Streszczenie

Nadmierna hemoliza nieodłącznie towarzyszy wielu wrodzonym i nabytym chorobom wliczając w to anemię sierpowatą (SCD), czerwienicę, nocną napadową hemoglobinurię (PNH) czy po­lekowe niedokrwistości hemolityczne. Mimo różnej etiopatologii tych chorób, towarzyszące im objawy są zbliżone i obejmują m.in. nadciśnienie, hemoglobinurię i nadkrzepliwość. Badania ostatnich lat wskazują coraz więcej mechanizmów, leżących u podstaw tych objawów, zwraca­jąc szczególną uwagę na znaczenie wiązania przez wolną hemoglobinę (Hb) tlenku azotu (NO) – endogennego czynnika wazorelaksacyjnego i przeciwzakrzepowego. Wysycenie ochronnych, fizjologicznych mechanizmów usuwania wolnej hemoglobiny, prowadzi do jej nagromadzenia w osoczu i hemoglobinemii. Ciężka hemoglobinemia prowadzi do hemoglobinurii, która może skutkować uszkodzeniem nerek i rozwojem syndromu Fanconiego. Poważnym zagrożeniem cierpiących na SCD i PNH jest nadciśnienie płucne i ogólnoustrojowe. Może ono prowadzić do wstrząsu krążeniowego, wliczając w to udar i jest związane ze zniesieniem biodostępności NO dla komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Główną przyczyną zgonu pacjentów cho­rych na SCD i PNH są epizody zakrzepowe. Ich występowanie jest związane z brakiem hamo­wania płytek krwi przez NO w wyniku jego wiązania przez wolną Hb. Poważnym problemem cierpiących na choroby przebiegające z nadmierną hemolizą są zaburzenia erekcji. Także bez­pośrednie cytotoksyczne, prooksydacyjne i prozapalne działanie wolnej hemoglobiny i wolnego hemu składają się na obraz kliniczny chorób hemolitycznych. W pracy przedstawiono aktualny stan wiedzy na temat pojawiania się w osoczu wolnej Hb, mechanizmów jej usuwania oraz inte­rakcji Hb z NO i patofizjologiczncyh konsekwencji tych procesów. Zrozumienie krytycznej roli hemolizy i wolnej Hb jest istotne z punktu widzenia leczenia pacjentów i projektowania nowych strategii walki z chorobami hemolitycznymi.

Słowa kluczowe:wolna hemoglobina • hemoliza • tlenek azotu • hemoglobinemia • anemia sierpowata • noc­na napadowa hemoglobinuria • nadciśnienie płucne • zaburzenia erekcji • płytki krwi • stan zapalny

Summary

Abundant hemolysis is associated with a number of inherent and acquired diseases including sic­kle-cell disease (SCD), polycythemia, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and drug-in­duced hemolytic anemia. Despite different etiopathology of hemolytic diseases, many concomitant symptoms are comparable and include e.g. hypertension, hemoglobinuria and hypercoagula­tion state. Studies in the last years have shown a growing list of mechanisms lying at the basis of those symptoms, in particular irreversible reaction between cell-free hemoglobin (Hb) and ni­tric oxide (NO) – endogenous vasorelaxant and anti-thrombotic agent. Saturation of protective physiological cell-free Hb-scavenging mechanisms results in accumulation of Hb in plasma and hemoglobinemia. Extensive hemoglobinemia subsequently leads to hemoglobinuria, which may cause kidney damage and development of Fanconi syndrome. A severe problem in patients with SCD and PNH is pulmonary and systemic hypertension. It may lead to circulation failure, inclu­ding stroke, and it is related to abolition of NO bioavailability for vascular smooth muscle cells. Thrombotic events are the major cause of death in SCD and PNH. It ensues from lack of platelet inhibition evoked by Hb-mediated NO scavenging. A serious complication that affects patients with excessive hemolysis is erectile dysfunction. Also direct cytotoxic, prooxidant and proinflam­matory effects of cell-free hemoglobin and heme compose the clinical picture of hemolytic di­seases. The pathophysiological role of plasma Hb, mechanisms of its elimination, and direct and indirect (via NO scavenging) deleterious effects of cell-free Hb are presented in detail in this re­view. Understanding the critical role of hemolysis and cell-free Hb is important in the perspec­tive of treating patients with hemolytic diseases and to design new effective therapies in future.

Key words:free hemoglobin • hemolysis • nitric oxide • hemoglobinemia • sickle-cell disease • paroxysmal nocturnal hemoglobinuria • pulmonary hypertension • erectile dysfunction • platelets • inflammation

Wykaz skrótów:

AMP – adenozynomonofosforan; ATP – trifosforan adenozyny; cAMP – 3′,5′-cykliczny adenozynomonofosforan; cGMP – cykliczny guanozyno-3′,5′-monofosforan; CO – tlenek węgla; EDRF – śródbłonkowy czynnik rozluźniający; eNOS – środbłonkowa syntaza tlenku azotu; GMP – guanozynomonofosforan; gp IIb/IIIa – glikoproteina IIb/IIIa; GTP – trifosforan guanozyny; Hb – hemoglobina; HDL – lipoproteina o dużej gęstości; HO-1 – oksygenaza hemowa 1; Hp – haptoglobina; Hx – hemopeksyna; ICAM-1 – cząsteczka 1 adhezji międzykomórkowej; IP₃ – inozytolo-1,4,5-trifosforan; IRAG – substrat dla zależnej od cGMP kinazy związany z receptorem inozytolo-1,4,5-trifosforanu; LDH – dehydrogenaza mleczanowa; LDL – lipoproteina o niewielkiej gęstości; metHb – methemoglobina; MLCK – kinaza lekkiego łańcucha miozyny; MLCP – fosfataza lekkiego łańcucha miozyny; NADPH – fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego; NO – tlenek azotu; O₂.- – anionorodnik ponadtlenkowy; ODQ – 1H-[1,2,4]oksadiazolo[4,3-a]chinoksalin-1-on; ONOO^– – nadtlenoazotyn; oxyHb – oksyhemoglobina; PDE3 – fosfodiesteraza 3; PDE5 – fosfodiesteraza 5′ PIP₂ – fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan; PKA – kinaza białkowa A; PKG – kinaza białkowa G; PLC – fosfolipaza C; PNH – nocna napadowa hemoglobinuria; PS – fosfatydyloseryna; SCD – anemia sierpowata; SERCA – sarkoplazmatyczna Ca²⁺-ATPaza; sGC – rozpuszczalna cyklaza guanylanowa; TxA2 – tromboksan A2; VASP – fosfoproteina stymulowana czynnikiem rozluźniającym; VCAM-1 – cząsteczka adhezyjna komórek śródbłonka 1.

Wstęp

Istnienie skutecznych mechanizmów usuwania wolnej he­moglobiny z osocza krwi oraz bardzo efektywna kompart­mentalizacja tego białka wewnątrz erytrocytów sugerują konieczność zapobiegania nadmiernemu nagromadzeniu się wolnej hemoglobiny w osoczu. Lista klinicznych konse­kwencji uwalniania hemoglobiny z erytrocytów w wyniku hemolizy spowodowanej przyczynami wrodzonymi, naby­tymi lub jatrogennymi stale się wydłuża. Istnieje ogrom­na liczba prac dotyczących hemolizy wewnątrznaczynio­wej i klinicznych implikacji hemoglobinemii w przebiegu chorób, takich jak czerwienica, zimna i nocna napadowa hemoglobinuria, anemia sierpowata, talasemie, wrodzo­ne enzymopatie i hemoglobinopatie czy polekowe niedo­krwistości hemolityczne [2,17,36,40,69]. Obraz klinicz­ny wymienionych chorób jest odmienny, istnieją jednak wspólne objawy związane z towarzyszącą tym schorze­niom hemoglobinemią. Spośród następstw hemolizy we­wnątrznaczyniowej przede wsystkim należy wymienić anemię, nadciśnienie płucne, występowanie epizodów zakrzepowych i inne nieprawidłowości dotyczące ukła­dów krwionośnego, pokarmowego, moczowo-płciowego i oddechowego [36,71,78]. Wiele z tych zaburzeń można tłumaczyć opierając się na mechanizmie nieodwracalnej reakcji hemoglobiny (Hb) z tlenkiem azotu (NO), któ­ra zachodzi z dużą szybkością i uniemożliwia dyfuzję NO z miejsc wytwarzania do miejsc docelowych, a tym samym wyklucza jego rolę jako parakrynnej cząsteczki sygnałowej [27,42]. Inne zaburzenia są wynikiem bez­pośredniego cytotoksycznego, prooksydacyjnego i pro­zapalnego działania wolnej hemoglobiny oraz uwalnia­jącego się z niej hemu [74].

Od czasu odkrycia roli NO jako czynnika regulującego napięcie mięśni naczyń krwionośnych oraz odpowiada­jącego za homeostazę wewnątrznaczyniową, szczególne zainteresowanie badaczy skupiło się na interakcji hemo­globiny z NO u ssaków. W literaturze światowej bardzo dobrze udokumentowana została rola NO także w takich procesach jak aktywacja i agregacja płytek krwi, utrzy­manie napięcia wazomotorycznego czy ekspresja cząste­czek adhezyjnych komórek śródbłonka naczyń [13,15]. Wydaje się, że mechanizmy homeostazy wewnątrznaczy­niowej ewoluowały w kierunku ograniczenia toksycznego wpływu wolnej Hb. Szybkość reakcji Hb z NO w warun­kach fizjologicznych jest ograniczona kompartmentaliza­cją Hb wewnątrz erytrocytu. Istnieją jednak mechanizmy zapewniające skuteczne wiązanie i eliminację zewnątrz­komórkowej Hb w czasie prawidłowej, fizjologicznej he­molizy, nieniosącej ze sobą zauważalnych negatywnych skutków. W pracy podjęto próbę syntezy aktualnej wie­dzy na temat pojawiania się wolnej Hb i hemu w osoczu, mechanizmów ich usuwania, interakcji Hb z NO i czynni­ków ten proces modulujących, ze szczególnym uwzględ­nieniem szlaków transdukcji sygnału oraz klinicznych im­plikacji tych procesów.

Mechanizmy usuwania wolnej hemoglobiny i hemu z osocza

Po uwolnieniu Hb z erytrocytu białko to przedostaje się do fazy płynnej osocza, gdzie z formy tetrameru przechodzi w formę dimeryczną. Następnie wiąże się z tetramerycz­nym białkiem osoczowym – haptoglobiną (Hp), tworząc niedysocjujący kompleks. Kompleks tych białek nie ule­ga przesączaniu nerkowemu, co zapobiega utracie żelaza. Kompleks hemoglobina-haptoglobina prezentuje neoepi­top receptora zmiatającego CD163 obecnego na powierzch­ni błony makrofagów i monocytów. Następnie odbywa się związanie kompleksu do tego receptora, endocytoza i de­gradacja wewnątrz komórek fagocytujących. W przypad­ku wiązania przez makrofagi dotyczy to głównie komórek Kupffera (makrofagi osiadłe w zatokach wątroby). Podczas tego procesu nie dochodzi do uwolnienia wolnej Hp i jej powrotu do osocza, dlatego też podczas wzmożonej hemo­lizy, np. w anemii sierpowatej, stężenie osoczowej Hp jest często poniżej progu detekcji tego białka. Możliwa jest tak­że bezpośrednia interakcja pomiędzy Hb a CD163, jednak z mniejszym powinowactwem niż powyższa reakcja [57]. Buehler i wsp. udowodnili protekcyjną rolę Hp względem Hb, znajdującej się z nią w kompleksie, przed uszkodze­niami oksydacyjnymi. Nieodwracalna modyfikacja oksy­dacyjna, zachodząca np. podczas stanów zapalnych, utrud­nia wychwytywanie wolnej, niezwiązanej z haptoglobiną Hb przez receptor CD163. Natomiast w postaci kompleksu z Hp, Hb jest mniej podatna na uszkodzenia oksydacyjne, co pozwala na bardziej efektywne jej usuwanie z osocza [10]. U człowieka gen kodujący Hp występuje w postaci allelicznej, w związku z tym możliwe są trzy genotypy, określane mianem Hp1-1, Hp 2-1 oraz Hp 2-2. Hp 1-1 wy­kazuje najwyższe powinowactwo do wolnej Hb, allotyp Hp 2-1 pośrednie, a Hp 2-2 najsłabsze [46]. Jeżeli ilość ze­wnątrzkomórkowej Hb przewyższa możliwości wiązania jej przez Hp, wówczas dochodzi do gromadzenia wolnej Hb w osoczu i wystąpienia hemoglobinemii [4].

Obserwacje Borsody’ego i wsp. dowodzą, że u pacjentów z allelem Hp 2 znacznie częściej dochodzi do skurczu tęt­nic mózgowych po krwotoku podpajęczynówkowym niż u pacjentów z allelem Hp 1 [7]. Także w wywołanym eks­perymentalnie krwawieniu podpajęczynówkowym u trans­genicznych myszy z allelem Hp 2 skurcz tętnic mózgo­wych występował wyraźnie częściej niż u myszy z allelem Hp 1 [12]. Azarov i wsp. wykazali, że kompleks Hb z Hp allotypu 2 jest wiązany i usuwany przez receptor CD163 z wydajnością 2-3-krotnie mniejszą niż kompleks Hb-Hp 1. Związana w kompleks z hemopeksyną wolna Hb posiada podobny potencjał do wiązania NO jak wolna Hb [4]. Dłuższy czas półtrwania kompleksów Hb-Hp 2 w po­równaniu do Hb-Hp 1 sprawia więc, że można uznać ge­notyp Hp 2-2 za czynnik ryzyka w wypadku krwawienia w ośrodkowym układzie nerwowym, mogącym skutkować udarem zatorowym.

Hem, stanowiący element wiążący tlen w cząsteczce Hb – hem (Fe²⁺) może być utleniany do postaci – hem (Fe³⁺), która jest uwalniana z części białkowej Hb, a następnie wiązana z dużym powinowactwem przez osoczową gli­koproteinę – hemopeksynę (Hx). Kompleks Hx-hem pre­zentuje neoepitop, który rozpoznawany jest przez recep­tor zmiatający CD91 komórek Kupffera [50]. Podobnie jak w przypadku Hp obniżone stężenie Hx w osoczu jest mar­kerem wewnątrznaczyniowej hemolizy (ryc. 1). Wysycenie wszystkich wolnych cząsteczek Hp i Hx w osoczu, co może wystąpić w przebiegu ostrej bądź przewlekłej hemolizy, powoduje nagromadzenie Hb i hemu w osoczu i moczu. Powoduje to wiele niekorzystnych konsekwencji – Hb z bar­dzo dużą wydajnością wiąże NO, natomiast hem jest czyn­nikiem prozapalnym i prooksydacyjnym [1].

Ryc. 1. Mechanizmy usuwania wolnej Hb i hemu z osocza. Szczegóły w tekście [47, zmodyfikowano]

Mechanizmy ograniczające reakcje hemoglobiny z tlenkiem azotu

Główną reakcją zachodzącą między NO a Hb jest reak­cja dioksygenacji z utlenowaną Hb – oksyhemoglobiną, w wyniku której powstają methemoglobina i anion azo­tanowy (V) (reakcja 1). Stałą szybkości tej reakcji okre­śla się w granicach 6-8×10⁷ M^-1s^-1 [47]. Podobnie przed­stawia się szybkość reakcji NO z nieutlenowaną Hb [4].

W warunkach fizjologicznych oprócz mechanizmów utrzy­mujących kompartmentalizację Hb wewnątrz erytrocy­tu (integralność błon plazmatycznych) oraz usuwających wolną Hb z osocza, istnieją naturalne bariery, które znacz­nie ograniczają reakcję NO z Hb znajdującą się wewnątrz erytrocytu. Należy wymienić tu:
• strefę wolną od erytrocytów,
• „martwą strefę” (unstirred layer) otaczającą erytrocyt oraz
• właściwą barierę błonową erytrocytu.

Współistnienie tych trzech naturalnych barier ogranicza reaktywność NO z Hb znajdującą się wewnątrz erytrocy­tu prawie 1000-krotnie [31].

Pierwszą zewnętrzną barierą jest strefa wolna od erytrocy­tów (co za tym idzie także od hemoglobiny) znajdująca się w bezpośrednim sąsiedztwie komórek śródbłonka naczynia. Jej istnienie jest spowodowane występowaniem gradientu prędkości w laminarnym przepływie krwi przez naczynie. Zgodnie z prawem Bernoulliego w centralnej części naczynia krwionośnego prędkość przepływu krwi jest większa, tam też panuje niższe ciśnienie niż w strefie przy ścianie naczy­nia. Gradient ciśnień kieruje erytrocyty w kierunku środka osi przepływu krwi przez naczynie – w ten sposób powsta­je strefa wolna od erytrocytów [31]. Taki sposób przepływu krwi wiąże się z powstawaniem naprężeń ścinających (she­ar stress), które stymulują komórki śródbłonka do wytwa­rzania NO [34,68]. Istnienie strefy wolnej od erytrocytów wydłuża czas półtrwania NO około 1000-krotnie [30]. Liao i wsp. stwierdzili, że ilość Hb zamkniętej w erytrocytach, która jest wymagana do wygenerowania skurczu modelo­wego naczynia krwionośnego jest 1000-krotnie większa niż ilość wolnej Hb, która powoduje ekwiwalentny skurcz [55].

Drugim rodzajem zewnętrznej bariery ograniczającej re­akcje NO z Hb jest obecność tzw. „martwej strefy” wokół erytrocytu. W doświadczeniach z wykorzystaniem tech­niki stopped-flow, w których dokonywano nagłego zmie­szania NO z erytrocytami wykazano istnienie regionu otaczającego erytrocyty, który nawet podczas gwałtowne­go mieszania pozostawał nieruchomy. Stanowił on dodat­kową przestrzeń, przez którą NO musiał przedyfundować, co spowalniało przedostawanie się NO do wnętrza erytro­cytu [16,31]. Liu i inni autorzy uważają, że „martwa stre­fa” wokół erytrocytu jest głównym czynnikiem ogranicza­jącym dyfuzję NO do wnętrza krwinki [37].

Po odkryciu znaczącej roli „martwej strefy” wokół erytro­cytu jako głównego ogranicznika dyfuzji NO do erytrocy­tu, zaproponowano inną, fizyczną barierę dyfuzyjną zwaną „właściwą barierą błonową” (intrinsic membrane barrier). W wielu badaniach polegających na chemicznych i fizycz­nych modyfikacjach błony oraz białek błonowych uzyska­no wyniki sugerujące istotny wpływ błon erytrocytarnych na szybkość zużywania NO [21]. Te doniesienia są jednak kontrowersyjne zważywszy, że NO ma zbliżone właściwo­ści przenikania błon plazmatycznych do tlenu. Integralność błon erytrocytu zapobiega przedostawaniu się do osocza arginazy – enzymu katalizującego rozkład argininy do or­nityny, a tym samym ograniczającego dostępność substra­tu do syntezy NO, jakim jest arginina [17] (ryc. 2). Udział każdej z wyżej wymienionych barier w ograniczaniu inte­rakcji Hb z NO jest obecnie obiektem intensywnych badań.

Ryc. 2. Mechanizmy ograniczające wiązanie NO przez Hb. Szczegóły w tekście [23, zmodyfikowano]

Interakcje hemoglobiny z tlenkiem azotu

Za prawidłowe wartości całkowitej Hb we krwi dorosłego człowieka przyjmuje się 13-18 g/dl u mężczyzn, 12-15 g/dl u kobiet, 11-16 g/dl u dzieci. Wartość Hb spada podczas ciąży przeważnie do 11-12 g/dl [39]. Hb zamknięta w obrę­bie erytrocytów ma zdolność wychwytywania NO, jednak reakcja ta jest limitowana przez wiele czynników omówio­nych wcześniej. Erytrocyty są zbyt duże, by móc przeni­kać poza obręb światła naczynia krwionośnego. Może to jednak czynić Hb, która w wyniku hemolizy wydostaje się z erytrocytu i może przedostawać się w pobliże komó­rek śródbłonka i strefy podśródbłonkowej, a więc bezpo­średnio do źródła wytwarzania NO. Wolna Hb ma zatem większy potencjał wychwytywania NO niż Hb zawarta w erytrocytach, gdyż:
• może przedostawać się do strefy wolnej od erytrocytów,
• ma zdolność penetrowania strefy podśródbłonkowej oraz
• nie jest ograniczona przez bariery dyfuzyjne erytrocytu.

Biorąc pod uwagę, że reakcja Hb z NO jest nieodwracal­na, a przy tym szybka, stosunkowo niewielka ilość wol­nej Hb może doprowadzić do całkowitego związania śródbłonkowego NO i dysfunkcji śródbłonka. Na przy­kład już 0,01 g/dl wolnej Hb całkowicie blokuje rozkurcz pierścienia aorty poddanego ekspozycji na acetylocholinę [55]. W przebiegu anemii sierpowatej stężenia Hb, które stwierdza się w osoczu pacjentów mieszczą się w zakre­sie 0,001-0,041 g/dl. U chorych tych stwierdza się często nadciśnienie płucne oraz wyraźne osłabienie rozkurczo­wego działania donorów NO, takich jak nitroprusydek so­dowy i nitrogliceryna. U pacjentów z anemią sierpowatą, w badaniach in vitro, uzyskano wysoką korelację (R=0,92) między spadkiem biodostępności NO a stężeniem wolnej Hb w osoczu [55]. Przyjmuje się, że u chorych ze stęże­niem wolnej Hb wyższym niż 0,01 g/dl odnotowuje się 80% redukcję zależnych od NO odpowiedzi związanych z przepływem krwi [55]. Na potwierdzenie tego mecha­nizmu przytoczyć można wyniki doświadczeń, w których wstrzyknięcie osocza pochodzącego od pacjenta z anemią sierpowatą, znosiło wazorelaksacyjne działanie donorów NO na krążenie w przedramieniu osoby zdrowej [18]. Podobne wyniki uzyskano w badaniach transgenicznych myszy z anemią sierpowatą. U zwierząt tych wykazano także osłabiony wpływ działania donorów NO, skorelo­wany z poziomem Hb w osoczu [30]. Przytaczane wyżej efekty są nasilone u chorych z nocną napadową hemo­globinurię, drugą obok anemii sierpowatej chorobę, któ­ra traktowana jest jako reprezentatywne schorzenie z he­molizą jako cechą charakterystyczną. W jej przebiegu stężenie Hb w osoczu wynosi typowo 0,05-0,2 g/dl i się­ga 1 g/dl podczas epizodów hemolitycznych. U tych cho­rych znakiem rozpoznawczym wzmożonej hemolizy jest hemoglobinuria, znacznie zwiększona aktywność dehy­drogenazy mleczanowej w osoczu, a także często dysfa­gia, ból brzucha, zaburzenia erekcji, epizody zakrzepowe i przewlekłe zmęczenie [8]. Część wyżej wymienionych objawów stwierdza się także u wielokrotnie dializowa­nych pacjentów, u których stężenie Hb w osoczu może sięgać nawet 3 g/dl [60]. Interesujące wyniki przyniosły badania Donadee i wsp., którzy ocenili, że krew przecho­wywana przez 39 dni w banku krwi wykazuje zbliżone do wolnej Hb efekty wazokonstrykcyjne. W wyniku dłu­giego przechowywania zachodzi hemoliza erytrocytów i/lub zrzucanie mikropęcherzyków erytrocytarnych, któ­re z podobną stałą szybkości co wolna Hb, reagują z NO (~1000 razy szybciej niż Hb w nieuszkodzonych erytro­cytach) [14]. Podkreśla to wagę problemu jakim jest defi­cyt krótko przechowywanej krwi w stacjach krwiodawstwa i bankach krwi oraz zagrożenie dla pacjentów wypływa­jące z tej sytuacji. U podstaw wyżej wymienionych zabu­rzeń leży obecność wolnej Hb w osoczu, która pociąga za sobą wiele uciążliwych oraz niebezpiecznych dla zdrowia i życia chorych działań. Mechanizmy szkodliwego wpływu wolnej Hb na funkcjonowanie niektórych narządów i ko­mórek są intensywnie badane. Niżej przedstawiono aktu­alny stan wiedzy na temat mechanizmu działania wolnej Hb w poszczególnych zaburzeniach.

Hemoglobinuria

Jednym z najczęstszych objawów nasilonej hemolizy, ale także podania preparatów na bazie hemoglobiny, jest wy­stąpienie hemoglobinurii [22]. Hemoglobina jest filtrowa­na w kłębuszkach nerkowych i aktywnie reabsorbowana w kanaliku proksymalnym. W komórkach kanalika prok­symalnego zachodzi uwolnienie żelaza z hemu i magazy­nowanie go w postaci hemosyderyny [55]. Gdy zdolność komórek kanalika proksymalnego do aktywnej reabsorpcji Hb ulegnie wysyceniu, wówczas Hb pojawia się w moczu. Hemoglobinuria może prowadzić do ostrej niewydolno­ści nerek i często współistnieje ze znacznym nagroma­dzeniem hemosyderyny w komórkach kanalików prok­symalnych, rozwojem przewlekłej niewydolności nerek i zespołu Fanconiego (charakteryzującego się zaburze­niem reabsorpcji drobnocząsteczkowych substancji w tym wody, aminokwasów, glukozy i licznych jonów) [26,47,52]. Wyniki najnowszych badań wskazują, że wolna Hb poja­wiająca się we krwi pacjentów po transplantacjach (np. serca), operacji pomostowania aortalno-wieńcowego oraz wielokrotnych hemodializ, może występować w podwyż­szonym stężeniu przez relatywnie długi okres rekonwale­scencji. Skutkiem tego może być rozwinięcie przewlekłe­go zapalenia nerek z charakterystycznymi zmianami, np. nekroza komórek kanalików proksymalnych czy obniże­nie klirensu kreatyniny [42,70,81].

Wpływwolnej hemoglobiny na napięcie mięśni gładkich naczynia krwionośnego

NO jest środbłonkowym czynnikiem rozluźniającym (EDRF – endothelium-derived relaxing factor), który reguluje stan napięcia mięśni gładkich naczyń krwionośnych. W komór­kach śródbłonka naczyń NO wytwarzany jest z argininy przez śródbłonkową izoformę syntazy tlenku azotu (eNOS – endothelial nitric oxide synthase). Cząsteczki NO dyfundu­ją przez błonę komórek śródbłonka we wszystkich kierun­kach, w tym w kierunku warstwy komórek mięśni gładkich naczynia, leżących bezpośrednio pod warstwą śródbłonka. Mechanizm wazorelaksacyjnego działania NO opiera się na aktywacji rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej (sGC – soluble guanylate cyclase) w komórkach mięśni gładkich naczynia. Ten cytosolowy enzym katalizuje reakcję prze­kształcenia GTP w cykliczną postać – cGMP, który jest cząsteczką sygnałową, aktywującą zależną od cGMP ki­nazę białkową – kinazę białkową G (PKG – protein kinase G). Enzym ten jest serynowo-treoninową kinazą, fosforylu­jącą wiele cytosolowych białek, a jednocześnie miejscem rozgałęzienia szlaku transdukcji sygnału. Wynikiem koń­cowym jest zahamowanie możliwości skurczu komórki mięśniowej poprzez spadek cytosolowego stężenia wap­nia i regulacyjną modyfikację miozyny [25,63]. W mio­cytach naczynia krwionośnego swoistym substratem dla PKG jest fosfataza lekkiego łańcucha miozyny (MLCP – myosin light chain phosphatase). Ufosforylowana postać MLCP defosforyluje lekki łańcuch w cząsteczce miozy­ny, co uniemożliwia zajście interakcji miozyny z aktyną. Rezultatem jest brak skurczu komórki mięśniowej, a więc relaksacja mięśniówki naczynia [63].

Innym mechanizmem prowadzącym do relaksacji mięśni gładkich jest obniżenie cytosolowego stężenia jonów wap­nia. Napięcie mięśni gładkich jest regulowane przez cyto­solowe stężenie jonów wapnia. Wzrost stężenia Ca²⁺ jest molekularnym sygnałem do skurczu mięśnia. Mechanizm obniżania wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺ przez NO odbywa się za pośrednictwem szlaku, w którym główną rolę odgrywa PKG [24]. PKG bezpośrednio fosforylu­je błonowy kanał potasowy, co prowadzi do zwiększonej przepuszczalności dla jonów K⁺, które przemieszczają się na zewnątrz komórki. Otwarcie kanałów potasowych po­woduje depolaryzację błony plazmatycznej i zamknięcie obecnych w niej kanałów wapniowych typu L. Skutkiem tego jest ograniczenie napływu jonów Ca²⁺ ze środowiska zewnątrzkomórkowego do cytosolu [63].

Drugi mechanizm prowadzący do ograniczenia cytosolo­wego stężenia Ca²⁺ opiera się na fosforylacji przez PKG białka IRAG (Ins(1,4,5)P-receptor-associated cGKI sub­strate). Białko to po fosforylacji oddziałuje z recepto­rem dla inozytolo-1,4,5-trifosforanu (IP₃). Receptor ten umiejscowiony jest w błonie retikulum endoplazmatycz­nego i pełni funkcję kanału wapniowego. IP₃ jest produk­tem hydrolizy fosfolipidu błonowego – fosfatydyloino­zytolo-4,5-bisfosforanu (PIP₂) przez fosfolipazę C (PLC – phospholipase C) i pełni funkcję wtórnego przekaźni­ka sygnału. Oddziaływanie białka IRAG z receptorem IP₃ hamuje wypływ Ca²⁺ z retikulum endoplazmatycznego, które jest wewnątrzkomórkowym rezerwuarem Ca²⁺ [59]. W komórkach mięśni gładkich dominującą postacią PKG jest izoforma PKG typu Iβ, dla której głównym substra­tem jest białko IRAG. Wskazuje to, że głównym mecha­nizmem oddziaływania NO/cGMP na stężenie wewnątrz­komórkowego Ca²⁺ w mięśniach gładkich naczynia jest fosforylacja białka IRAG [25].

Kolejny mechanizm obniżający cytosolowe stężenie Ca²⁺ opiera się na bezpośredniej, niezależnej od PKG, aktywa­cji przez NO sarkoplazmatycznej Ca²⁺-ATP-azy (SERCA – sarco/endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase). Enzym ten pełni funkcję zależnej od ATP pompy wapniowej trans­portującej jony Ca²⁺ z cytosolu do magazynów wewnątrz­komórkowych. W ten sposób obniżone zostaje cytosolo­we stężenie jonów wapnia po aktywacji (której towarzyszy powstanie sygnału wapniowego) do poziomu spoczynko­wego. NO poprzez stymulację pompy SERCA przyczy­nia się do napełnienia wewnątrzkomórkowych magazy­nów wapniowych, ograniczenia napływu jonów Ca²⁺ do cytosolu i w konsekwencji do obniżenia wewnątrzkomór­kowego stężenia jonów Ca²⁺ [49] (ryc. 3).

Ryc. 3. NO oddziałuje na wiele wewnątrzkomórkowych szlaków przekazywania sygnału w komórkach mięśni gładkich. Objawia się to wzrostem wewnątrzkomórkowego stężenia cGMP, spadkiem cytosolowego stężenia jonów Ca²⁺ i relaksacją aparatu kurczliwego komórki. Szczegóły w tekście

Przerwanie powyższych szlaków transdukcji sygnału, w wy­niku ograniczenia biodostępności NO przez Hb, skutkuje zniesieniem kontroli nad napięciem mięśni naczyń krwio­nośnych, skurczem mięśni ściany naczynia i w rezultacie wzrostem ciśnienia.

Nadciśnienie tętnicze

Wzrost ciśnienia tętniczego jest jednym z głównych skut­ków wewnątrznaczyniowej hemolizy. Towarzyszy on takim chorobom jak: wrodzone i nabyte anemie hemolityczne, w tym anemia sierpowata [11,19,44]], talasemie [45,64], nocna napadowa hemoglobinuria [23,24], wrodzona sfe­ro- i stomatocytoza [28], mikroangiopatyczne anemie he­molityczne. Obecnie panuje zgodność, co do mechani­zmu powstawania nadciśnienia w chorobach związanych z hemolizą. Za główną przyczynę uznaje się zużywanie NO przez uwolnioną z erytrocytów Hb, co prowadzi do skurczu mięśni gładkich naczyń krwionośnych i w re­zultacie do wzrostu ciśnienia tętniczego [29,32,38,43]. Nadciśnienie jest jednym z głównych czynników wpły­wających na jakość życia chorych z wewnątrznaczynio­wą hemolizą i może prowadzić do śmierci wskutek udaru, będącego główną przyczyną zgonu u chorych na anemię sierpowatą, zwłaszcza u dzieci. Często w tych schorzeniach nadciśnieniu towarzyszy tendencja do powstawania zakrze­pów. U chorych stwierdza się zakrzepy w drobnych na­czyniach krwionośnych, a także w głęboko położonych, dużych żyłach i tętnicach. Potęguje to ryzyko udaru nie­dokrwiennego mózgu i stanowi bezpośrednie zagrożenie dla życia chorych [11] (ryc. 4). Podawanie donorów NO, takich jak nitrogliceryna czy nitroprusydek sodowy, cier­piącym na związane z hemolizą nadciśnienie powodowa­ło relaksację mięśni naczyń krwionośnych i obniżenie ciśnienia [55]. Podobny efekt obserwowany był podczas inhalacji NO [65]. Wczesne doświadczenia z zastosowa­niem preparatów krwiozastępczych na bazie roztworów Hb związane były z problemem wzrostu ciśnienia u pa­cjentów, co stanowiło zagrożenie dla ich życia. Jednak, jak wykazali Yu i wsp., podawanie tych preparatów bez szkodliwego wzrostu ciśnienia jest możliwe przy zapew­nieniu jednoczesnej inhalacji NO przez pacjenta [79]. Jest to związane z całkowitym zniesieniem biodostępności NO dla komórek mięśni gładkich naczynia i w konsekwencji z niemożnością relaksacji mięśniówki naczynia. Skutkuje to nagłym skurczem mięśni naczynia i wzrostem ciśnie­nia. Potwierdza to rolę dostępności NO w etiopatologii nadciśnienia związanego z hemolizą i stanowi wyznacz­nik kierunku poszukiwań skutecznych środków do walki z tą postacią nadciśnienia.

Ryc. 4. W przebiegu anemii sierpowatej dochodzi do nadmiernej hemolizy erytrocytów. Uwalniana z komórek Hb wiąże NO, natomiast wydostająca się z nich arginaza ogranicza syntezę NO de novo. Wolna Hb może indukować powstawanie anionorodnika ponadtlenkowego (O^₂.-) poprzez stymulację oksydazy ksantyny lub oksydazy NADPH. W wyniku spontanicznej reakcji NO z O^₂.- powstaje bardzo reaktywny nadtlenoazotyn (ONOO^–). Spadek biodostępności NO powoduje aktywację płytek krwi. Ulegające hemolizie erytrocyty eksponują ponadto na zewnętrznej monowarstwie błony plazmatycznej fosfatydyloserynę (PS), co prowadzi do aktywacji trombiny i powstawania zakrzepów [10, zmodyfikowano]

Zaburzenia erekcji

Częstym problemem u chorych z podwyższonym stęże­niem wolnej Hb w osoczu są zaburzenia erekcji. Przyczynę tej dysfunkcji upatruje się w wychwytywaniu NO przez wolną Hb. NO wytwarzany jest przez stymulowane ko­mórki nerwowe unerwiające ciała jamiste penisa oraz ko­mórki śródbłonka naczyń. NO jest czynnikiem warunku­jącym relaksację mięśni gładkich naczyń odpowiadających za doprowadzenie krwi do ciał jamistych, czego następ­stwem jest pełna erekcja [61]. W sytuacji niedoboru NO nie jest możliwy dostateczny rozkurcz mięśniówki tychże naczyń i stąd zaburzenia erekcji. Mechanizm relaksujące­go działania NO na komórki mięśni gładkich przedstawio­no wcześniej. Związki będące inhibitorami fosfodiestera­zy 5 (PDE5 – phosphodiesterase 5), takie jak sildenafil, wardenafil, tadalafil czy awanafil hamują rozkład cGMP do GMP. Zastosowanie tych leków prowadzi do akumula­cji cGMP w komórkach mięśni gładkich naczyń, co umoż­liwia ich relaksację i w rezultacie erekcję [35]. Inhibitory PDE5 okazały się skuteczne nie tylko w leczeniu zaburzeń erekcji, ale też nadciśnienia spowodowanego obecnością wolnej Hb w osoczu [33,48].

Wpływ wolnej hemoglobiny na płytki krwi

Zwiększona aktywność płytek krwi jest poważnym objawem towarzyszącym chorobom, których przebieg jest związany z pojawieniem się wolnej Hb w osoczu. Epizody zakrzepo­we często występują u chorych na anemię sierpowatą [71] oraz stanowią główną przyczynę zgonu u chorych na noc­ną napadową hemoglobinurię [55]. Mechanizm hamującego wpływu NO na płytki polega głównie na blokowaniu wzrostu cytosolowego stężenia jonów Ca²⁺, hamowaniu reorganizacji cytoszkieletu oraz wytwarzaniu energii w mitochondriach.

NO aktywuje w płytkach sGC, która wytwarza cGMP. Prowadzi to do aktywacji PKG, której przypisuje się rolę w hamowaniu aktywności płytek, w tym agregacji, sekre­cji, aktywacji receptorów integrynowych i reorganizacji cytoszkieletu [75]. Poznano część mechanizmów hamo­wania aktywności płytek krwi przez PKG. Jednym z nich jest fosforylacja białka VASP (vasodilator-stimulated pho­sphoprotein), które reguluje dynamikę powstawania aktyny F poprzez wiązanie się do mikrofilamentów aktynowych i monomerów aktyny [77]. Fosforylacja swoistej reszty se­ryny w białku VASP dodatnio koreluje z zahamowaniem agregacji płytek, wiązania fibrynogenu do receptorów in­tegrynowych gp IIb/IIIa i adhezji płytek [58,77].

Innym scharakteryzowanym w płytkach mechanizmem jest, podobnie jak w mięśniach gładkich, fosforylacja przez PKG białka IRAG, co skutkuje zahamowaniem napływu do cy­tosolu Ca²⁺ z magazynów wewnątrzkomórkowych (układu kanalików gęstych) [3]. PKG może też fosforylować recep­tor tromboksanowy, co uniemożliwia jego interakcje z biał­kiem G po związaniu agonisty. W rezultacie blokuje to szlak transdukcji sygnału biegnący od receptora tromboksano­wego poprzez PLC do IP₃ [25]. Wyniki badań Massberga i wsp. z wykorzystaniem myszy pozbawionych genu PKG typu I dowodzą, że PKG niewątpliwie pełni funkcję anty­agregacyjną. W badaniu tym płytki myszy pozbawionych genu PKG okazały się niewrażliwe na działanie NO oraz analogów cGMP [41]. Podobnie jak w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych, także w ludzkich płytkach krwi, w systemie kanalików gęstych, znajduje się pompa SERCA aktywowana przez NO [67]. Obniżenie cytosolo­wego stężenia jonów Ca²⁺ uniemożliwia aktywację kinazy lekkiego łańcucha miozyny (MLCK – myosine light cha­in kinase), przez co hamuje zmianę kształtu płytek, a tym samym adhezję i agregację [58].

cGMP per se także hamuje odpowiedzi płytek krwi. W du­żych stężeniach hamuje on fosfodiesterazę 3 (PDE3 – pho­sphodiesterase 3), która odpowiada za hydrolizę cAMP (i w mniejszym stopniu cGMP) do postaci niecyklicznej – AMP (i analogicznie GMP) [6]. W rezultacie dochodzi do nagromadzenia cAMP w cytosolu, co pociąga za sobą wiele hamujących działań. Hamujące działanie podwyż­szonego stężenia cAMP na proces aktywacji płytek polega na jego oddziaływaniu na kinazę białkową A (PKA – pro­tein kinase A), co powoduje oddysocjowanie jej aktyw­nej podjednostki katalitycznej. Podjednostka ta aktywuje pompę wapniową, umiejscowioną w błonach układu kana­lików gęstych, co powoduje transport jonów Ca²⁺ z cyto­solu do wewnątrzkomórkowych magazynów [80] (ryc. 5).

Ryc. 5. NO działa hamująco na odpowiedzi płytek krwi poprzez wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia cGMP i cAMP, spadek cytosolowego stężenia jonów Ca²⁺, hamowanie wytwarzania energii w mitochondriach, inaktywację receptora TxA₂ oraz blokowanie interakcji aktyny z miozyną. Szczegóły w tekście

NO może także hamować sekrecję płytkową (proces w du­żym stopniu zależny od ATP) przez zmniejszenie wytwa­rzania energii w mitochondriach. Zachodzi to poprzez przejściowe wiązanie NO do miejsca wiążącego tlen w oksydoreduktazie cytochrom c: tlen i zmniejszenie w ten sposób jej aktywności [9]. Tomasiak i wsp. wykazali, że za­stosowanie inhibitora sGC – ODQ, nie wpływa na zahamo­wanie wytwarzania energii w mitochondriach płytek wie­przowych poddanych działaniu donorów NO. Dowodzi to bezpośredniego, niezależnego od szlaku cGMP/PKG, ha­mowania wytwarzania energii w płytkach przez NO [66].

NO może także bezpośrednio wpływać na aktywność czynników krzepnięcia, interferując w procesy tworze­nia skrzepu. Na przykład NO modyfikuje czynnik XIII (czynnik stabilizujący skrzep), zmniejszając jego aktyw­ność. Wiązanie NO przez wolną hemoglobinę może więc wzmacniać stabilność skrzepu i utrudniać jego lizę [73].

Biorąc pod uwagę, że zakrzepy wewnątrznaczyniowe stano­wią znaczny procent bezpośredniej przyczyny zgonów w cho­robach hemolitycznych, duży nacisk kładzie się obecnie na opracowanie skutecznych leków znoszących aktywację pły­tek. Zastosowanie znalazły leki będące inhibitorami fosfodie­sterazy 3, swoistej dla płytek krwi, np. dipirydamol, powodu­jący wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia cGMP i cAMP [52]. Villagra i wsp. wykazali natomiast, że sildenafil (inhibi­tor PDE 5) istotnie hamuje ekspresję aktywnych receptorów integrynowych gp IIb/IIIa na powierzchni płytek pacjentów z anemią sierpowatą [72]. Sildenafil potencjalizuje także ha­mujący wpływ donorów NO na aktywację płytek u pacjen­tów z anemią sierpowatą [20]. Ze względu na swoistą ścież­kę aktywacji płytek w chorobach hemolitycznych, polegającą w mniejszym stopniu na aktywacji przez agonistę, a raczej na zniesieniu zależnego od NO hamowania, znalezienie skutecz­nego leku przeciwpłytkowego stanowi skomplikowane wy­zwanie. Konieczne są jednak dalsze intensywne badania nad lekami przeciwpłytkowymi, dające nowe nadzieje na wydłu­żenie i poprawę jakości życia pacjentów.

Prozapalne działanie wolnej hemoglobiny i hemu

W wyniku hemolizy wolna Hb i hem przedostają się do osocza, co niesie ze sobą ryzyko odpowiedzi prozapalnej. Hem prowadzi do aktywacji neutrofilów, a także stymuluje ekspresję cząstek adhezyjnych ICAM-1 (intracellular ad­hesion molecule-1), VCAM-1 (vascular cell adhesion mo­lecule-1) i selektyny E na powierzchni komórek śródbłon­ka in vitro [72]. Ekspresja tych cząstek prawdopodobnie jest związana także z wychwytywaniem NO przez Hb. De Caterina i wsp. wykazali, że NO hamuje indukowaną przez cytokiny ekspresję ICAM-1, VCAM-1 i selektyny E, wyka­zując działanie przeciwzapalne [55]. Wolna Hb z żelazem hemowym w drugim stopniu utlenienia (Fe²⁺) może brać udział w reakcji Fentona, czego następstwem jest genero­wanie ekstremalnie reaktywnego rodnika hydroksylowego.

Jak wykazali Watanabe i wsp., haptoglobina i hemopeksy­na mogą się przyłączać do osoczowych lipoprotein o du­żej gęstości (HDL – high density lipoprotein) i modulować ich funkcje przeciwzapalne. Wolna Hb i wolny hem, które w wyniku hemolizy przedostają się do osocza, mogą być wiązane zarówno przez (odpowiednio) Hp i Hx przyłączo­ne do HDL, jak i przez postaci wolne, krążące w osoczu. Jeżeli Hb zwiąże się z Hp połączoną z HDL, wówczas nie jest możliwe rozpoznanie neoepitopu przez receptor CD163 makrofaga. Analogicznie sytuacja wygląda w przypadku hemu i Hx związanych do HDL i niemożności wychwy­cenia tego kompleksu przez receptor CD91. Autorzy tych badań sugerują, że kompleksy Hb/Hp/HDL i hem/Hx/HDL indukują efekty prozapalne, takie jak: spadek stęże­nia i aktywności czynników przeciwzapalnych oraz anty­oksydantów, zwiększenie zawartości nadtlenków lipidów w błonach plazmatycznych, zmniejszenie zdolności HDL do zapobiegania utlenianiu lipoprotein o niewielkiej gę­stości (LDL – low density lipoprotein) [76].

Na drugim biegunie modulacji stanu zapalnego znajdują się bezpośrednie produkty rozkładu hemu i Hb. Oksygenaza hemowa 1 (HO-1 – hem oxygenase-1) katalizuje reakcję rozpadu układu hemowego, w wyniku czego powstają: CO, biliwerdyna i wolne żelazo. Wolne żelazo jest inkor­porowane przez ferrytynę, co zapobiega reakcji Fentona [55]. Z kolei biliwerdyna wykazuje właściwości antyoksy­dacyjne, podobnie jak reduktaza biliwerdyny, redukująca biliwerdynę do bilirubiny [62]. CO jest z kolei związkiem o właściwościach wazorelaksacyjnych, przeciwzapalnych i antyoksydacyjnych m.in. poprzez indukcję ekspresji ze­wnątrzkomórkowej dysmutazy ponadtlenkowej (katali­zującej rozkład O₂^·- i ograniczającej przez to formowanie silnie toksycznego ONOO^– oraz zwiększanie biodostęp­ności NO) [1, 56]. Degradacja hemu przez HO-1 ograni­cza także ekspresję indukcyjnych, zależnych od hemu en­zymów prozapalnych, takich jak iNOS (inducible nitric oxide synthase) oraz oksydaza NADPH [1]. Przyłączenie kompleksu Hb/Hp do receptora CD163 skutkuje z ko­lei indukcją przeciwzapalnej interleukiny 10 oraz HO-1 w krążących monocytach [50]. Monocyty CD163⁺ wyka­zują wysoką ekspresję HO-1 w odpowiedzi na związanie kompleksu Hb-Hp, podczas gdy inne populacje leukocy­tów nie wykazują tej właściwości. Z drugiej strony trak­towanie monocytów lipopolisacharydem skutkuje zmniej­szeniem stopnia ekspresji CD163 na powierzchni błony plazmatycznej i obniżeniem wychwytu kompleksów Hb-Hp [57]. Upośledzenie wychwytu kompleksów Hb-Hp przez monocyty może więc przyczyniać się do zwiększo­nej toksyczności kompleksów Hb-Hp w ogólnoustrojowych stanach zapalnych. Układ CD163/HO-1/reduktaza biliwer­dyny wydaje się ewolucyjnym przystosowaniem kompen­sującym prozapalne i wazokonstrykcyjne efekty wiązania NO oraz prooksydacyjne funkcje wolnej Hb, hemu i że­laza hemowego [1].

Podsumowanie

Zachodząca w niekontrolowany sposób, patologiczna he­moliza i towarzyszące jej pojawienie się w osoczu wolnej Hb mogą stanowić poważne zagrożenie dla zdrowia i życia chorych. Liczne badania, prowadzone zarówno na ochotni­kach, jak i na modelach zwierzęcych, przedstawiają długą li­stę poważnych komplikacji zdrowotnych będących skutkiem nadmiernej hemolizy, wliczając w to: nadciśnienie ogólno­ustrojowe i płucne, zaburzenia erekcji, nadmierną aktywa­cję płytek krwi, dysfunkcję śródbłonka naczyń krwiono­śnych, nerek czy pojawianie się stanów zapalnych (ryc. 6). Szkodliwe działanie hemoglobinemii obecnie tłumaczy się bezpośrednim cytotoksycznym i prozapalnym działaniem wolnej Hb i wolnego hemu oraz wychwytywaniem tlen­ku azotu przez uwolnioną z erytrocytów Hb, co prowadzi do zaburzenia homeostazy wewnątrznaczyniowej. W cho­robach przebiegających z wewnątrznaczyniową hemolizą stężenia wolnej Hb w osoczu chorych są na tyle wysokie by efektywnie wiązać NO znosząc tym samym jego biodo­stępność. Obecnie powszechnie akceptowany jest pogląd, że nieodwracalne wiązanie NO stanowi najpoważniejszą kon­sekwencję nadmiernej hemolizy. Ograniczanie dostepności NO jest również najbardziej ograniczającym czynnikiem w opracowywaniu i stosowaniu preparatów krwiozastęp­czych bazujących na hemoglobinie. Zrozumienie moleku­larnych mechanizmów leżących u podstaw, opisywanych w niniejszym opracowaniu, stanów patologicznych pozwa­la mieć nadzieję na opracowanie skutecznych leków popra­wiających jakość życia chorych. Przykładem takich leków są inhibitory fosfodiesteraz, z powodzeniem stosowane w za­burzeniach erekcji, a także w nadciśnieniu płucnym i jako leki przeciwpłytkowe. Ścisłe powiązanie podstaw chorób z wewnątrznaczyniową hemolizą stwarza obszar, na którym wiedza naukowa i praktyka medyczna mogą być wspólnie re­alizowane w celu poprawy jakości i długości życia chorych.

Ryc. 6. W przebiegu wielu wrodzonych i nabytych chorób występuje nadmierna hemoliza. Uwalniana z erytrocytów wolna Hb może działać niekorzystnie poprzez uwalnianie hemu, wiązanie NO, bądź też bezpośrednio

PIŚMIENNICTWO

[1] Allen A., Fisher C., Premawardhena A., Peto T., Allen S., Arambepola M., Thayalsutha V.,Olivieri N., Weatherall D.: Adaptation to anemia in hemoglobin E-β thalassemia. Blood, 2010; 116: 5368-5370
[PubMed]  

[2] Antl M., von Brühl M.L., Eiglsperger C., Werner M., Konrad I., Kocher T., Wilm M., Hofmann F., Massberg S., Schlossmann J.: IRAG mediates NO/cGMP-dependent inhibition of platelet aggregation and thrombus formation. Blood, 2007; 109: 552-559
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Bender A.T., Beavo J.A.: Cyclic nucleotide phosphodiesterases: molecular regulation to clinical use. Pharmacol. Rev., 2006; 58: 488-520
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[4] Brown G.C., Borutaite V.: Nitric oxide and mitochondrial respiration in the heart. Cardiovasc. Res., 2007; 75: 283-290
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[5] Buehler P.W., Abraham B., Vallelian F., Linnemayr C., Pereira C.P., Cipollo J.F., Jia Y., Mikolajczyk M., Boretti F.S., Schoedon G., Alayash A.I., Schaer D.J.: Haptoglobin preserves the CD163 hemoglobin scavenger pathway by shielding hemoglobin from peroxidative modification. Blood, 2009; 113: 2578-2586
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[6] Bunn H.F., Nathan D.G., Dover G.J., Hebbel R.P., Platt O.S., Rosse W.F., Ware R.E.: Pulmonary hypertension and nitric oxide depletion in sickle cell disease. Blood, 2010; 116: 687-692
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[7] De Palma C., Meacci E., Perrotta C., Bruni P., Clementi E.: Endothelial nitric oxide synthase activation by tumor necrosis factor α through neutral sphingomyelinase 2, sphingosine kinase 1, and sphingosine 1 phosphate receptors: a novel pathway relevant to the pathophysiology of endothelium. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2006; 26: 99-105
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[8] Gkaliagkousi E., Ritter J., Ferro A.: Platelet-derived nitric oxide signaling and regulation. Circ. Res., 2007; 101: 654-662
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[9] Gladwin M.T.: Role of the red blood cell in nitric oxide homeostasis and hypoxic vasodilation. Adv. Exp. Med. Biol., 2006; 588: 189-205
[PubMed]  

[10] Gladwin M.T., Kato G.J.: Hemolysis-associated hypercoagulability in sickle cell disease: the plot (and blood) thickens! Haematologica, 2008; 93: 1-3
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[11] Gordeuk V.R., Sachdev V., Taylor J.G., Gladwin M.T., Kato G., Castro O.L.: Relative systemic hypertension in patients with sickle cell disease is associated with risk of pulmonary hypertension and renal insufficiency. Am. J. Hematol., 2008; 83: 15-18
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[12] Gudmundsdóttir I.J., McRobbie S.J., Robinson S.D., Newby D.E., Megson I.L.: Sildenafil potentiates nitric oxide mediated inhibition of human platelet aggregation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005; 337: 382-385
[PubMed]  

[13] Han T.H., Pelling A., Jeon T.J., Gimzewski J.K., Liao J.C.: Erythrocyte nitric oxide transport reduced by a submembrane cytoskeletal barrier. Biochim. Biophys. Acta, 2005; 1723: 135-142
[PubMed]  

[14] Henkel-Honke T., Oleck M.: Artificial oxygen carriers: a current review. AANA J., 2007; 75: 205-211
[PubMed]  

[15] Hill A., Hillmen P., Richards S.J., Elebute D., Marsh J.C., Chan J., Mojcik C.F., Rother R.P.: Sustained response and long-term safety of eculizumab in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood, 2005; 106: 2559-2565
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[16] Hill A., Richards S.J., Hillmen P.: Recent developments in the understanding and management of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br. J. Haematol., 2007; 137: 181-192
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[17] Hofmann F., Ammendola A., Schlossmann J.: Rising behind NO: cGMP-dependent protein kinases. J. Cell Sci., 2000; 113: 1671-1676
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[18] Hsiao P.J., Wang S.C., Wen M.C., Diang L.K., Lin S.H.: Fanconi syndrome and CKD in a patient with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and hemosiderosis. Am. J. Kidney Dis., 2010; 55; e1-e5
[PubMed]  

[19] Hsu L.L., Champion H.C., Campbell-Lee S.A., Bivalacqua T.J., Manci E.A., Diwan B.A., Schimel D.M., Cochard A.E., Wang X., Schechter A.N., Noguchi C.T., Gladwin M.T.: Hemolysis in sickle cell mice causes pulmonary hypertension due to global impairment in nitric oxide bioavailability. Blood, 2007; 109: 3088-3098
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[20] Jardine D.L., Laing A.D.: Delayed pulmonary hypertension following splenectomy for congenital spherocytosis. Intern. Med. J., 2004; 34: 214-216

[21] Kato G.J., Hebbel R.P., Steinberg M.H., Gladwin M.T.: Vasculopathy in sickle cell disease: Biology, pathophysiology, genetics, translational medicine, and new research directions. Am. J. Hematol., 2009; 84: 618-625
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[22] Kaul D.K., Liu X.D., Chang H.Y., Nagel R.L., Fabry M.E.: Effect of fetal hemoglobin on microvascular regulation in sickle transgenic-knockout mice. J. Clin. Invest., 2004; 114: 1136-1145
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[23] Kim-Shapiro D.B., Schechter A.N., Gladwin M.T.: Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2006; 26: 697-705
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[24] Krajewski M.L., Hsu L.L., Gladwin M.T.: The proverbial chicken or the egg? Dissection of the role of cell-free hemoglobin versus reactive oxygen species in sickle cell pathophysiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2008; 295: H4-H7
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[25] Lee A.J., Chiao T.B., Tsang M.P.: Sildenafil for pulmonary hypertension. Ann. Pharmacother., 2005; 39: 869-884
[PubMed]  

[26] Li Y.S., Haga J.H., Chien S.: Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech., 2005; 38: 1949-1971
[PubMed]  

[27] Limin M., Johnsen N., Hellstrom W.J.: Avanafil, a new rapid-onset phosphodiesterase 5 inhibitor for the treatment of erectile dysfunction. Expert Opin. Investig. Drugs, 2010; 19: 1427-1437
[PubMed]  

[28] Lindorfer M.A., Pawluczkowycz A.W., Peek E.M., Hickman K., Taylor R.P., Parker C.J.: A novel approach to preventing the hemolysis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: both complement-mediated cytolysis and C3 deposition are blocked by a monoclonal antibody specific for the alternative pathway of complement. Blood, 2010; 115: 2283-2291
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[29] Liu X., Samouilov A., Lancaster J.R. Jr., Zweier J.L.: Nitric oxide uptake by erythrocytes is primarily limited by extracellular diffusion not membrane resistance. J. Biol. Chem., 2002; 277: 26194-26199
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[30] Machado R.F., Gladwin M.T.: Chronic sickle cell lung disease: new insights into the diagnosis, pathogenesis and treatment of pulmonary hypertension. Br. J. Haematol., 2005; 129: 449-464
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[31] Magnussen K., Bork N., Asmussen L.: The effect of a standardized protocol for iron supplementation to blood donors low in hemoglobin concentration. Transfusion, 2008; 48: 749-754
[PubMed]  

[32] Maier-Redelsperger M., Lévy P., Lionnet F., Stankovic K., Haymann J.P., Lefevre G., Avellino V., Perol J.P., Girot R., Elion J.: Strong association between a new marker of hemolysis and glomerulopathy in sickle cell anemia. Blood Cells Mol. Dis., 2010; 45: 289-292
[PubMed]  

[33] Massberg S., Sausbier M., Klatt P., Bauer M., Pfeifer A., Siess W., Fässler R., Ruth P., Krombach F., Hofmann F.: Increased adhesion and aggregation of platelets lacking cyclic guanosine3′,5′-monophosphate kinase I. J. Exp. Med., 1999; 189: 1255-1264
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[34] Meyer C., Heiss C., Drexhage C., Kehmeier E.S., Balzer J., Mühlfeld A., Merx M.W., Lauer T., Kühl H., Floege J., Kelm M., Rassaf T.: Hemodialysis-induced release of hemoglobin limits nitric oxide bioavailability and impairs vascular function. J. Am. Coll. Cardiol., 2010; 55: 454-459
[PubMed]  

[35] Morris C.R., Gladwin M.T., Kato G.J.: Nitric oxide and arginine dysregulation: a novel pathway to pulmonary hypertension in hemolytic disorders. Curr. Mol. Med., 2008; 8: 620-632
[PubMed]  

[36] Morris C.R., Kato G.J., Poljakovic M., Wang X., Blackwelder W.C., Sachdev V., Hazen S.L., Vichinsky E.P., Morris S.M. Jr., Gladwin M.T.: Dysregulated arginine metabolism, hemolysis-associated pulmonary hypertension, and mortality in sickle cell disease. JAMA, 2005; 294: 81-90
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[37] Morris C.R., Vichinsky E.P., Singer S.T.: Pulmonary hypertension in thalassemia: association with hemolysis, arginine metabolism dysregulation, and a hypercoagulable state. Adv. Pulm. Hypertens., 2007; 6: 31-38
[Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[38] Na N., Ouyang J., Taes Y.E., Delanghe J.R.: Serum free hemoglobin concentrations in healthy individuals are related to haptoglobin type. Clin. Chem., 2005; 51: 1754-1755
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[39] Nair R.K., Khaira A., Sharma A., Mahajan S., Dinda A.K.: Spectrum of renal involvement in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: report of three cases and a brief review of the literature. Int. Urol. Nephrol., 2008; 40: 471-475
[PubMed]  

[40] Pepke-Zaba J., Gilbert C., Collings L., Brown M.C.: Sildenafil improves health-related quality of life in patients with pulmonary arterial hypertension. Chest, 2008; 133: 183-189
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[41] Perrier E., Fournet-Bourguignon M.P., Royere E., Molez S., Reure H., Lesage L., Gosgnach W., Frapart Y., Boucher J.L., Villeneuve N., Vilaine J.P.: Effect of uncoupling endothelial nitric oxide synthase on calcium homeostasis in aged porcine endothelial cells. Cardiovasc. Res., 2009; 82: 133-142
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[42] Philippidis P., Mason J.C., Evans B.J., Nadra I., Taylor K.M., Haskard D.O., Landis R.C.: Hemoglobin scavenger receptor CD163 mediates interleukin-10 release and heme oxygenase-1 synthesis: antiinflammatory monocyte-macrophage responses in vitro, in resolving skin blisters in vivo, and after cardiopulmonary bypass surgery. Circ. Res., 2004; 94: 119-126
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[43] Piccard H., Van den Steen P.E., Opdenakker G.: Hemopexin domains as multifunctional liganding modules in matrix metalloproteinases and other proteins. J. Leukoc. Biol., 2007; 81: 870-892
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[44] Qian Q., Nath K.A., Wu Y., Daoud T.M., Sethi S.: Hemolysis and acute kidney failure. Am. J. Kidney Dis., 2010; 56: 780-784
[PubMed]  

[45] Reiter C.D., Wang X., Tanus-Santos J.E., Hogg N., Cannon R.O.3^rd, Schechter A.N., Gladwin M.T.: Cell-free hemoglobin limits nitric oxide bioavailability in sickle-cell disease. Nat. Med., 2002; 8: 1383-1389
[PubMed]  

[46] Reiter R., Jilma B.: Platelets and antiplatelet drugs. Therapy, 2005; 2: 465-502

[47] Rother R.P., Bell L., Hillmen P., Gladwin M.T.: The clinical sequelae of intravascular hemolysis and extracellular plasma hemoglobin: a novel mechanism of human disease. JAMA, 2005; 293: 1653-1662
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[48] Schäfer A., Wiesmann F., Neubauer S., Eigenthaler M., Bauersachs J., Channon K.M.: Rapid regulation of platelet activation in vivo by nitric oxide. Circulation, 2004; 109: 1819-1822
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[49] Schlossmann J., Ammendola A., Ashman K., Zong X., Huber A., Neubauer G., Wang G.X., Allescher H.D., Korth M., Wilm M., Hofmann F., Ruth P.: Regulation of intracellular calcium by a signalling complex of IRAG, IP3 receptor and cGMP kinase Iβ. Nature, 2000; 404: 197-201
[PubMed]  

[50] Schneider A., Asmus G., Biggar P., Braun J., Dellanna F., Fiedler R., Galle J., Girndt M., Gondolf K., Hahn K., Koch M., Müller H.J., Rump L.C., Vosskühler A., Winkler R., Wanner C.: Hemoglobin cycling in hemodialysis patients. Nephrol. Rev., 2010; 2: e1
[Abstract]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[51] Schwarz E.R., Rastogi S., Kapur V., Sulemanjee N., Rodriguez J.J.: Erectile dysfunction in heart failure patients. J. Am. Coll. Cardiol., 2006; 48: 1111-1119
[PubMed]  

[52] Sedlak T.W., Snyder S.H.: Bilirubin benefits: cellular protection by a biliverdin reductase antioxidant cycle. Pediatrics, 2004; 113: 1776-1782
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[53] Surks H.K.: cGMP-dependent protein kinase I and smooth muscle relaxation: a tale of two isoforms. Circ. Res., 2007; 101: 1078-1080
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[54] Tam D.H., Farber H.W.: Pulmonary hypertension and β-thalassemia major: report of a case, its treatment, and a review of the literature. Am. J. Hematol., 2006; 81: 443-447
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[55] Tanaka Y., Hayashi T., Kitajima H., Sumi K., Fujimura M.: Inhaled nitric oxide therapy decreases the risk of cerebral palsy in preterm infants with persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatrics, 2007; 119: 1159-1164
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[56] Tomasiak M., Stelmach H., Rusak T., Wysocka J.: Nitric oxide and platelet energy metabolism. Acta Biochim. Pol., 2004; 51; 789-803
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[57] Trepakova E.S., Cohen R.A., Bolotina V.M.: Nitric oxide inhibits capacitative cation influx in human platelets by promoting sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase-dependent refilling of Ca²⁺ stores. Circ. Res., 1999; 84: 201-209
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[58] Tsai A.G., Acero C., Nance P.R., Cabrales P., Frangos J.A., Buerk D.G., Intaglietta M.: Elevated plasma viscosity in extreme hemodilution increases perivascular nitric oxide concentration and microvascular perfusion. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2005; 288: H1730-H1739
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[59] van Wijk R., van Solinge W.W.: The energy-less red blood cell is lost: erythrocyte enzyme abnormalities of glycolysis. Blood, 2005; 106: 4034-4042
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[60] Verduzco L.A., Nathan D.G.: Sickle cell disease and stroke. Blood, 2009; 114: 5117-5125
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[61] Villagra J., Shiva S., Hunter L.A., Machado R.F., Gladwin M.T., Kato G.J.: Platelet activation in patients with sickle disease, hemolysis-associated pulmonary hypertension, and nitric oxide scavenging by cell-free hemoglobin. Blood, 2007; 110: 2166-2172
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[62] Wagener F.A., Eggert A., Boerman O.C., Oyen W.J., Verhofstad A., Abraham N.G., Adema G., van Kooyk Y., de Witte T., Figdor C.G.: Heme is a potent inducer of inflammation in mice and is counteracted by heme oxygenase. Blood, 2001; 98: 1802-1811
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[63] Walter U., Gambaryan S.: cGMP and cGMP-dependent protein kinase in platelets and blood cells. Handb. Exp. Pharmacol., 2009; 191: 533-548
[PubMed]  

[64] Watanabe J., Grijalva V., Hama S., Barbour K., Berger F.G., Navab M., Fogelman A.M., Reddy S.T.: Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J. Biol. Chem., 2009; 284: 18292-18301
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[65] Yamanouchi J., Hato T., Niiya T., Nakagawa K., Kumon Y., Fujiwara H., Yakushijin Y., Yasukawa M.: Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) phosphorylation assay for platelet response to cilostazol. Platelets, 2011; 22: 135-142
[PubMed]  

[66] Yin D.L., Liu L.X., Zhang S.G., Tian L.T., Lu Z.Y., Jiang H.C.: Portal hypertension resulted from paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: a case report and review of literature. Int. J. Hematol., 2009; 89: 302-304
[PubMed]  

[67] Zaccolo M., Magalhaes P., Pozzan T.: Compartmentalisation of cAMP and Ca²⁺ signals. Curr. Opin. Cell Biol., 2002; 14: 160-166
[PubMed]  

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu