Bordetella pertussisinfection in mice immunized with acellular or cellular pertussisimmunogens. Vaccine, 2000; 19: 1118-1128
  Google Scholar
• 75. Van den Brink G., Wishaupt J.O., Douma J.C., Hartwig N.G., VersteeghF.G.: Bordetella pertussis: an underreported pathogen in pediatric respiratoryinfections, a prospective cohort study. BMC Infect. Dis., 2014; 14: 526
  Google Scholar
• 76. Weiss A.A., Mobberley P.S., Fernandez R.C., Mink C.M.: Characterizationof human bactericidal antibodies to Bordetella pertussis.Infect. Immun., 1999; 67: 1424-1431
  Google Scholar
• 77. Weiss A.A., Patton A.K., Millen S.H., Chang S.J., Ward J.I., BernsteinD.I.: Acellular pertussis vaccines and complement killing ofBordetella pertussis. Infect. Immun., 2004; 72: 7346-7351
  Google Scholar
• 78. WHO: Pertussis vaccines: WHO position paper. Wkly Epidemiol.Rec., 2010; 85: 385-400
  Google Scholar
• 79. Winter K., Harriman K., Zipprich J., Schechter R., Talarico J.,Watt J., Chavez G.: California pertussis epidemic, 2010. J. Pediatr.,2012; 161: 1091-1096
  Google Scholar
• 80. Wong K.H., Skelton S.K.: New, practical approach to detectingantibody to pertussis toxin for public health and clinical laboratories.J. Clin. Microbiol., 1988; 26: 1316-1320
  Google Scholar
• 81. Wood N., McIntyre P.: Pertussis: review of epidemiology, diagnosis,management and prevention. Paediat. Respir. Rev., 2008;9: 201-211
  Google Scholar
• 82. Woodward M.P., Young W.W.Jr., Bloodgood R.A.: Detection ofmonoclonal antibodies specific for carbohydrate epitopes usingperiodate oxidation. J. Immunol. Methods, 1985; 78: 143-153
  Google Scholar
• 83. Zieliński A., Borys D.: Problem nawrotu zachorowań na krztusiec.Przegl. Pediatr., 2002; 32: 273-277
  Google Scholar
• 84. Zieliński A., Czarkowski M.P., Sadkowska-Todys M.: Infectiousdiseases in Poland in 2012. Przegl. Epidemiol., 2014; 68: 177-185
  Google Scholar

Pełna treść artykułu