Streszczenie

Teoria istnienia nowotworowych komórek macierzystych (cancer stem cells – CSC) zyskuje co­raz większe znaczenie w świecie medycyny. Liczne dowody badań in vivo oraz in vitro wska­zują, że to właśnie populacja niezróżnicowanych, samoodnawiających się komórek w guzie no­wotworowym jest odpowiedzialna za odtwarzanie choroby i przerzutowanie. CSC, podobnie jak zwykłe komórki macierzyste, funkcjonują w otoczeniu innych komórek organizmu, tzw. niszy, skąd czerpią sygnały do różnicowania i proliferacji. Zaburzenia w szlakach sygnałowych mię­dzy CSC a niszą, wynikające m.in. z nabytych mutacji onkogennych, mogą prowadzić do nie­kontrolowanych podziałów komórek macierzystych, ich uniezależnienia od pierwotnej niszy lub zasiedlenia nowego mikrośrodowiska. CSC identyfikowane są na podstawie ekspresji swoistych markerów – białek błonowych lub enzymów komórkowych. Do izolowania wykorzystuje się naj­częściej metody oparte na pomiarze fluorescencji barwnika (uzyskiwanie populacji pobocznej, SP) lub też fluorescencji fluoroforu związanego z przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko określonemu markerowi CSC. Inną metodą jest uzyskiwanie zróżnicowanych morfo­logicznie klonów z pojedynczej komórki: holo-, mero- lub paraklonów. Standardowym testem in vivo potwierdzającym macierzysty charakter wyizolowanych komórek jest tworzenie przez nie guzów w myszach NOD/SCID. Model ten może jednak w pełni nie odzwierciedlać złożoności chorób nowotworowych u ludzi. Rozwiązanie zagadki procesu onkogenezy, w tym istnienia no­wotworowych komórek macierzystych, bez wątpienia stanowi jeden z priorytetów współczesnej medycyny, który powinien się przyczynić do udoskonalenia standardowej terapii onkologicznej.

Słowa kluczowe:nowotwory • komórki macierzyste • onkogeneza • terapia przeciwnowotworowa • markery nowotworowych komórek macierzystych

Summary

Cancer stem cell theory gains increasingly greater significance in the world of medicine. Numerous findings of scientific research in vivo and in vitro indicate that it is the population of undifferen­tiated, self-renewing cells which is responsible for recurrence of cancer and metastasis. Similarly to normal stem cells, cancer stem cells (CSC) function in the environment of the other cells of the organism, called the niche, where they receive signals for differentiation and proliferation processes. Disorders in the signaling pathways between CSC and the niche that result from e.g. acquired oncogenic mutations may lead to uncontrolled proliferation of stem cells, gaining inde­pendence from the primary niche or settling a new microenvironment. CSC are identified on the basis of specific markers – membrane proteins or cell enzymes. Methods based on the measure­ment of dye fluorescence (obtaining side population, SP) or fluorescence of the fluorophore con­jugated with a monoclonal antibody directed against the specific CSC marker are used for iso­lation. A different method obtains morphologically miscellaneous clones by single cell cloning: holo-, mero- and paraclones. Tumor forming assay in NOD/SCID mice is a standard in vivo test that confirms the stem character of isolated cells. However, this model may not fully reflect the complexity of cancer illnesses in human beings. Solving the mystery of oncogenesis, including the existence of cancer stem cells, is undoubtedly one of the priorities of contemporary medici­ne that should contribute to the improvement of cancer therapy.

Key words:cancer • stem cell • oncogenesis • cancer therapy

Wykaz skrótów:

ABC – kaseta wiążąca ATP (ATP-binding casette); ALDH – dehydrogenaza aldehydowa (aldehyde dehydrogenase); AML – chroniczna białaczka szpikowa (acute myeloid leukemia); CD – grupa zróżnicowania (cluster of differentiation); CSC – nowotworowe komórki macierzyste (cancer stem cells); EMS – zarodkowe komórki macierzyste (embrionic stem cells); EMT – przemiana nabłonka w mezenchymę (epithelial to mesenchymal transition); FACS – cytometria przepływowa (fluorescence activated cell storting); HGF – czynnik wzrostu hepatocytów (hepatocyte growth factor); NOD/SCID – myszy z cukrzycą niepowodującą otyłości, z ostrym, złożonym upośledzeniem odporności (non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency); PDGF-α – płytkopochodny czynnik wzrostu (platelet-derived growth factor); SP – populacja poboczna (side population); VEGF-1 – czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (vascular endothelial growth factor).

1. Czym są komórki macierzyste?

Komórki macierzyste są niewyspecjalizowanymi komórka­mi zdolnymi do różnicowania w wiele odmiennych typów komórek tworzących tkanki i organy. Proces ich tworzenia rozpoczyna się już podczas wczesnego etapu rozwoju za­rodka, po zapłodnieniu. Komórki węzła zarodkowego oraz pierwotnej ektodermy w blastocyscie mogą się różnicować do każdego typu komórek; nazywane są totipotencjalny­mi. Pierwotne komórki zarodkowe nazywane także em­brionalnymi (embrionic stem cells – EMS) to oddzielone od komórek trofoblastu linie komórek zarodkowych o peł­nym potencjale rozwojowym charakterystycznym dla da­nego węzła zarodkowego. Dzięki swoim niezwykłym wła­ściwościom są często wykorzystywane w modyfikacjach transgenicznych i do uzyskiwania organizmów o ocze­kiwanym genotypie. Na dalszym etapie rozwoju zarod­ka następuje podział na linię komórek płciowych oraz so­matycznych (pluripotencjalnych) [6]. Pula somatycznych komórek macierzystych – zdolnych do samoodnawiania i nieskończonej proliferacji – występująca we wszystkich tkankach dojrzałego organizmu pełni rolę swoistego sys­temu naprawczego, umożliwiając zastąpienie martwych komórek nowymi [37].

Terapie oparte na wykorzystaniu ludzkich komórek ma­cierzystych hodowanych in vitro są wielką nadzieją wie­lu gałęzi medycyny, m.in. regeneracyjnej, transplantologii czy onkologii. Jednym z powszechnych schorzeń, z którym skutecznie się walczy za pomocą transplantacji embrional­nych komórek macierzystych jest cukrzyca – uważana też za nieinfekcyjną epidemię XXI wieku [37]. Wszczepione do miąższu trzustki komórki macierzyste mają za zadanie zastąpić uszkodzone komórki beta, zdolne do wydzielania insuliny [11]. Również w schorzeniach neurodegeneracyj­nych, takich jak choroba Alzheimera czy Parkinsona lecze­nie z wykorzystaniem komórek macierzystych pozwoliło na zahamowanie lub spowolnienie degeneracji mózgowia u większości pacjentów [21]. Podanie komórek macierzy­stych może być nieocenione w odnowie i budowaniu im­munokompetencji pacjenta w chorobie AIDS, ponieważ spowalnia progresję choroby oraz zmniejsza prawdopo­dobieństwo wystąpienia charakterystycznych powikłań [26,28]. Nowatorskie terapie oparte na transplantacji ko­mórek macierzystych mogą być również pomocne w od­budowie elementów morfotycznych krwi podczas che­mioterapii stosowanej w chorobach nowotworowych, co może zapewnić bardziej efektywne leczenie oraz zmniej­szyć działania niepożądane [32].

2. Nowotworowe komórki macierzyste

Istnienie nowotworowych komórek macierzystych (can­cer stem cells – CSC), tłumaczące zjawisko heterogenno­ści w obrębie nowotworów, podejrzewano już ponad 40 lat temu, jednakże ówczesna nauka nie dysponowała wystar­czającymi narzędziami i technikami molekularnymi, aby można było przeprowadzić bardziej szczegółowe badania. Najwięcej dowodów potwierdzających powyższą hipote­zę pochodzi z badań nad chorobami krwi, np. chronicz­ną białaczką szpikową (acute myeloid leukemia – AML). W chorobie tej dochodzi do zaburzenia procesu hemato­poezy, co w konsekwencji przyczynia się do akumulacji niedojrzałych komórek niezdolnych do dalszego różni­cowania. Dokładne śledzenie aberracji hematopoezy jest możliwe przez wprowadzenie ilościowych testów pomiaru klonogenności komórek białaczki. Wykazały one, że tyl­ko część komórek nowotworowych jest zdolna do prolife­racji in vivo oraz in vitro [39].

Obecnie dysponujemy coraz większą liczbą dowodów na istnienie pewnej puli komórek, także w przypadkach gu­zów litych (np. guzów piersi czy mózgu), które mają cha­rakter komórek macierzystych zdolnych do samoodnawia­nia [1,14]. Za nowotworowe komórki macierzyste uznaje się populację niezróżnicowanych komórek, które mogą zo­stać wyizolowane na podstawie ekspresji określonej czą­steczki lub kombinacji cząsteczek nazywanych markerami. Komórki te wykazują zwiększoną zdolność do onkogenezy w porównaniu do zwykłej komórki nowotworowej, powo­dują utworzenie guza nowotworowego u laboratoryjnych myszy o obniżonej odporności (severe combined immuno­deficiency – SCID), a także mogą być odpowiedzialne za przerzutowanie [3]. Zwykłe komórki nowotworowe mają bardzo ograniczoną lub nawet brak możliwości samood­nawiania, co sugeruje, że to właśnie populacja nowotworo­wych komórek macierzystych może być odpowiedzialna za wzrost i rozprzestrzenianie się nowotworu. Ta rewolucyj­na teoria rzuca zupełnie nowe światło na diagnozę i sku­teczne leczenie chorób nowotworowych.

3. Nowotworowe i zwykłe komórki macierzyste – podobieństwa i różnice

Nowotworowe komórki macierzyste mają bardzo wiele wła­ściwości prawidłowych komórek macierzystych, głównie unikalne zdolności samoodnawiania, proliferacji, różnico­wania i multipotencji. Udowodniono, że jednym z czyn­ników bezpośrednio wpływających na podtrzymywanie puli komórek macierzystych jest specjalne mikrośrodowi­sko, nazywane niszą [36]. Jest ona odpowiedzialna m.in. za to czy komórka „wybierze” drogę samoodnawiania, czy też różnicowania do innego typu komórki, np. w celu gojenia rany czy ubytku zdrowych komórek danej tkan­ki. Budowa niszy jest złożona – składa się z komórek me­zenchymalnych, układu immunologicznego, sieci naczyń krwionośnych, czynników rozpuszczalnych, a także kom­ponentów macierzy pozakomórkowej [7]. Do utrzymania swoich właściwości i zdolności odnowy komórki macie­rzyste potrzebują sygnałów od komórek niszy, w której wy­stępują. Uwalniane związki sygnałowe mogą aktywować szlaki decydujące o dalszym losie komórki macierzystej. Komórki te mogą mieć także fizyczny wpływ na podział komórki macierzystej. Podczas podziału mitotycznego ko­mórka dzieli się na dwie komórki potomne, z czego jedna dziedziczy przyłączenie do innych komórek niszy, nato­miast druga aktywuje ekspresję genów odpowiedzialnych za szlaki różnicowania. W wyniku tego, w obrębie niszy – w niewielkiej odległości od siebie – mogą egzystować komórki zdolne do samoodnawiania oraz różnicujące się [41]. Wynika to z niesymetrycznego podziału komórek macierzystych: jedna z komórek potomnych odbudowuje rezerwę komórek macierzystych, podczas gdy druga roz­poczyna proces różnicowania [30]. Nisza jest również od­powiedzialna za zabezpieczanie przed niekontrolowanym rozprzestrzenieniem komórek macierzystych w organizmie [10]. Nowotworowe komórki macierzyste prawdopodob­nie podlegają podobnej regulacji w swoim mikrootoczeniu. Wykazano, że CSC nowotworu jelita grubego, aby zacho­wać sprawny szlak sygnałowy Wnt (odpowiedzialny m.in. za różnicowanie i proliferację), wymagają jednocześnie sty­mulacji przez czynnik wzrostu hepatocytów (hepatocyte growth factor – HGF) wydzielany przez komórki mezen­chymalne. Potwierdza to wpływ komórek obecnych w lo­kalnym otoczeniu guza na zachowanie zdolności onkoge­nezy przez komórki nowotworowe. Nisze CSC położone są zazwyczaj w obrębie naczyń krwionośnych, co umożli­wia późniejsze przerzutowanie komórek nowotworowych. Mikrootoczenie może utrzymywać CSC nie tylko w stanie komórek macierzystych (ryc. 1, pkt. 1), ale także wpływać bezpośrednio na odróżnicowywanie komórek prawidłowych do nowotworowych CSC (ryc. 1, pkt. 2) oraz indukować przemianę komórek nabłonka w mezenchymy (epithelial to mesenchymal transition – EMT), co prowadzi do póź­niejszego przerzutowania (ryc.1, pkt. 3) [7]. Podejrzewa się, że osiedlenie komórek przerzutujących do innych or­ganów może być poprzedzone utworzeniem nowej, pier­wotnej niszy w miejscu przerzutu, która umożliwia inicja­cję i rozrost wtórnych guzów w innych tkankach.

Ryc. 1. CSC w niszach; udział niszy w przerzutowaniu komórek (wg [7] zmodyfikowano); 1 – CSC o charakterze macierzystym, 2 – odróżnicowywanie komórek prawidłowych do nowotworowych CSC, 3 – przemiana komórek nabłonka w mezenchymy (epithelial to mesenchymal transition – EMT)

Szczegółowa rola niszy w kontroli i regulacji funkcji no­wotworowych komórek macierzystych jest jednak wciąż niewyjaśniona [12].

Wiadomo, że geny odpowiedzialne za kierowanie ko­mórki na drogę samoodnawiania, a nie różnicowania, są potencjalnymi onkogenami. Przykładem może być gen Bmil, pełniący ważną rolę w syntezie czynników transkrypcyj­nych i represji epigenetycznej. Udowodniono, że prawidło­we komórki macierzyste neuronów mogą zachować swoją odrębność i zdolności do samoodnawiania jedynie wtedy, gdy Bmi1 powoduje represję genów odpowiedzialnych za promocję różnicowania lub śmierci komórki [18]. W ten sam sposób guzy mogą być utrzymywane przez populację komórek nowotworowych o właściwościach komórek ma­cierzystych zdolnych do samoodnowy. W badaniach prze­prowadzanych na mysim modelu białaczki wykazano, że obecność genu Bmi1 jest niezbędna do utrzymania i pro­liferacji puli CSC. Natomiast w przypadku jego braku ko­mórki nie są zdolne do samoodnawiania i ostatecznie ich proliferacja zanika [27].

Reasumując, CSC mogą podlegać regulacji tymi samymi szlakami molekularnymi jak prawidłowe komórki macie­rzyste, co niewątpliwie może się przyczynić do nieskutecz­nej terapii przeciwnowotworowej.

Różnicą między CSC a zwykłymi komórkami macierzy­stymi jest częstość ich występowania. Inaczej niż zwykłe komórki macierzyste, obecne w tkance w bardzo małych ilościach, CSC stanowią dość znaczną populację komó­rek nowotworowych. Oszacowano, że w guzie piersi, do­mniemane nowotworowe komórki macierzyste o fenotypie CD24^–/CD44⁺ stanowią 12-60% wszystkich komórek no­wotworowych, natomiast w guzie jelita grubego o fenoty­pie CD133⁺ 3,8-24,6% [1,19]. Niemniej znane są również doniesienia, że w przypadku nowotworów słabo zróżni­cowanych, nowotworowe komórki macierzyste stanowią większość komórek guza [23].

Ponieważ komórki nowotworowe – zależnie od sprzyja­jących warunków – mogą ewoluować, to te o charakterze zjadliwym oraz mało zróżnicowanym będą wykazywać wzrostową przewagę nad innymi komórkami nowotwo­ru i będą przeważać w obrębie guza. Stąd też w proce­sie progresji nowotworu granica między nowotworowy­mi komórkami macierzystymi a resztą komórek może się zacierać, a nawet zanikać. Współczesna nauka nie dyspo­nuje uniwersalnym markerem CSC. Potwierdzono to wie­lokrotnie, na przykład w badaniach nad nowotworowymi komórkami macierzystymi glejaka, które wykazują tak fe­notyp CD133⁺, jak i CD133-, zależnie od analizowanej czę­ści guza [5]. Podobną genetyczną dywergencję wykazano dla macierzystych komórek nowotworu piersi o fenotypie CD24^–/CD44⁺ i CD24⁺/CD44^–. Dane te mogą wskazywać zarówno na znany fakt genetycznej heterogenności nowo­tworów, jak i istnienie ciągłej selekcji najlepiej przystoso­wanych do danego środowiska komórek [34].

4. Nowotworowe komórki macierzyste a proces nowotworzenia

Powszechnie uważa się, że onkogeneza jest inicjowa­na w zdrowych komórkach macierzystych danej tkanki lub też komórkach progenitorowych, powstałych z komó­rek macierzystych. Istniejące w nich gotowe mechanizmy samoodnawiania zapewniają im długowieczność w da­nej niszy. Co więcej, komórka będąca częścią stale odna­wiającej się populacji, po oddzieleniu od niszy, może się stać początkiem guza nowotworowego. Hipoteza inicjacji nowotworzenia z komórek macierzystych znalazła eks­perymentalne potwierdzenie w przypadku takich nowo­tworów, jak chroniczna białaczka szpikowa czy mięsak Ewinga. Odkryto jednak, że białaczki mogą się rozwijać również z bardziej zróżnicowanych komórek progenitoro­wych, które na nowo nabyły zdolności samoodnawiania. Wysunięto hipotezę o możliwości istnienia alternatywne­go modelu powstawania CSC, pochodzących od komórek bardziej zróżnicowanych [2].

W zdrowym organizmie prawidłowe komórki macierzyste pozostają w ścisłej zależności od swojego otoczenia złożo­nego z innych komórek, tworzących tzw. niszę. Zazwyczaj komórki niszy regulują szlaki metaboliczne komórek ma­cierzystych i niejako zabezpieczają przed ich niekontro­lowanym wzrostem. Istnieją jednak drogi, na których na­turalne bariery mogą zostać przełamane i rozpocznie się proces nowotworzenia [12]:

• Ekspansja komórek niszy

Mutacje onkogenne nagromadzone w komórkach niszy lub bezpośrednio w samych komórkach macierzystych przyczyniają się do zwiększenia populacji komórek niszy. Stymuluje to również wzrost nieprawidłowych, nowotwo­rowych komórek macierzystych.

• Zasiedlenie nowej niszy

CSC z mutacjami onkogennymi uzyskują zdolność zasiedle­nia odmiennego środowiska, co prowadzi do inwazji lokal­nych tkanek i tworzenia przerzutów, przy czym nowa nisza dostarcza im sygnałów niezbędnych do samoodnawiania.

• Uniezależnienie od niszy

Genetyczne zmiany w CSC uniezależniają je od pierwotne­go mikrośrodowiska i pozwalają na autonomiczne podzia­ły oraz samoodnawianie. Takie uniezależnienie od własnej niszy jest prawdopodobnie przyczyną zezłośliwiania pier­wotnie łagodnych zmian nowotworowych.

• Zaburzenia w procesie różnicowania

Mutacje w częściowo już zróżnicowanej komórce proge­nitorowej powodują, że nabywa ona właściwości komórki macierzystej i samoodnawiania.

5. Identyfikacja nowotworowych komórek macierzystych

5.1 Markery nowotworowych komórek macierzystych

Nowotworowe komórki macierzyste są bardzo często pro­spektywnie izolowane na podstawie ekspresji określo­nych markerów. Najczęściej są to cząsteczki występujące na powierzchni komórek należące do grupy CD (cluster of differentiation), jak choćby popularny marker CD133. Analizie poddawane są także stężenia enzymów cytopro­tekcyjnych, np. dehydrogenazy aldehydowej ALDH lub poziom ekspresji transporterów z grupy ABC, pełniących główną rolę w oporności wielolekowej [17]. Jak dotąd nie znaleziono uniwersalnego markera, na podstawie obec­ności którego można byłoby zidentyfikować CSC każde­go nowotworu (tabela 1) [2].

Tabela 1. Główne markery definiujące ludzkie nowotworowe komórki macierzyste

5.2 Metody stosowane do identyfikacji i izolowania nowotworowych komórek macierzystych

5.2.2. Metody in vitro

• Populacja poboczna (side population – SP)

Jednym ze sposobów wyodrębniania populacji komórek no­wotworowych jest uzyskiwanie populacji pobocznej, w której barwniki fluorescencyjne nie są akumulowane. W metodzie tej komórki macierzyste wykazują podwyższoną ekspresję białek oporności wielolekowej o zdolności aktywnego trans­portu związków poza obręb komórki – transporterów ABCB1 (glikoproteiny P) i ABCG2. Fluorescencyjne związki, takie jak Hoechst 33342 lub DyeCycle Violet, będące substratami tych białek są aktywnie wypompowywane z komórki i taka populacja wykazuje niewielką fluorescencję po wzbudzeniu w świetle lasera. Dla odróżnienia, w komórkach prawidło­wych niebędących macierzystymi, o niskiej ekspresji powyż­szych białek, Hoechst 33342 efektywnie wnika do wnętrza komórki i interkaluje między pary zasad w DNA, co skut­kuje wysokimi wartościami fluorescencji [3].

• Cytometria przepływowa (fluorescence activated cell storting – FACS)

Metoda FACS umożliwia sortowanie heterogennej miesza­niny komórek w oparciu o charakterystykę fluorescencji i załamania światła. W izolowaniu CSC najczęściej stosuje się kilka swoistych przeciwciał monoklonalnych przeciwko charakterystycznym dla danej tkanki markerom skoniugo­wanych z różnobarwnymi fluoroforami. Dzięki precyzyj­nej selekcji otrzymanych wyników można nie tylko do­konać pozytywnej, bądź negatywnej selekcji wybranych komórek, ale także oddzielić je od pozostałych, otrzymu­jąc w ten sposób jednorodną populację [13].

• Klonowanie z pojedynczej komórki (single cell cloning)

Metoda ta polega na uzyskiwaniu klonów z pojedynczych komórek nowotworowych, zróżnicowanych pod wzglę­dem morfologicznym. Udowodniono, że z trzech rodza­jów klonów: holo-, mero- i paraklonów, to właśnie holoklo­ny utworzone są z komórek podobnych do macierzystych, wykazujących ekspresję takich markerów, jak CD44 lub β-katenina, które w doświadczeniach in vivo generowały guzy nowotworowe [42].

5.2.3. Metody in vivo

Badania in vivo nad komórkami macierzystymi, w tym rów­nież nowotworowymi, przeprowadzane są najczęściej na zwierzęcym modelu z użyciem myszy o obniżonej odpo­wiedzi immunologicznej, nazywanych też skrótem NOD/SCID (nonobese diabetic/severe combined immunodeficient). I tak, u zwierząt z nabytą cukrzycą, które mają zwiększoną skłonność do chorób nowotworowych, wprowadzenie dodat­kowej recesywnej mutacji na chromosomie 16 powoduje upo­śledzenie rozwoju limfocytów T i B oraz komórek NK [8]. Takie mutanty stanowią szeroko wykorzystywany i wiarygod­ny model zarówno w badaniach nad komórkami macierzy­stymi, jak i w immunologii, onkologii czy transplantologii.

Standardem w testach funkcjonalnych CSC in vivo jest test onkogenezy u myszy NOD/SCID. Najczęściej jest on po­przedzony opisanym już wcześniej testem selekcji klonów in vitro, gdzie ludzkie komórki nowotworowe pochodzą­ce najczęściej z biopsji z guza hodowane są w małym za­gęszczeniu tworząc charakterystyczne sfery zwane holo-, para- lub meroklonami. Do uzyskanych kolonii dodaje się przeciwciała monoklonalne, zwykle przeciwko mar­kerowi powierzchniowemu CD133. Komórki pozytywne CD133⁺ są następnie kilkakrotnie pasażowane i namna­żane, odtwarzając pierwotne kolonie z jakich pochodzą. Tak wyselekcjonowane populacje są poddawane kseno­transplantacji, czyli wszczepieniu do organizmu o innym pochodzeniu niż dawca komórek. Ponieważ organizma­mi takimi są zwierzęta laboratoryjne z upośledzoną od­powiedzią systemu immunologicznego, możliwa jest oce­na rozwoju guza nowotworowego bez ryzyka odrzucenia przeszczepu [2]. Początkowo sądzono, że CSC występu­ją w guzach nowotworowych w niewielkiej liczbie, ponie­waż wygenerowanie potomnego guza po ksenotransplan­tacji do laboratoryjnych myszy wymagało wykorzystania bardzo dużej liczby ludzkich komórek nowotworowych. Okazało się jednak, że ludzkie komórki inaczej zachowu­ją się w organizmie odmiennego gatunku, czyli w środo­wisku niekompatybilnym immunologicznie. Badania prze­prowadzone tylko w obrębie jednego gatunku, np. myszy, wskazują na wręcz odwrotną zależność – częste występo­wanie nowotworowych komórek macierzystych w guzach nowotworowych. Wykazano, że zaledwie 10 mysich ko­mórek nowotworowych CSC chłoniaka i ostrej białaczki szpikowej (AML), po transplantacji do innego, immuno- i histokompatybilnego organizmu jest w stanie utworzyć guz [22]. Wyniki badań nad częstością występowania CSC w guzach nowotworowych wyraźnie wskazują na zależność indukowania guza od środowiska immunologicznego bior­cy. Środowisko, w którym nie występują komórki natural killers (NK) jest szczególnie sprzyjające rozwojowi guzów nowotworowych: na 254 transplantacje pojedynczych ko­mórek nowotworowych aż 27% zakończyło się rozwojem guza nowotworowego [31].

Reasumując, w praktyce metody in vitro i in vivo często są stosowane kolejno [40], uzupełniane diagnostyką labora­toryjną. Na przykład nowotworowe linie komórkowe czę­sto bada się wstępnie pod względem ekspresji najpopular­niejszych markerów dla CSC, takich jak CD133, CD44 czy CD24 wykorzystując metodę FACS, a następnie ich zdol­ność do onkogenezy jest porównywana w testach in vivo u myszy NOD/SCID [25].

6. Nowe strategie terapii przeciwnowotworowej

Skuteczna terapia przeciwnowotworowa powinna zwalczać zarówno zróżnicowane komórki guza, jak i populację no­wotworowych komórek macierzystych. Konwencjonalne, powszechnie stosowane strategie, takie jak chemio-, radio- czy immunoterapia mogą jedynie unieszkodliwiać szyb­ko rosnące, zróżnicowane komórki nowotworowe (ryc. 2). Skutkują one zatem redukcją masy guza, ale nie zwalcza­ją komórek mogących inicjować jego powstawanie. W re­zultacie, po kilku miesiącach może nastąpić nawrót choro­by, a pozostałe komórki nowotworowe wykazują większą inwazyjność i oporność na leki, co jest negatywnym pro­gnostykiem dalszej terapii.

Ryc. 2. Zasada działania standardowej i celowanej terapii przeciwnowotworowej (na podstawie: http://www.stemline.com)

Do skonstruowania swoistej chemioterapii niezbędna jest szczegółowa identyfikacja markerów nowotworowych ko­mórek macierzystych. Idea celowanego i selektywnego leczenia skierowanego przeciwko wybranym komórkom nowotworowym wywołuje wiele entuzjazmu w świecie medycznym, niestety wciąż brakuje wiarygodnych danych pozwalających na wprowadzenie takiego leczenia u ludzi. Nowe strategie terapeutyczne opierają się najczęściej na blokowaniu kaskad sygnałowych zaangażowanych w proces samoodnawiania nowotworowych komórek macierzystych i jednocześnie zatrzymywania wzrostu zróżnicowanych ko­mórek nowotworu. W tym celu stosuje się np. niskoczą­steczkowe związki lub swoiście działające przeciwciała, które mogą doprowadzić nie tylko do redukcji całkowitej masy guza, ale i eradykacji puli nowotworowych komó­rek macierzystych. Przykładem takiej nowatorskiej terapii może być zastosowanie mieszaniny docetakselu, standardo­wego cytostatyku z grupy antracyklin i jabłczanu sunitini­bu (SU11248), związku oddziałującego na czynniki wzro­stu VEGF-1, PDGF-α oraz β/KIT/FLT-3, którą testowano w ksenoprzeszczepach raka gruczołu krokowego PC-3 u myszy [16]. Obiecujące dla nowych terapii wydają się również nowe klasy cząsteczek peptydowych, np. E4orf4 [9] czy brewininy 2R (brevinin-2R) [15], które wykazują zdolności do półswoistego zabijania komórek nowotwo­rowych, a nawet „przekierowywania” wybranych szlaków komórkowych na promowanie śmierci komórki zamiast jej proliferacji [24]. W eksperymentalnej terapii nowotworu piersi zastosowano leczenie wykorzystujące modyfikowa­ne, polimeryczne, pegylowane micele zawierające pakli­taksel oraz salinomycynę. Udowodniono, że strategia taka eliminuje komórki nowotworowe wraz z CSC znacznie sku­teczniej niż konwencjonalne leczenie [43]. Ponieważ wie­le typów nowotworów wykazuje swoiste profile ekspresji mikroRNA, podejmowane są także próby terapii z zastoso­waniem tych cząsteczek [20]. W glejakach, transfekcja ma­cierzystych komórek nowotworowych mikroRNA-124 oraz mikroRNA-137 skutkuje zatrzymaniem cyklu komórkowe­go i dalszym różnicowaniem komórek o fenotypie CD133⁺ [35]. W innym modelu wykazano, że mikroRNA-34 powo­duje inhibicję samoodnawiania nowotworowych komórek macierzystych w trzustce o fenotypie CD44⁺/CD133⁺ za­równo in vivo, jak i in vitro [2,25]. Inne strategie terapeu­tyczne mogą zakładać zatrzymanie inwazji i procesu prze­rzutowania przez blokowanie integryn lub markera CD44 na powierzchni komórki nowotworowej [3].

7. Nieścisłości i wątpliwości towarzyszące istnieniu nowotworowych komórek macierzystych

Testy wykorzystujące ksenotransplantację dostarczyły do­wodów potwierdzających istnienie nowotworowych komó­rek macierzystych. Powstaje jednak zasadnicze pytanie: na ile realistycznym modelem rozwoju nowotworów ludzkich są ksenoprzeszczepy u myszy z upośledzoną odpornością? Wiadomo, że przeszczepione ludzkie komórki nowotwo­rowe, aby rosnąć i utworzyć guz muszą najpierw zaadop­tować się do obcego środowiska. Możliwe, że to właśnie zdolności adaptacji komórek do nowego otoczenia, a nie ich zakodowane możliwości onkogenezy, odgrywają głów­ną rolę w procesie wzrostu guza.

Niektóre badania wykorzystujące transgeniczne myszy jako modele białaczek wskazują, że zarówno komórki nowotwo­rowe o fenotypie komórek macierzystych, jak i niemające takich cech są w stanie indukować proces nowotworowy u myszy „biorców” [22]. Powyższe wyniki mogą być tłu­maczone przypuszczeniem, że modele ksenoprzeszczepów zawierają więcej komórek inicjujących guz niż pierwotnie sądzono. Szczególnie w przypadkach guzów litych, komór­ki nowotworowe wymagają sąsiedztwa komórek śródbłon­ka i fibroblastów oraz wydzielanych przez nie czynników parakrynnych. Ludzkie komórki nowotworowe przeszcze­pione do obcego organizmu są pozbawione takiego oto­czenia, muszą więc – do właściwego wzrostu – rekrutować mysie zdrowe komórki śródbłonka i macierzy pozakomór­kowej. Przeszczepiając tę samą frakcję ludzkich komórek nowotworowych do różnych rejonów organizmu myszy za­obserwowano, że nie w każdej części ciała powstaje guz. Z kolei suplementacja tych samych przeszczepów zdrowy­mi komórkami macierzy pozakomórkowej, śródbłonka lub mezynchymalnymi znacznie zwiększa prawdopodobień­stwo nowotworzenia. Rodzi się więc pytanie, który z po­wyższych wyników badań odzwierciedla i obrazuje praw­dziwą zdolność onkogenezy komórek nowotworowych [34].

Kolejną niedogodnością w stosowaniu mysiego modelu jest to, że organizmy zwierząt laboratoryjnych z upośledzoną odpornością nie mają limfocytów ani makrofagów – komó­rek, które odgrywają ważną rolę w procesach angiogenezy, metastazy i wzrostu guza. Chociaż badania nad ulepsza­niem mysich modeli do ksenotransplantacji wciąż trwa­ją, możliwe, że nigdy nie będą w stanie w pełni odzwier­ciedlać złożoności procesu nowotworowego człowieka.

Istnienie CSC zakłada, że tylko komórki o charakterze macierzystych mają zdolności do samoodnawiania, nato­miast pozostałe komórki nowotworowe – jeśli nie są za­stępowane przez nowe – wymierają. Według tego założe­nia, zmiany genetyczne mogą akumulować się wyłącznie w komórkach macierzystych, podczas gdy reszta komórek nowotworowych uważana jest za zróżnicowane i ukształ­towane ewolucyjnie. Głównym problemem powyższej hi­potezy jest implikowanie stabilności genetycznej w obrę­bie guza oraz odrzucenie możliwości nabywania fenotypu komórek macierzystych przez bardziej zróżnicowane ko­mórki nowotworowe, co udowodniono w przypadku zróż­nicowanych komórek nowotworowych z nabytą mutacją w obrębie genu β-kateniny [38] lub po aktywacji czynni­ka transkrypcyjnego FOXC2 [4].

Kolejną nieścisłością teorii istnienia CSC jest założenie, że nowotworowe komórki macierzyste od początku wyka­zują oporność na leczenie i tylko eliminacja ich komórek progenitorowych zapewni terapeutyczny sukces. Komórki progenitorowe powinny więc pozostać wrażliwe na che­mioterapię przez cały okres jej trwania, dopóki nie pojawi się oporność. Założenie to – jak wiemy – jest oczywiście błędne, ponieważ jednym z markerów CSC jest podwyż­szona ekspresja białek oporności wielolekowej ABCB1 czy ABCG2 [29,33].

Zwolennicy istnienia CSC sugerują, że mogą one również ewoluować i nabywać genetyczne zmiany zależne od pre­sji środowiskowej w organizmie, co jest sprzeczne z naszą wiedzą o zróżnicowaniu i genetycznej niestabilności no­wotworów. Rozwiązanie zagadki procesu nowotworzenia, w tym istnienia nowotworowych komórek macierzystych, bez wątpienia stanowi jeden z priorytetów współczesnej medycyny, który powinien się przyczynić do udoskonale­nia standardowej terapii onkologicznej.

PIŚMIENNICTWO

[1] Al-Hajj M., Wicha M.S., Benito-Hernandez A., Morrison S.J., Clarke M.F.: Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: 3983-3988
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Alison M.R, Islam S., Wright N.A.: Stem cells in cancer: instigators and propagators? J. Cell Sci., 2010; 123: 2357-2368
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Alison M.R., Lim S.M., Nicholson L.J.: Cancer stem cells: problems for therapy? J. Pathol., 2011; 223: 147-161
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[4] Battula V.L., Evans K.W. Hollier B.G., Shi Y., Marini F.C., Ayyanan A., Wang R.Y., Brisken C., Guerra R., Andreeff M., Mani S.A.: Epithelial-mesenchymal transition-derived cells exhibit multilineage differentiation potential similar to mesenchymal stem cells. Stem Cells, 2010; 28: 1435-1445
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[5] Beier D., Hau P., Proescholdt M., Lohmeier A., Wischhusen J., Oefner P.J., Aigner L., Brawanski A., Bogdahn U., Beier C.P.: CD133⁺ and CD133^– glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res., 2007; 67: 4010-4015
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[6] Bishop J.: Wczesny rozwój zarodkowy. W: Ssaki transgeniczne. Red: Krystyna Kruczyńska, Irena Zienkiewicz. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001: 45-48

[7] Borovski T., De Sousa E Melo F., Vermeulen L., Medema J.P.: Cancer stem cell niche: the place to be. Cancer Res., 2011; 71: 634-639
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[8] Bosma G.C., Davisson M.T., Ruetsch N.R., Sweet H.O., Shultz L.D., Bosma M.J.: The mouse mutation severe combined immune deficiency (SCID) is on chromosome 16. Immunogenetics, 1989; 29: 54-57
[PubMed]  

[9] Brestovitsky A., Sharf R., Mittelman K., Kleinberger T.: The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic Acids Res., 2011; 39: 6414-6427
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[10] Calvi L.M, Adams G.B. Weibrecht K.W., Weber J.M., Olson D.P., Knight M.C., Martin R.P., Schipani E., Divieti P., Bringhurst F.R., Milner L.A., Kronenberg H.M., Scadden D.T.: Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature, 2003; 425: 841-846
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[11] Chhabra P., Brayman K.L.: Current status of immunomodulatory and cellular therapies in preclinical and clinical islet transplantation. J. Transplant., 2011; 2011: 637692
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[12] Clarke M.F., Fuller M.: Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell, 2006; 124: 1111-1115
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[13] Davidson College, Davidson, Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Department of Biology, (03.01.2012) http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/FACS.html

[14] Fang D., Nguyen T.K. Leishear K., Finko R., Kulp A.N., Hotz S., Van Belle P.A., Xu X., Elder D.E., Herlyn M.: A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res., 2005; 65: 9328-9337
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[15] Ghavami S., Asoodeh A., Klonisch T., Halayko A.J., Kadkhoda K., Kroczak T.J., Gibson S.B., Booy E.P., Naderi-Manesh H., Los M.: Brevinin-2R(1) semi-selectively kills cancer cells by a distinct mechanism, which involves the lysosomal-mitochondrial death pathway. J. Cell. Mol. Med., 2008; 12: 1005-1022
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[16] Guérin O., Formento P., Lo Nigro C., Hofman P., Fischel J.L., Etienne-Grimaldi M.C., Merlano M., Ferrero J.M., Milano G.: Supra-additive antitumor effect of sunitinib malate (SU11248, Sutent^®) combined with docetaxel. A new therapeutic perspective in hormone refractory prostate cancer. J. Cancer Res. Clin. Oncol., 2008; 134: 51-57
[PubMed]  

[17] Hang D., Dong H.C., Ning T., Dong B., Hou D.L., Xu W.G.: Prognostic value of the stem cell markers CD133 and ABCG2 expression in esophageal squamous cell carcinoma. Dis. Esophagus, 2012 (w druku)
[PubMed]  

[18] Jacobs J.J., Kieboom K., Marino S., DePinho R.A., van Lohuizen M.: The oncogene and Polycomb-group gene bmi-1 regulates cell proliferation and senescence through the ink4a locus. Nature, 1999; 397: 164-168
[PubMed]  

[19] Jensen J.B., Parmar M.: Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol. Neurobiol., 2006; 34: 153-161
[PubMed]  

[20] Ji Q., Karnak D., Hao P., Wang R., Xu L.: No small matter: microRNAs – key regulators of cancer stem cells. Int. J. Clin. Exp. Med., 2010; 3: 84-87
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[21] Jung Y.W., Hysolli E., Kim K.Y., Tanaka Y., Park I.H.: Human induced pluripotent stem cells and neurodegenerative disease: prospects for novel therapies. Curr. Opin. Neurol., 2012; 25: 125-130
[PubMed]  

[22] Kelly P.N., Dakic A., Adams J.M., Nutt S.L., Strasser A.: Tumor growth need not be driven by rare cancer stem cells. Science, 2007; 317: 337
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[23] Kern S.E., Shibata D.: The fuzzy math of solid tumor stem cells: a perspective. Cancer Res., 2007; 67: 8985-8988
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[24] Klonisch T., Wiechec E., Hombach-Klonisch S., Ande S.R., Wesselborg S., Schulze-Osthoff K., Los M.: Cancer stem cell markers in common cancers – therapeutic implications. Trends Mol. Med., 2008; 14: 450-460
[PubMed]  

[25] Lee H.J., You D.D., Choi D.W., Choi Y.S., Kim S.J., Won Y.S., Moon H.J.: Significance of CD133 as a cancer stem cell markers focusing on the tumorigenicity of pancreatic cancer cell lines. J. Korean Surg. Soc., 2011; 81: 263-270
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[26] Lenaerts L., De Clercq E., Naesens L.: Clinical features and treatment of adenovirus infections. Rev. Med. Virol., 2008; 18: 357-374
[PubMed]  

[27] Lessard J., Sauvageau G.: Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells. Nature, 2003; 423: 255-260
[PubMed]  

[28] Mitsuyasu R.T., Zack J.A., Macpherson J.L., Symonds G.P.: Phase I/II clinical trials using gene-modified adult hematopoietic stem cells for HIV: lessons learnt. Stem Cells Int., 2011; 2011: 393698
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[29] Nakanishi T., Ross D.D.: Breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2): its role in multidrug resistance and regulation of its gene expression. Chin. J. Cancer, 2012; 31: 73-99
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[30] Papailiou J., Bramis K.J., Gazouli M., Theodoropoulos G.: Stem cells in colon cancer. A new era in cancer theory begins. Int. J. Colorectal Dis., 2011; 26: 1-11
[PubMed]  

[31] Quintana E., Shackleton M., Sabel M.S., Fullen D.R., Johnson T.M., Morrison S.J.: Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature, 2008; 456: 593-598
[PubMed]  

[32] Reddy N., Greer J.P., Goodman S., Kassim A., Morgan D.S., Chinratanalab W., Brandt S., Englehardt B., Oluwole O., Jagasia M.H., Savani B.N.: Consolidative therapy with stem cell transplantation improves survival of patients with mantle cell lymphoma after any induction regimen. Exp. Hematol., 2012; 40: 359-366
[PubMed]  

[33] Schumacher U., Nehmann N., Adam E., Mukthar D., Slotki I.N., Horny H.P., Flens M.J., Schlegelberger B., Steinemann D.: MDR-1-overexpression in HT 29 colon cancer cells grown in SCID mice. Acta Histochem., 2012; 114: 594-602
[PubMed]  

[34] Shipitsin M., Polyak K.: The cancer stem cell hypothesis: in search of definitions, markers, and relevance. Lab. Invest., 2008; 88: 459-463
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[35] Silber J., Lim D.A., Petritsch C., Persson A.I., Maunakea A.K., Yu M., Vandenberg S.R., Ginzinger D.G., James C.D., Costello J.F., Bergers G., Weiss W.A., Alvarez-Buylla A., Hodgson J.G.: miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Med., 2008; 6: 14
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[36] Spradling A., Drummond-Barbosa D., Kai T.: Stem cells find their niche. Nature, 2001; 414: 98-104
[PubMed]  

[37] Stem Cell Information: The National Institutes of Health resource for stem cell research. (15.02.2012) http://stemcells.nih.gov/info

[38] Varnat F., Duquet A., Malerba M., Zbinden M., Mas C., Gervaz P., Altaba A.R.: Human colon cancer epithelial cells harbour active HEDGEHOG-GLI signalling that is essential for tumour growth, recurrence, metastasis and stem cell survival and expansion. EMBO Mol. Med., 2009; 1: 338-351
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[39] Wang J.C., Dick J.E.: Cancer stem cells: lessons from leukemia. Trends Cell Biol., 2005; 15: 494-501
[PubMed]  

[40] Woodward W.A., Sulman E.P.: Cancer stem cells: markers or biomarkers? Cancer Metastasis Rev., 2008; 27: 459-470
[PubMed]  

[41] Yamashita Y.M., Jones D.L., Fuller M.T.: Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science, 2003; 301: 1547-1550
[PubMed]  

[42] Zhang K., Waxman D.J.: PC3 prostate tumor-initiating cells with molecular profile FAM65B^high/MFI2^low/LEF1^low increase tumor angiogenesis. Mol. Cancer, 2010; 9: 319
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[43] Zhang Y., Zhang H., Wang X., Wang J., Zhang X., Zhang Q.: The eradication of breast cancer and cancer stem cells using octreotide modified paclitaxel active targeting micelles and salinomycin passive targeting micelles. Biomaterials, 2012; 33: 679-691
[PubMed]  

Autorki deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu