Streszczenie

Receptory Toll-podobne należą do grupy receptorów rozpoznających wzorce (pattern recognition receptors – PRR), odgrywających główną rolę w zachowywaniu równowagi między układem odpornościowym gospodarza, a inwazją drobnoustrojów. Są kluczowymi czynnikami wczesnych, wrodzonych mechanizmów obronnych układu odpornościowego, co przejawia się aktywacją klasycznych i alternatywnych szlaków zapalenia. Wykazano bowiem, że ich nadmierna aktywność zakłóca homeostazę organizmu. Z tego powodu odpowiedzi komórki z udziałem tych receptorów powinny być ściśle regulowane, aby zapobiec wszelkim szkodliwym skutkom ich nieprawidłowej aktywacji. Coraz więcej wiadomo o potencjalnym udziale receptorów Toll-podobnych w inicjacji i progresji miażdżycy. Wykazano, że aktywacja tych receptorów prowadzi do wzmożonej syntezy cytokin prozapalnych, sprzyja akumulacji komórek piankowatych w aorcie oraz migracji komórek naczyniowych mięśni gładkich z tunica do intima media. Głównym problemem w rozwoju leków blokujących receptory Toll-podobne jest zmniejszenie nadmiernego stanu zapalnego bez wpływu na wrodzoną odporność organizmu. Wprawdzie badania przedkliniczne potwierdzają, że są one obiecującymi celami terapeutycznymi i potencjalnymi biomarkerami w patogenezie miażdżycy, jednak istnieje konieczność pełnego zdefiniowania ich funkcji.

Wprowadzenie

W walce z patogenami organizm uruchamia zarówno mechanizmy odpowiedzi nieswoistej, czyli wrodzonej (innate), jak i swoistej, czyli nabytej (adaptive) [21,71]. Głównymi komórkami odpowiedzi nieswoistej są makrofagi, natomiast w mechanizmy odpowiedzi swoistej są zaangażowane limfocyty T i B. Ważnym ogniwem łączącym odporność nieswoistą z odpornością swoistą są receptory Toll-podobne (Toll-like receptors), które uczestniczą w przekazywaniu sygnałów do wnętrza komórki, uruchamiając procesy mające na celu usunięcie patogenu z organizmu [69,78]. Receptory TLR umożliwiają komórkom układu immunologicznego odróżnianie antygenów własnych od obcych. Pierwszym zidentyfikowanym receptorem TLR był receptor rozpoznający lipopolisacharyd (LPS), główny składnik ściany bakterii Gram-ujemnych, zwany również endotoksyną [13,27].
W oparciu o badania na myszach transgenicznych pozbawionych TLR4 (TLR4–/–) wykazano, że receptorem rozpoznającym LPS wyizolowanym z bakterii Gram-ujemnych jest receptor TLR4 [28]. Ważną rolę w procesie aktywacji receptora TLR4 przez LPS odgrywa także białko wiążące lipopolisacharyd – LBP (lipopolysaccharide binding protein). LBP przekazuje cząsteczkę LPS kompleksowi TLR4/CD14. Niedawne doniesienia wskazują, że białko LBP uczestniczy w wewnątrzkomórkowej aktywacji receptora TLR4, która prowadzi do indukcji IFN-β. Wykazano, że białko LBP jest niezbędne w fosforylacji N-terminalnych kinaz c-Jun, kinazy tyrozynowej 2, czynnika IRF3, p38 oraz STAT1 [34]. Zhao i wsp. wskazali, że LPS indukuje również ekspresję receptora lecytynopodobnego dla utlenionej lipoproteiny o niskiej gęstości (LOX-1) poprzez szlak aktywowany przez TLR4/MyD88/ROS p38MAPK/NF-κB w komórkach śródbłonka [87].

Budowa i występowanie TLR

Receptory TLR są glikoproteinami typu I, zawierającymi pojedynczą transbłonową helisę, która łączy domenę odpowiadającą za wiązanie liganda umiejscowioną na końcu aminowym białka, z domeną sygnałową z końca karboksylowego receptora. Dotychczas zidentyfikowano i opisano trzynaście receptorów TLR występujących u ssaków, dziesięć z nich występuje u ludzi [33]. Receptory występujące u ssaków są zbudowane z 3 części: domeny wewnątrzkomórkowej wykazującej duże podobieństwo do receptora IL-1 i nazwanej Toll/IL-1 receptor (TIR), części transbłonowej oraz części zewnątrzkomórkowej mającej domenę zawierającą powtórzenia bogate w leucynę (LRR – leucine rich repeats). Domena zewnątrzkomórkowa jest odpowiedzialna za wiązanie oraz identyfikację ligandów, a wewnątrzkomórkowa wiąże liczne białka adaptorowe [45] (ryc. 1).

Ryc. 1. Budowa receptorów Toll-podobnych; A – model monomeru receptora TLR w błonie komórkowej na przykładzie TLR3 (wg [87], zmodyfikowany), B- schemat budowy domeny zewnątrzkomórkowej receptora TLR, zawierającej powtórzenia bogate w leucynę LRR (wg [33], zmodyfikowany)

Większość receptorów TLR wykorzystuje białko MyD88 (myeloid differentation factor 88), które łączy się z domeną TIR tych receptorów. Białkami uczestniczącymi w MyD88 zależnej drodze sygnałowej są IRAK−1 (IL−1−R− associated kinase), IRAK-4, TRAF-6 (TNFR−associated factor), kompleks TAK1/TAB oraz MAP kinazy. TLR2 i TLR4 używają dodatkowo strukturalnie podobnego do MyD88 białka TIRAP/Mal (TIR – domain−containing adaptor protein) [26]. Przez te białka dochodzi do aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB (nuclear factor-κB) i wydzielania cytokin prozapalnych. TLR4 wykorzystuje jednocześnie MyD88-zależną i -niezależną kaskadę sygnałową [17]. Natomiast TLR3 wykorzystuje m.in. białko adaptorowe TRIF/TICAM−1 w celu aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF-3, co powoduje wydzielanie INF-β [57,80]. Ligandy wiązane przez receptory Toll-podobne i wytwarzane cytokiny przedstawiono w tab.1.

TLR	Lokalizacja	Ligandy PAMP	Ligandy DAMP	Analogi syntetyczne	Białka adaptorowe	Białka efektorowe
TLR2-1	Błona komórkowa	– lipoproteiny Mycobacterium- triacylowane lipopeptydy (Pam3CSK4)	nieznane	– triacylowe lipopeptydy	MAL/MyD88	cytokiny prozapalne
TLR2-6	Błona komórkowa	– lipoproteiny Mycoplasma- kwas lipotejchojowy – peptydoglikan- zymosan	– białka szoku cieplnego – HMGB1- wersikan- kwas hialuronowy	– diacylowe lipopeptydy	MAL/MyD88	cytokiny prozapalne
TLR 3	Błona pęcherzyków endosomalnych	– Poly(I:C) (dwuniciowe RNA wirusów)	– mRNA	– Poly(I:C)- Poly(I:C12U)	TRIF	cytokiny prozapalne, IFN typu I
TLR 4	Błona komórkowa//błona pęcherzyków endosomalnych	– lipopolisacharyd (LPS)- wirus RSV (respiratory syncytial virus)	– białka szoku cieplnego – HMGB1- β-defensyna 2- fragment domeny A fibronektyny- kwas hialuronowy- siarczan heparanu- fibrynogen- utlenione fosfolipidy	– mimetyki lipidu A (monofosforylowy lipid A, 4- fosforan aminoalkiloglukozaminy)- E6020- E5531- E5564	MAL/MyD88TRAM/TRIF	cytokiny prozapalne, IFN typu I
TLR 5	Błona komórkowa	– flagellina	nieznane	– Nieciągły peptyd 13-aminokwasowy CBLB502	MyD88	cytokiny prozapalne
TLR 7	Błona pęcherzyków endosomalnych	– pojedyncza nić RNA wirusów (ssRNA)- imidazochinoliny, - analogi guanozyny(loxoribine)	– ssRNA (kompleks immunologiczny)	– oligonukleotydy- imidazochinolina- nukleotydy guanozyny- bropirimine	MyD88	cytokiny prozapalne, IFN typu I
TLR 8	Błona pęcherzyków endosomalnych	– pojedyncza nić RNA wirusów (ssRNA)	– ssRNA (kompleks immunologiczny)	– imidazochinoliny (Resiquimod)	MyD88	cytokiny prozapalne, IFN typu I
TLR 9	Błona pęcherzyków endosomalnych	– bakteryjne i wirusowe niemetylowane sekwencje CpG DNA- hemozoina Plasmodium	– kompleksy IgG-chromatyna	– oligodeoksynukleotydy CpG	MyD88	cytokiny prozapalne, IFN typu I
TLR 10	Błona komórkowa	– cząsteczka profilinopodobna	nieznane	nieznane	MyD88	cytokiny prozapalne
TLR 11	Błona pęcherzyków endosomalnych	– cząsteczka profilinopodobna – bakterie uropatogenne	nieznane	nieznane	MyD88	cytokiny prozapalne
TLR 12	Błona pęcherzyków endosomalnych	– cząsteczka profilinopodobna	nieznane	nieznane	MyD88	cytokiny prozapalne
TLR 13	Błona pęcherzyków endosomalnych	– bakteryjne rRNA 23S	nieznane	nieznane	MyD88	cytokiny prozapalne

Tabela 1. Ligandy wiązane przez receptory Toll-podobne i białka efektorowe [1]

TLR występują właściwie we wszystkich komórkach organizmu, a ich ekspresja jest zmienna. Monocyty/makrofagi wykazują ekspresję wszystkich TLR poza TLR3 [38]. Na komórkach dendrytycznych występują różne rodzaje TLR [31]. Komórki tuczne preferencyjnie wytwarzają TLR2, 4, 6 oraz 8 [52]. Ekspresję TLR wykazują komórki nabłonka oddechowego [77], jelitowego [72], dróg moczowych [79], rogówki [65], dziąsła [7], fibroblasty [61] oraz komórki śródbłonka naczyniowego [16]. Receptory TLR1, 2, 4, 5 oraz 6 występują na powierzchni błony komórkowej, pozostałe znajdują się w przestrzeni wewnątrzkomórkowej (endosomy) [22].

Mechanizm aktywacji TLR

Receptory Toll-podobne rozpoznają tzw. wzorce molekularne związane z patogenami – PAMP (patogen associated molecular patterns), do których należą lipopolisacharydy – LPS, peptoglikany, kwas lipotejchojowy, lipoproteiny [50], a także molekuły uwolnione z uszkodzonych komórek – DAMP (damage associated molecular patterns), takie jak wolne kwasy tłuszczowe, oxLDL (oxidized low-density lipoprotein), fibronektyna, HSP (heats hock protein), CpG DNA (DNA zawierający niemetylowane sekwencje CpG) [86]. Połączenie PAMP lub DAMP z odpowiednim TLR wyzwala kaskadę sygnałową wewnątrz komórki, powodując wytwarzanie cytokin oraz aktywację wczesnej odpowiedzi immunologicznej. Jest ona bodźcem do wykształcenia swoistej odpowiedzi nabytej [2]. PAMP odgrywają istotną rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej przez udział w indukcji zarówno limfocytów T-regulatorowych, jak również komórek kontrsupresyjnych [51].

Główna droga aktywacji receptorów TLR jest zależna od białka adaptorowego MyD88. Podczas pobudzenia receptora TLR, komponenta MyD88 łączy się domeną TIR bezpośrednio z receptorem TLR (TLR5, TLR7, TLR9) lub za pośrednictwem białka adaptorowego TIRAP (TLR2, TLR4). Dochodzi wówczas do aktywacji kinazy IRAK4, co powoduje fosforylację kolejnej kinazy IRAK-1 [73]. Powstająca aktywna kinaza IRAK1 zostaje uwolniona do cytoplazmy, gdzie łączy się z czynnikiem TRAF6, powodując aktywację kompleksu TAK1/TAB. Pobudzony kompleks TAK1/TAB aktywuje kinazę czynnika IĸB (IKK) oraz kinazę MAP (mitogen-activated protein) [23]. Aktywna kinaza IKK powoduje fosforylację i degradację czynnika IĸB (inhibitor czynnika NF-ĸB) prowadząc do uwolnienia czynnika transkrypcyjnego NF-ĸB, który wnika do jądra komórkowego i indukuje ekspresję genów kodujących cytokiny prozapalne (ryc. 2).

Ryc. 2. Schemat mechanizmu aktywacji TLR; IFN – interferon, IKK – inhibitor kinazy ĸB, IĸB – inhibitor ĸB, IRAK – kinaza powiązana z interleukiną, IRF – interferonowy regulator czynnika, MMP – metaloproteinazy, MyD88 – czynnik różnicujący białaczki, TLR – receptor Toll-podobny, TNF-α – czynnik martwicy nowotworu, TRAM – cząsteczka adaptacyjna TRIF-powiązana, TRIF – domena zawierająca adapter indukujący IFN-β

Do białek adaptorowych, zaangażowanych w transdukcję sygnału aktywacji receptorów TLR, należą: TIRAP (TIR-domain-containing adapter protein), TRIF (TIR-domain-containing adapter inducing IFN-β) oraz TRAM (TRIF-related adapter molecule) [83]. Wykazano, że białko TIRAP odgrywa istotną rolę w MyD88-zależnej transdukcji sygnału pochodzącego z receptorów TLR4 oraz TLR2 [81]. Białko TRIF uczestniczy w MyD88-niezależnej drodze aktywacji receptorów TLR3 i TLR4, które w odpowiedzi na dsRNA i LPS powodują aktywację czynnika IRF-3 (interferon regulatory factor 3) i syntezy IFN-β. Na aktywację czynnika NF-ĸB w wyniku stymulacji receptorów TLR3 mają również wpływ kinazy RIP (receptor interacting protein): RIP1 i RIP3 [54]. Stwierdzono, że brak kinazy RIP1 obniża aktywację czynnika NF-ĸB, natomiast nie ma wpływu na aktywację kinazy JNK i syntezę IFN-β. Wykazano również, że kinaza RIP3 hamuje drogę aktywacji czynnika NF-ĸB poprzez białko TRIF. Receptor TLR3 jest zaliczany do receptorów zależnych od kinazy RIP. Białko adaptorowe TRAM bierze udział w MyD88-niezależnej aktywacji receptora TLR4 a jego brak zmniejsza syntezę cytokin prozapalnych oraz osłabia proliferację splenocytów w odpowiedzi na LPS [82].

Monocyty/makrofagi w patogenezie miażdżycy 
– rola TLR

Cechą charakterystyczną zarówno wczesnych jak i późnych etapów rozwoju miażdżycy jest obecność monocytów/makrofagów oraz limfocytów w błonie wewnętrznej ściany naczynia [64]. Osiadłe w ścianie naczynia monocyty przekształcają się w aktywne makrofagi, co jest związane między innymi z pojawieniem się na ich powierzchni ekspresji receptorów zmiatających (scavenger receptors). Na drodze endocytozy zależnej od tych receptorów makrofagi pochłaniają obce antygeny, zmodyfikowane lipoproteiny (oksydowane oraz acetylowane LDL) i ciałka apoptotyczne. Ekspresja receptorów zmiatających nie jest zwrotnie regulowana (jak np. ekspresja receptorów dla LDL), co prowadzi do niekontrolowanej akumulacji lipidów i powstania charakterystycznych dla miażdżycy komórek piankowatych [44]. Aktywacja znajdujących się na powierzchni makrofagów receptorów TLR, prowadzi do wzmożonej syntezy cytokin prozapalnych: IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 oraz TNF-α. Stymulacja receptorów TLR4 zwiększa zdolności fagocytarne makrofagów oraz powoduje wzrost wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) oraz syntezę tlenku azotu (NO) [47]. Ponadto makrofagi aktywowane przez receptory TLR zwiększają ekspresję antygenów zgodności tkankowej MHC I i MHC II oraz molekuł CD80, CD86, co z kolei sprawia, że komórki te efektywniej prezentują antygeny limfocytom T i indukują swoistą odpowiedź immunologiczną [9,84] (ryc. 3).

Ryc. 3. Schemat aktywacji odporności wrodzonej z udziałem receptorów zmiatających oraz receptorów Toll-podobnych; TNF-α – czynnik martwicy nowotworu-α, COX-2 – cyklooksygenaza-2, PLA2 – fosfolipaza A2, iNOS – indukowana syntaza tlenku azotu

Równowaga w MyD88-zależnej oraz TRIF-zależnej sygnalizacji TLR ma zasadnicze znaczenie dla prawidłowej funkcji odporności [29]. Wang i wsp. wykazali, że Nrdp1 (ligaza ubikwitynowa E3) hamuje wytwarzanie cytokin prozapalnych, natomiast zwiększa wytwarzanie IFN-β w makrofagach, w których doszło do aktywacji TLR. Jest to możliwe dzięki hamowaniu MyD88-zależnej aktywacji NF-κB poprzez ubikwitynację MyD88 [74]. Alternatywny mechanizm zaproponowali Liu i wsp. Wykazali bowiem, że wewnątrzkomórkowe cząsteczki MHC klasy II w komórkach prezentujących antygen mogą aktywować zarówno kaskady MyD88, jak i TRIF, prowadząc do wytwarzania cytokin prozapalnych i interferonów [46].

Wykazano, że receptory Toll-podobne mogą bezpośrednio wpływać na powstawanie zmian miażdżycowych, gdyż stymulacja makrofagów ligandami TLR2, TLR4 i TLR9 promuje wychwytywanie lipidów przez te komórki, co prowadzi do powstawanie komórek piankowatych [70]. Badania eksperymentalne z wykorzystaniem myszy pozbawionych Apolipoproteiny E (ApoE -/-) wykazały, że TLR4 oraz TLR2 sprzyjają akumulacji komórek piankowatych w aorcie [24]. Zaobserwowano również zwiększoną ekspresję TLR2 w komórkach śródbłonka w miejscach podatnych na miażdżycę, takich jak wewnętrzna krzywizna łuku aorty [58]. Ponadto TLR2 promują migrację komórek naczyniowych mięśni gładkich (VSMC) z tunica media do intima w sposób zależny od IL-6 [40].

Wykazano, że TLR4 stymulują makropinocytozę lipidów w zróżnicowanych makrofagach [11]. Zwiększone wychwytywanie lipidów może być również regulowane poprzez ekspresję receptorów zmiatających indukowanych przez TLR3 i TLR9 [14]. TLR i ich ligandy mogą zakłócać także mechanizmy wypływu cholesterolu, co może się przyczyniać do powstawania komórek piankowatych. Myszy ApoE-/- z niedoborem receptorów TLR4 i TLR2 ujawniły zmniejszenie rozwoju zmian miażdżycowych o 55%, a u myszy ApoE-/- z niedoborem receptora TLR4 zaobserwowano zmniejszenie infiltracji makrofagów o 65% [55,59]. Zmniejszeniu rozmiaru tych zmian chorobowych w naczyniach u zwierząt z niedoborem TLR2 i TLR4 towarzyszyło obniżenie obwodowego poziomu CCL2, chemokiny kluczowej dla rekrutacji monocytów do blaszek miażdżycowych [8,15]. Całkowita utrata receptora TLR2 u myszy podatnych na miażdżycę LDLR-/- prowadzi do redukcji zmian miażdżycowych [59]. Okazało się, że niedobór MyD88, białka od którego zależy sygnalizacja TLR2, skutkuje zmniejszeniem nasilenia miażdżycy aorty u myszy ApoE -/- [56]. W badaniu tym zaobserwowano obniżenie poziomu krążących cytokin prozapalnych, białka chemotaktycznego dla monocytów, liczby makrofagów i innych czynników, które odgrywają istotną rolę w progresji miażdżycy. Ponadto wykazano, że blokada TLR2 może doprowadzić do zmniejszenia wytwarzania cytokin prozapalnych, chemokin i metaloproteinaz poprzez zahamowanie aktywacji NF-κB. Satoh i wsp. wykazali wyższy poziom ekspresji mRNA dla TLR4 u pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym niż ze stabilną dusznicą bolesną [66]. Również Gargiulo i wsp. powiązali TLR4 z niestabilnością blaszki miażdżycowej. Wykazali bowiem, że cząsteczki oxLDL, kumulujące się w blaszkach miażdżycowych nasilają uwalnianie cytokin prozapalnych i prowadzą do wydzielania MMP-9 w sposób zależny od TLR4/NF-κB [19,20] (ryc.4).

Ryc. 4. Udział TLR w patogenezie miażdżycy (wg [20, 63], zmodyfikowano); TGF-β – transformujący czynnik wzrostu β, MMPs – metaloproteinazy

Limfocyty w patogenezie miażdżycy – rola TLR

Obecne w płytce miażdżycowej limfocyty T, to limfocyty pomocnicze CD4+ i limfocyty cytotoksyczne CD8+, przy czym zazwyczaj dominują CD4+. Odpowiedź limfocytów T jest inicjowana w momencie zetknięcia się „naiwnych” limfocytów T z komórkami prezentującymi antygen, takimi jak komórki dendrytyczne i makrofagi. Na powierzchni limfocytów T znajdują się receptory TCR, które mają zdolność swoistego wiązania antygenu połączonego z MHC (Major Histocomptibility Complex – główny układ zgodności tkankowej). CD8+ rozpoznają peptydy prezentowane przez MHC klasy I a limfocyty CD4+ przez MHC klasy II. Wysoka ekspresja HLA-DR (MHC-II) na komórkach prezentujących antygen i interakcje z limfocytami T są szczególnie widoczne w obszarach blaszek miażdżycowych, podatnych na pęknięcia [85].

Do efektywnej aktywacji limfocytów T, oprócz połączenia TCR z antygenami prezentowanymi przez cząsteczki MHC, niezbędne są jednoczesne interakcje odpowiednich białek na limfocytach i komórkach prezentujących antygen. W patogenezie miażdżycy najbardziej poznaną parą jest CD40L (CD154) na limfocytach i CD40 na komórkach prezentujących antygen. Z badań in vitro wynika, że interakcje między CD40L na limfocytach a CD40 na innych komórkach powodują ich aktywację, co promuje ekspresję czynników zaangażowanych w proces miażdżycy [4].

Interakcje między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen mogą prowadzić do powstania różnych typów limfocytów. Wśród limfocytów CD4+, których jest najwięcej w płytce miażdżycowej, dominują limfocyty Th1, odpowiedzialne za odpowiedź komórkową i wydzielające IFN-γ (interferon-γ), IL-2 i TNF-α. Dużo rzadziej występują zaś limfocyty Th2 związane z odpowiedzią humoralną, wydzielające IL-4, IL-5 i IL-10. Obecność limfocytów Th1 będących źródłem TNF-α i IFN-γ stymuluje proces miażdżycowy i sprzyja powstawaniu niestabilnej blaszki miażdżycowej. IFN-γ

jest silnym aktywatorem makrofagów, ponadto stymuluje on ekspresję śródbłonkowych cząsteczek adhezyjnych i tym samym nasila rekrutację jednojądrzastych leukocytów. IFN-γ hamuje również proliferację komórek i infiltrację mięśni gładkich oraz syntezę kolagenu, nasila produkcję metaloproteinaz oraz jest czynnikiem indukującym apoptozę komórek mięśni gładkich i makrofagów. W ten sposób przyczynia się do osłabienia czapeczki łącznotkankowej i w konsekwencji do powstania płytki podatnej na pęknięcie lub do jej pęknięcia [53].

Badania wskazują, że istotną rolę w rozwoju miażdżycy mogą odgrywać tzw. limfocyty T regulatorowe (Treg). Zaobserwowano, że Treg hamują odpowiedź Th1 i Th2 w następstwie bezpośredniego kontaktu lub za pośrednictwem wydzielanych cytokin o silnych właściwościach immunosupresyjnych, takich jak IL-10 i transformujący czynnik wzrostu β (Transforming Growth Factor β; TGF-β). Jednocześnie wydzielane przez inne komórki IL-10 i TGF-β indukują różnicowanie limfocytów Treg. W efekcie przewaga odpowiedzi immunologicznej regulatorowej (Treg) nad efektorową (Th1 lub Th2) zmniejsza ryzyko rozwoju miażdżycy [53].

W badaniach in vitro i in vivo wykazano, że stymulacja TLR4 przez LPS prowadzi do proliferacji oraz zwiększonej aktywności komórek Treg CD4+ CD25+. Mechanizm aktywacji komórek Treg przez LPS nie jest jednak dokładnie poznany. Komórki Treg poza ekspresją receptorów TLR4, zawierają również receptory TLR5, TLR7 oraz TLR8. Można przypuszczać, że komórki te są bezpośrednio aktywowane przez LPS, jednak nie można wykluczyć, że mogą być w to również zaangażowane komórki prezentujące antygen (APC –Antigen Presenting Cell). Właśnie ten drugi mechanizm aktywujący komórki Treg okazał się dominującym w przypadku zakażeń wywołanych przez Bordetella pertussis, gdzie stymulacja TLR4 na komórkach APC powodowała wytwarzanie IL-10 [25]. Podobne obserwacje poczyniono w przypadku badań nad indukcją komórek Treg podczas zakażeń wywołanych Candida albicans. Netea i wsp. wykazali, że infekcja Candida albicans prowadzi do immunosupresji poprzez aktywację receptorów TLR2, prowadzącą do syntezy IL-10 oraz zwiększającą przeżywalność komórek Treg CD4+ CD25+ [60].

Receptory Toll-podobne jako cel terapii przeciwmiażdżycowej

Strategie terapeutyczne wykorzystywane do zmniejszania nadmiernej aktywacji TLR polegają na stosowaniu antagonistów, blokujących wiązanie ligandów lub kompleksów białko-ligand z receptorami lub antagonistami [32,42]. Antagoniści opracowani do tej pory obejmują małe cząsteczki, oligonukleotydy, peptydy, białka i przeciwciała [1]. W badaniach Arslan i wsp. wykazali, że przeciwciało monoklonalne anty-TLR2 (OPN-301) powoduje redukcję infiltracji neutrofili, makrofagów i T-limfocytów jak również zmniejszenie wytwarzania cytokin prozapalnych TNF-α, IL-1α i GM-CSF [5]. Użycie przeciwciała anty-TLR2 (OPN-305) powodowało redukcję rozmiaru zawału serca, zachowywanie funkcji skurczowej i ostatecznie zapobiegało uszkodzeniu mięśnia sercowego na modelu świni [6,75].

TLR4 znajduje się na powierzchni komórki i aktywuje kaskady prozapalne z udziałem NF-κB. Liczne badania potwierdzają rolę tego receptora w patogenezie miażdżycy. Wykazano zależność między polimorfizmem Asp299Gly ludzkiego receptora TLR4, a zmniejszonym ryzykiem rozwoju miażdżycy w tętnicy szyjnej [36]. U pacjentów, u których stwierdzono ten polimorfizm, zaobserwowano niższe stężenia krążących cytokin prozapalnych, a także fibrynogenu. Myszy ApoE-/- z niedoborem TLR4 lub MyD88 wykazują osłabiony rozwój miażdżycy poprzez obniżoną rekrutację makrofagów do ściany tętnicy, co jest związane ze zredukowanym poziomem chemokin [3,55]. Badania przeprowadzone przez Lu i wsp. wykazały, że podawanie antagonisty TLR4 przyczynia się do hamowania zapalenia i procesu miażdżycy u myszy ApoE-/- chorych na cukrzycę [48]. Ponadto zaobserwowano, że zastosowanie melatoniny u królików spowodowało obniżenie ekspresji TLR4, MyD88 i NF-κB, a w konsekwencji hamowało dysfunkcję śródbłonka, proces zapalny i progresję miażdżycy tętnic [30]. Również Guan i wsp. wskazali, że TLR4 może odgrywać kluczową rolę w migracji VSMC, co przyczynia się do rozwoju miażdżycy tętnic. Wykazali bowiem, że TLR4 promują migrację VSMC poprzez wywołaną CREB produkcję IL-6 sygnalizowaną za pomocą kinazy p38 MAPK i ERK1/2, które pośredniczą w szlakach zależnych od MyD88 i TRIF [41].Wang i wsp. wykazali, że inhibitor TLR4 (CLI-095) jest zdolny do skutecznego zmniejszania miażdżycy tętnic u myszy ApoE-/- przez hamowanie tworzenia komórek piankowatych. Wyniki te sugerują, że TLR4 może być uważany za potencjalny cel terapeutyczny w zapobieganiu progresji miażdżycy [76]. Ponadto, Ramani i wsp. wykazali, że peptyd określany jako SPA4 ingeruje w kontakt pomiędzy białkiem A surfaktantu a TLR4 i blokuje aktywację sygnalizacji TLR4. Badania wykazały zmniejszoną aktywność NF-κB i zmniejszone wydzielanie TNF-α po leczeniu SPA4. Co więcej, SPA4 hamował zapalenie wywołane LPS i łagodził endotoksyczne objawy podobne do wstrząsu na modelu myszy, co wskazuje na aktywność przeciwzapalną tego peptydu [62].

Badania przeprowadzone na modelach zwierzęcych miażdżycy wykazały, że poprzez inaktywację farmakologiczną szlaków TLR9 dochodzi do spowolnienia powstawania zmian miażdżycowych i wzmocnienia niestabilnych blaszek miażdżycowych. Zastosowanie IRS869 u myszy ApoE-/- skutkowało inaktywacją TLR9 i w konsekwencji zmniejszeniem rozmiaru oraz składu blaszki miażdżycowej w kierunku zmian bardziej stabilnych [49]. Potencjalnym kandydatem w leczeniu chorób o podłożu zapalnym może być IMO-3100, który jest antagonistą TLR7 i TLR9 [39]. Suarez-Farinas i wsp. w badaniach przedklinicznych wykazali, że IMO-3100 hamuje produkcję cytokin prozapalnych indukowaną przez receptory TLR7 i TLR9. Stymulacja TLR9 upośledzała reendotelelizację po ostrym urazie naczyniowym i promowała rozwój blaszki miażdżycowej w modelu zapalenia skóry u myszy [68]. Wyniki uzyskane przez Li i wsp. sugerują, że CpG-ODN c41 (CpG-Containing Oligodeoxynucleotide) wyizolowany z Pseudomonas aeruginosa może zapobiegać odpowiedzi zapalnej z udziałem receptorów TLR9. Działanie takie zaobserwowano w komórkach mysich i ludzkich monocytach [42].

Liczne badania wskazują na aterogenne działanie receptorów TLR2, TLR4, TLR7 i TLR9 [35,63], jednak niektórzy sugerują, że TLR9 chronią przed miażdżycą. Wykazali bowiem, że aktywacja TLR9 stymulowała produkcję interleukiny-10, która z kolei hamowała ekspresję INF-α wydzielanego przez komórki dendrytyczne i hamowała proliferację limfocytów T CD4 + CD25 + [10]. W celu wyjaśnienia roli TLR9 w miażdżycy Koulis i wsp. użyli modeli myszy pozbawionych genów TLR9 i ApoE. Wykazali 33% wzrost odkładania lipidów i wielkości blaszki miażdżycowej u myszy 
ApoE -/- i TLR9 -/- w porównaniu do myszy ApoE -/-. Co więcej, zaobserwowali znaczną akumulację makrofagów, komórek dendrytycznych i limfocytów T CD4+ w naczyniach u myszy ApoE -/ – i TLR9 -/-. Genetyczna delecja receptora TLR9 nasilała miażdżycę tętnic u myszy ApoE -/- karmionych dietą wysokotłuszczową. Limfocyty T CD4+ okazały się potencjalnymi mediatorami tego efektu. Agonista TLR9 (typ B CpG ODN) zmniejszał nasilenie zmian chorobowych, tym samym wskazując na nowe możliwości terapeutyczne w miażdżycy tętnic [37].

Ochronną rolę tych receptorów w patogenezie miażdżycy, zaobserwowano również w przypadku TLR3. Udowodniono bowiem, że myszy pozbawione TLR3 wykazywały przyspieszony rozwój zmian miażdżycowych. Natomiast zastosowanie agonisty TLR3 (Poly(I:C)) redukowało zmiany naczyniowe, co wskazuje na protekcyjną rolę tego receptora w patogenezie miażdżycy [12,18]. Z ostatnich badań wynika również, że TLR3 i TLR4 mogą być potencjalnymi nieinwazyjnymi biomarkerami choroby wieńcowej oraz restenozy w stencie [67,43].

Podsumowanie

Wzrastająca liczba dowodów wskazuje na udział receptorów Toll-podobnych w patogenezie miażdżycy. Z dotychczasowych badań wynika, że blokowanie TLR2 i TLR4 może ograniczać powstawanie zmian chorobowych oraz rozwój stanu zapalnego, podczas gdy blokada TLR2 redukuje dodatkowo rozmiar zawału. Wykazano, iż aktywacja receptorów powierzchniowych pobudza produkcję cytokin prozapalnych oraz stymuluje makrofagi do pochłaniania lipidów, podczas gdy aktywacja receptorów wewnątrzkomórkowych może hamować rozwój miażdżycy. Wydaje się, że modulacja odpowiedzi zapalnej z udziałem tych receptorów jest nowym celem terapeutycznym w leczeniu miażdżycy, co może mieć ogromne korzyści kliniczne w zapobieganiu chorobom sercowo-naczyniowym. Dużym wyzwaniem w rozwoju negatywnych lub pozytywnych regulatorów TLR są liczne szlaki sygnalizacyjne kinaz, czynników transkrypcyjnych i regulatorowych, dlatego opracowanie zasad TLR-celowanego leczenia miażdżycy oraz ocena efektywności takiej terapii wymaga dalszych, szczegółowych badań.

Konflikt interesów

Autorki deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu