Streszczenie

Rodzina Bcl-2 obejmuje białka odpowiedzialne za regulację apoptozy. Wpływ tych czynników na żywotność komórki jest istotny w zakażeniach wirusowych. Antyapoptotyczna aktywność Mcl-1, Bcl-2, Bcl-xL i Bcl-w może sprzyjać skutecznej replikacji IAV, utrzymując zakażoną komórkę przy życiu. Bcl-2 odgrywa jednak rolę przeciwwirusową na późnym etapie zakażenia IAV. Ograniczając transport nowo zsyntetyzowanego vRNP z jądra komórkowego do cytozolu, Bcl-2 zapobiega montażowi potomnych wirionów. Ponadto Bcl-2 odpowiada za modyfikację fosforylacji HA IAV i obniżenie zdolności adhezyjnych wirusa. Badania przedkliniczne sugerują zasadność projektowania metod leczniczych opartych na redukcji aktywności lub wewnątrzkomórkowego poziomu Mcl-1, Bcl-2, Bcl-xL i/lub Bcl-w. Antyapoptotyczni reprezentanci rodziny Bcl-2 są przedstawiani jako potencjalne obiekty docelowe terapii anty-IAV prowadzonych z wykorzystaniem substancji, takich jak IL-24, obatoklaks, ABT-199, ABT-263 i ABT-737. W zakażeniach układu nerwowego należałoby rozważyć metody leczenia zwiększające aktywność lub poziom Bcl-2 w neuronach.

Wstęp

Przebieg, charakter i częstotliwość zakażeń wirusowych są uzależnione od sieci złożonych interakcji obejmujących struktury czynnika zakaźnego i białka gospodarza. Znajomość tych oddziaływań, ugruntowana i pogłębiona wnikliwymi badaniami naukowymi, inspiruje projekty skutecznych terapii przeciwwirusowych. Rozległa wiedza na temat udziału białek komórkowych w zakażeniach rozmaitymi patogenami łączy zatem wartość poznawczą z potencjałem praktycznym – leczniczym. Rodzina białek Bcl-2 obejmuje czynniki determinujące wrażliwość komórki na apoptotyczną stymulację, przeciwdziałające indukcji apoptozy bądź sprzyjające temu procesowi i promującymi jego inicjację w sposób zależny od mitochondriów. Proporcja między wewnątrzkomórkowym poziomem pro – i antyapoptotycznych białek z rodziny Bcl-2 może zadecydować o uruchomieniu bądź o zahamowaniu indukcji wewnętrznego szlaku apoptozy [15, 19, 27, 44, 52, 63]. Funkcje regulatorowe przedstawicieli opisywanej grupy białek nabierają szczególnego znaczenia w zakażeniach wirusowych, gdy żywotność zakażonej komórki może np. warunkować dopełnienie cyklu replikacyjnego lub zaistnienie zjawisk istotnych z perspektywy patogenezy nowotworowej o etiologii wirusowej [1, 17, 26, 33, 39, 43, 47, 66, 68].

W artykule opisano rolę antyapoptotycznych białek z rodziny Bcl-2 w przebiegu zakażeń wywoływanych przez wirus grypy typu A (influenza A virus, IAV). Przedstawiono także potencjalne możliwości terapeutyczne, których zarys wyłania się z testów przedklinicznych wskazujących Mcl-1, Bcl-2, Bcl-xL i Bcl-w jako proponowane obiekty docelowe kuracji anty-IAV oraz z danych literaturowych potwierdzających zależność potencjału apoptotycznego komórki gospodarza od efektywności wirusowej replikacji.

Rodzina białek Bcl-2

Rodzina Bcl-2 to pro – i antyapoptotyczne czynniki białkowe zaangażowane w regulację mitochondrialnego szlaku indukcji, apoptozy. Według kryterium liczby domen homologii z Bcl-2 (Bcl-2 homology, BH), wyodrębnia się trzy grupy tych białek. Pierwsza z nich gromadzi antyapoptotyczne czynniki regulatorowe mające cztery domeny BH (BH1-4); jej przedstawicielami są: Mcl-1, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w i A1. Druga grupa obejmuje białka zawierające wyłącznie jedną domenę BH, tzw. białka mające „tylko-BH3” (BH3-only proteins): Bim, Bad, Bid, Bik, Bmf i Hrk. Funkcją tych czynników jest promocja apoptozy. Trzecia grupa białek z rodziny Bcl-2 jest tworzona przez białka zawierające trzy domeny BH (BH1-3). Należą do niej Bax i Bak [45, 49, 60], które w następstwie aktywacji uzyskują zdolność do tworzenia oligomerycznych porów w zewnętrznej błonie mitochondrialnej (outer mitochondrial membrane, OMM). Zwiększenie przepuszczalności OMM prowadzi do uwolnienia proapoptotycznych czynników, takich jak cytochrom c, z przestrzeni międzybłonowej do cytozolu i konsekwentnej aktywacji kaspazy-9 (inicjatorowej) i enzymów efektorowych w ramach wewnętrznego szlaku apoptozy. Antyapoptotyczne białka z rodziny Bcl-2, m.in. Bcl-2, są odpowiedzialne za wiązanie i unieczynnianie Bax i Bak, a zatem za ochronę integralności mitochondriów i przeciwdziałanie indukcji programowanej śmierci komórki w sposób zależny od tych organelli [5, 9].

Charakterystyka wirusa grypy typu A

IAV to patogen wielu gatunków zwierząt, występujący u ptaków, fok, norek, świń, koni, psów i – jako czynnik zoonotyczny – zagrażający ludziom. Głównym rezerwuarem wirusa jest ptactwo wodne [29, 42]. Większość IAV jest przyczyną łagodnych zakażeń odzwierzęcych, tym niemniej serotypy, takie jak H1N1, H5N1 H5N6, H10N8 i H7N9 mogą powodować poważne problemy zdrowotne, niekiedy nawet prowadzące do śmierci [4].

Genom IAV ma postać segmentowanego RNA o ujemnej polarności, zwanego wirusowym RNA (viral RNA, vRNA). Każdy z ośmiu segmentów vRNA IAV przyjmuje formę podwójnej helisy i tworzy wirusowy kompleks rybonukleinowy (viral ribonucleoprotein, vRNP) z cząsteczkami nukleoproteiny czynnika zakaźnego (nucleoprotein, NP) i heterotrimeryczną RNA-zależną polimerazą RNA, złożoną z podjednostek PA, PB1 i PB2. Struktury vRNP znajdują się w macierzy otoczonej sferyczną osłonką białkowo-lipidową, wzmocnioną od strony wewnętrznej białkiem M1 i eksponującą na swojej powierzchni hemaglutyninę (hemagglutinin, HA) oraz neuraminidazę (neuraminidase, NA). IAV jest różnicowane na serotypy w oparciu o warianty HA i NA [21, 35, 61, 70].

Wirusowa HA jest strukturą odpowiedzialną za wiązanie kwasu sjalowego glikoprotein lub glikolipidów komórki gospodarza i – w związku z tym – za adhezję wirionu do jej powierzchni. Czynnik zakaźny ulega następnie internalizacji w procesie endocytozy lub rzadziej makropinocytozy [30, 50]. W dalszym przebiegu zakażenia komórki, vRNP jest uwalnianie do cytozolu, a następnie migruje do jądra komórkowego i w jego obrębie ulega replikacji i transkrypcji [35, 61, 70]. Wirusowa polimeraza, złożona z trzech podjednostek – PA, PB1 i PB2, katalizuje syntezę RNA(+), zwanego komplementarnym RNA (complementary RNA, cRNA), w oparciu o segmenty vRNA patogenu [30]. cRNA służy następnie za matrycę do wytwarzania potomnych cząsteczek vRNA. Wirusową polimerazę cechuje brak aktywności korektorskiej, która jest przyczyną bardzo częstego występowania mutacji w genomach potomnych wirionów. Szacuje się, że z jednej zakażonej komórki może się uwolnić około 10000 mutantów IAV, co sprawia, że walka z patogenem jest bardzo kłopotliwa i jest dużym wyzwaniem dla współczesnej medycyny. Nowo powstałe vRNA może odgrywać rolę matrycy w procesach transkrypcji i dalszej replikacji bądź też opuścić jądro komórkowe w kompleksie z białkami wirusowymi (jako vRNP) [2], a następnie utworzyć wiriony potomne przez nabycie osłonki lipidowo-białkowej, w procesie tzw. „pączkowania” [48].

Antyapoptotyczna rola białek Mcl-1, Bcl-2, Bcl-xL i Bcl-w we wczesnym etapie zakażenia IAV

Mcl-1 jest antyapoptotycznym przedstawicielem rodziny Bcl-2, pozostającym w antagonistycznych relacjach z czynnikami promującymi apoptozę, należącymi do grupy białek zawierających trzy domeny BH [58]. Mcl-1 odgrywa rolę bezpośredniego inhibitora Bak, a także – pośrednio – przeciwdziała aktywacji Bax i Bak [16], oddziałując ze skróconą postacią Bid (truncated Bid, tBid) [6]. Germain i wsp. [16] w badaniach na ludzkich komórkach linii HeLa, transfekowanych wektorem kodującym Mcl-1, wykazali hamujący wpływ tego białka na translokację Bax do mitochondrium, a także – co się z tym wiąże – na zjawisko uwalniania cytochromu c z przestrzeni międzybłonowej [16]. Weiss i wsp. [62] podjęli próbę scharakteryzowania roli Mcl-1 w zakażeniu IAV, wykorzystując do badań komórki nabłonkowe nerki koczkodana zielonego linii Vero. Zgodnie z przewidywaniami, wyciszenie ekspresji genu kodującego Mcl-1 podnosiło potencjał apoptotyczny komórek do poziomu, przy którym zakażenie IAV spowodowało aktywację kaspazy-3. Dalsze badania zespołu pozwoliły ustalić wpływ deficytu Mcl-1 na istotny spadek wirusowego miana. Na podstawie uzyskanych wyników, Mcl-1 może wykazywać aktywność prowirusową jako białko opóźniające śmierć zakażonej komórki i – w związku z powyższym – umożliwiające wirusowi przeprowadzenie pełnego cyklu replikacyjnego. Otrzymane rezultaty badań przemawiają za ukierunkowaniem terapii przeciwwirusowych na przedwczesną – z perspektywy zakażenia wirusowego – indukcję apoptozy [62].

Rola Bcl-2, jako antyapoptotycznego przedstawiciela rodziny Bcl-2, w przebiegu wewnątrzkomórkowego zakażenia IAV jest niejednoznaczna i zrelatywizowana do etapu cyklu replikacyjnego wirusa. Przyspieszona apoptoza wiąże się z przerwaniem replikacji w jej wczesnym okresie; zbyt duża żywotność komórki (zahamowana apoptoza) – wpływa na wewnątrzkomórkową dystrybucję vRNP i uniemożliwia efektywny montaż potomnych wirionów [20, 32, 48].

Bcl-2 oraz Bcl-xL i Bcl-w, podobnie jak Mcl-1, mogą sprzyjać skutecznej replikacji na wczesnym etapie zakażenia, odgrywając rolę czynników opóźniających apoptozę do czasu zsyntetyzowania potomnych kompleksów vRNP w jądrze komórkowym. Badania Kakkoli i wsp. [20] na ludzkich komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki (retinal pigment epithelium, RPE) sugerują, że interakcje antyapoptycznych białek Bcl-2, Bcl-xL i Bcl-w z proapoptycznymi czynnikami Bax, Bad i autoantygenem błony naczyniowej zawierającym domenę superhelisy i powtórzenia ankyrinowe (uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats, UACA), promują zakażenie wirusowe, przeciwdziałając permeabilizacji mitochondriów, uwolnieniu cytochromu c do cytozolu i aktywacji kaskady apoptotycznych kaspaz na wczesnym etapie cyklu replikacyjnego [20].

Wpływ białka Bcl-2 na eksport vRNP z jądra komórkowego

Jednym z istotnych etapów wirusowego cyklu replikacyjnego jest uwalnianie vRNP z jądra komórkowego do cytozolu. Bcl-2 jest odpowiedzialne za zjawisko ograniczenia transportu nowo utworzonego vRNP z jądra komórkowego do cytoplazmy zakażonych komórek. Mechanizm wyjaśniający opisaną zależność nie został jednoznacznie scharakteryzowany [32, 48]. Według jednej z hipotez, przeciwwirusowe właściwości Bcl-2 wynikają z antagonizmu tego białka innego przedstawiciela rodziny Bcl-2 – proapoptotycznego czynnika Bax; odgrywa on istotną rolę w promocji zakażenia IAV [32]. Badania in vitro i in vivo wykazały, że wirus wywołuje apoptozę zakażonych komórek [28, 34, 38, 51, 57]. Powyższa strategia sprzyja replikacji wirusowej i – w skali ogólnoustrojowej – odpowiada za skuteczne rozprzestrzenianie się zakażenia i za wystąpienie charakterystycznych objawów grypy, takich jak limfopenia oraz stany zapalne płuc i dróg oddechowych. IAV jest czynnikiem zakaźnym wywołującym apoptozę zarówno komórek nabłonkowych, jak i komórek układu odpornościowego – limfocytów i komórek żernych. Apoptotyczna śmierć towarzysząca zakażeniu powoduje uszkodzenie tkanek gospodarza i przyczynia się do rozwinięcia stanu zapalnego [3, 31, 32]. W związku z powyższym, znajomość roli białka Bax w regulacji apoptozy w przebiegu cyklu replikacyjnego IAV, może być wykorzystana w projektowaniu terapii przeciwwirusowych. Badania McLeana i wsp. [32] dowiodły, że proapoptotyczny przedstawiciel rodziny Bcl-2 ma podstawowe znaczenie dla efektywności wewnątrzkomórkowego zakażenia. Mysie fibroblasty płodowe z unieczynnionym genem kodującym Bax wykazywały zwiększoną żywotność, w porównaniu do komórek niepoddanych wspomnianej modyfikacji. Wobec deficytu Bax zakażenie wirusowe nie powodowało indukcji apoptozy i aktywacji kaspaz efektorowych, co wpływało na zahamowanie wytwarzania IAV. Śmierć fibroblastów z unieczynnionym genem kodującym białko Bax zachodziła w procesie autofagii. Sprawne i efektywne składanie wirionów potomnych było uniemożliwione ze względu na akumulację vRNP w jądrze komórkowym [32]. Opisane badania są zgodne z pracą Wurzera i wsp. [64], opisującą zależność między aktywnością kaspazy-3 a wewnątrzkomórkową dystrybucją vRNP IAV. Unieczynnienie proapoptotycznego enzymu efektorowego z użyciem inhibitora, Z-DEVD-FMK, lub obniżenie poziomu syntezy kaspazy-3 z wykorzystaniem małego interferującego RNA (small interfering RNA, siRNA) w istotny sposób zakłócało wirusową replikację. Badania tego zespołu wykazały, że obecność Z-DEVD-FMK (40 µM) w płynie hodowlanym w 4-24 h zakażenia IAV komórek nabłonkowych nerki psa linii MDCK, powodowała obniżenie miana czynnika zakaźnego prawie do 30% poziomu obserwowanego w próbie kontrolnej, w której zakażone komórki były inkubowane w medium bez inhibitora. Dalsze eksperymenty wykazały, że w ludzkich komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych linii A549, unieczynnienie genu kodującego kaspazę-3 wpływa na wewnątrzkomórkową dystrybucję vRNP podczas zakażenia IAV. W komórkach z nieaktywnym genem proapoptotycznego enzymu zaobserwowano akumulację vRNP w jądrze komórkowym, co przemawiało za udziałem kaspazy-3 w transporcie vRNP do cytozolu, a więc za istotną rolą enzymatycznego białka w skutecznym przebiegu wirusowego cyklu replikacyjnego [64]. Czynnik Bax, jako białko uruchamiające wewnętrzny szlak indukcji apoptozy i – w związku z tym – pośrednio powodujące aktywację kaspazy-3, odpowiada za cytozolowe umiejscowienie vRNP i efektywne składanie potomnych wirionów IAV [32].

Tymczasem Bcl-2 może wiązać Bax, przeciwdziałając jego homooligomeryzacji, zapobiegając powstawaniu porów zwiększających przepuszczalność OMM i powstrzymując sekwencję zdarzeń prowadzących do aktywacji kaspazy-3. Badania wykazały, że oddziaływania na linii Bcl-2–Bax zachodzą między rowkiem uformowanym z domen BH1-3 Bcl-2 a regionem BH3 Bax. Ponadto w antagonistyczne interakcje Bcl-2–Bax mogą być zaangażowane obszar BH4 Bcl-2 i heliks 6 Bax [14].

Na podstawie innej hipotezy, Bcl-2 ogranicza uwalnianie vRNP z jądra komórkowego do cytozolu jako substrat wielofunkcyjnej kinazy p38 aktywowanej mitogenami (p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK) [8, 35], czynnika uczestniczącego w eksporcie vRNP z jądra komórkowego. W komórkach zakażonych IAV, p38MAPK jest zaangażowany w fosforylację białka Bcl-2. Modyfikacji ulegają dwie reszty aminokwasowe Bcl-2 – serynowa i treoninowa, występujące odpowiednio w pozycjach 56 i 87. Fosforylacja ogranicza antyapoptotyczną aktywność Bcl-2, dostosowując żywotność komórki do potrzeb czynnika zakaźnego i promując apoptozę potrzebną do uwolnienia i rozprzestrzenienia potomnych wirionów. Zaangażowanie p38MAPK w unieczynnianie Bcl-2 wpływa jednak na zmniejszenie podaży kinazy w jądrze komórkowym i przyczynia się do niedoboru cząsteczek enzymu ukierunkowanych na udział w transporcie vRNP z kompartmentu jądrowego do cytozolu zakażonej komórki [35]. Bcl-2 odpowiada za obniżenie efektywności replikacji IAV i istotny spadek wirusowego miana [35, 69]. Nencioni i wsp. [35] odkryli istotną zależność między poziomem Bcl-2 a dystrybucją p38MAPK w komórkach zakażonych IAV. W komórkach linii MDCK, w których nie było konstytutywnej biosyntezy Bcl-2, p38MAPK gromadziło się w jądrze komórkowym. Tymczasem w komórkach ludzkiego nerwiaka zarodkowego linii SH-SY5Y, odznaczających się dużym wytwarzaniem Bcl-2, jak również w komórkach linii MDCK poddanych stabilnej transfekcji wektorem kodującym to białko (MDCKBcl-2), p38MAPK występowało głównie w cytozolu, w postaci związanej z Bcl-2. W przebiegu dalszych badań na zakażonych komórkach linii SH-SY5Y, ekspresja genu kodującego Bcl-2 została wyciszona z wykorzystaniem siRNA, co spowodowało zwiększenie poziomu vRNP w cytozolu i ponadtrzykrotny wzrost wirusowego miana [35]. Wyniki były zgodne z wcześniejszą pracą zespołu, opisującą ujemny wpływ Bcl-2 na zjawisko uwalniania vRNP z jądra komórkowego do cytoplazmatycznych miejsc montażu potomnych wirionów IAV [36].

Wpływ białka Bcl-2 na glikozylację HA IAV

Wczesne badania Olsena i wsp. [40] dowiodły roli białka Bcl-2 w modyfikacji procesu glikozylacji HA IAV, białka odpowiedzialnego za adhezję wirionu do komórki gospodarza [40]. HA jest syntetyzowane w postaci prekursora – HA0, który ulega proteolitycznemu cięciu na dwie cząsteczki – HA1 i HA2, obecne na powierzchni wirusowej osłonki i warunkujące zakaźność IAV. Proteoliza zachodzi w aparacie Golgiego (Golgi apparatus, GA) od strony trans organellum, z udziałem furyny lub proteazy PC6. W sieci cystern GA odbywa się również glikozylacja HA1 i HA2 [40, 71]. Olsen i wsp. [40] – w badaniach nad rolą Bcl-2 w zakażeniu IAV – zaobserwowali, że zarówno masa cząsteczkowa HA1, jak i HA2, jest niższa w komórkach MDCKBcl-2 niż w próbie kontrolnej (w komórkach MDCK niepoddanych transfekcji wektorem kodującym Bcl-2). Powyższe różnice w wielkości molekuł zniwelowano, traktując badane białka N-glikozydazą. Wyniki sugerowały wpływ białka Bcl-2 na glikozylację HA i w konsekwencji – na zdolności adhezyjne nowo powstałych cząstek wirusowych i skuteczne rozprzestrzenianie się zakażenia IAV w skali ogólnoustrojowej. Modyfikacja glikozylacji HA istotnie ograniczała rozprzestrzenianie się IAV w hodowli komórkowej [40].

Możliwe implikacje terapeutyczne roli Bcl-2 i Mcl-1 w zakażeniu IAV

Weiss i wsp. [62] opisali prowirusową aktywność białka Mcl-1 jako czynnika podnoszącego żywotność zakażonej komórki do poziomu sprzyjającego skutecznej replikacji wirusowej. Jednocześnie zaproponowali wykorzystanie interleukiny-24 (interleukin, IL-24) w terapii zakażenia IAV [61]. IL-24, cytokina należąca do superrodziny IL-10, to białko o dużym potencjale terapeutycznym. Proapoptotyczna aktywność IL-24 determinuje jej właściwości przeciwnowotworowe i przeciwwirusowe [7, 10, 61, 62]. Dash i wsp. [11] przeanalizowali wpływ IL-24 na potencjał apoptotyczny komórek raka stercza, odkrywając zdolność badanej cytokiny do indukcji stresu siateczki śródplazmatycznej (endoplasmic reticulum stress, ERS). Wystąpienie zjawiska ERS hamowało ekspresję genu kodującego Mcl-1 na etapie translacji i kierowało komórki na drogę apoptozy. Związek między deficytem Mcl-1 a proapoptotycznym działaniem IL-24 potwierdzono, wykonując transfekcję komórek wektorem kodującym Mcl-1. Badanie dowiodło, że nadmierne wywarzanie Mcl-1 przeciwdziała apoptozie wywoływanej przez IL-24 [11]. Powyższe obserwacje są zgodne z badaniami Weissa i wsp. [62]. Wykazali oni wpływ IL-24 na obniżenie wewnątrzkomórkowego poziomu Mcl-1 w komórkach linii Vero zakażonych IAV i powiązali to z przeciwwirusową aktywnością badanej cytokiny [62].

Mcl-1 został również zaproponowany jako obiekt docelowy terapii anty-IAV przez Denisovą i wsp. [13]. Zespół poddał analizom przedklinicznym działanie obatoklaksu [13], substancji hamującej aktywność antyapoptotycznych białek z rodziny Bcl-2 i stanowiącej przedmiot pogłębionych badań z onkologii [22, 41, 46, 65]. Badania Denisovej i wsp. [13] wykazały, że związek ten skutecznie przeciwdziała replikacji IAV w hodowlach in vitro makrofagów i komórek linii RPE. Zespół zaobserwował również wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu Mcl-1 na wczesnym etapie infekcji oraz dowiódł, iż częściowe wyciszenie ekspresji genu kodującego Mcl-1 obniża żywotność zakażonych komórek i wpływa na zmniejszenie efektywności zakażenia [13]. Wyniki tych badań nabierają istotnego znaczenia w zestawieniu z pracą Nguyena i wsp. [37]. Wykazali oni, że obatoklaks łączy się z antyapoptotycznymi przedstawicielami rodziny Bcl-2, w tym preferencyjnie z białkiem Mcl-1 (ryc.1), najprawdopodobniej zajmując fragment kieszeni hydrofobowej w obrębie rowka wiążącego BH3. W świetle wykonanych analiz, interakcje Mcl-1 z eksperymentalną substancją leczniczą zapobiegają powstawaniu kompleksów Mcl-1-Bak i przeciwdziałają hamowaniu wewnętrznego szlaku apoptozy [37], co kwalifikuje obatoklaks do badań przedklinicznych nad możliwościami udoskonalenia terapii IAV [13, 62].

Potencjalnymi obiektami terapii anty-IAV są również inne antyapoptotyczne białka z rodziny Bcl-2: Bcl-2, Bcl-xL i Bcl-w. W oparciu o badania na komórkach linii RPE, Kakkola i wsp. [20] zaproponowali model mechanizmu odpowiadającego za aktywność przeciwwirusową eksperymentalnych substancji leczniczych – czynników ABT-263, ABT-199 i ABT-737 [20], o udokumentowanych właściwościach proapoptotycznych (ryc.1) i przeciwnowotworowych [12, 55, 56, 59]. Zgodnie z przedstawionym schematem, leki te wiążą się z Bcl-2, Bcl-xL i Bcl-w na wczesnym etapie zakażenia IAV, obniżając ich powinowactwo do Bax, Bad i UACA. Nieaktywne kompleksy antagonistycznych białek ulegają rozpadowi z uwolnieniem Bad i Bax, promujacych indukcję wewnętrznego szlaku apoptozy. Dochodzi do zakłócenia ciągłości OMM i przemieszczenia proapoptotycznych czynników z przestrzeni międzybłonowej mitochondrium do cytozolu zakażonej komórki. Cząsteczki cytochromu c, czynnika 1 aktywującego proteazy apoptotyczne (apoptotic protease-activating factor-1, Apaf-1) i UACA organizują się w apoptosom, rekrutujący i aktywujący kaspazę-9, a w związku z tym zapoczątkowujący kaskadę kaspaz prowadzącą do śmierci komórki [20]. Kakkola i wsp. [20] zaobserwowali, że ABT-263 – powodując nasilenie dysocjacji Bax, Bad i UACA od Bcl-xL i intensyfikację aktywacji kaspazy-9, – 3, – 7 i – 8 – zakłóca metabolizm i funkcje zakażonej komórki w stopniu prowadzącym do zahamowania syntezy mRNA i białek IAV [20].

W późnym etapie zakażenia IAV, Bcl-2 ujawnia właściwości przeciwwirusowe, co przemawia za ukierunkowaniem terapii anty-IAV na zwiększanie aktywności tego białka. Niejednoznaczna rola Bcl-2 w zakażeniu IAV wskazuje na możliwość wykorzystania go do zwalczania infekcji układu nerwowego [35]. Udokumentowany neurotropizm IAV sprawia, że zakażenie może się rozprzestrzeniać do mózgu gospodarza i powodować problemy neuropsychiatryczne. Infekcja szczepem H5N1 IAV niesie ryzyko poważnych uszkodzeń układu nerwowego [23, 35, 54]. Wirus ten został scharakteryzowany jako czynnik etiologiczny zapalenia mózgu i krwotoków wewnątrzmózgowych [54]. Neurony charakteryzują się stosunkowo małą wrażliwością na zakażenie IAV, co może się wiązać z wysokim poziomem Bcl-2 w tych komórkach [25, 35, 36]. Nencioni i wsp. [35] sugerują, że uszkodzenie tkanki nerwowej w patogenezie chorób układu nerwowego o etiologii wirusowej – związanej z IAV, wynika z unieczynnienia Bcl-2 w procesie fosforylacji zależnej od p38MAPK. W tych okolicznościach, białko Bcl-2 odpowiada za redukcję transportu nowo zsyntetyzowanego vRNP z jądra komórkowego do cytozolu i przez to ograniczenie montażu potomnych wirionów, jednak nie zapobiega apoptozie neuronów. Być może należałoby rozważyć zwalczanie zakażeń układu nerwowego IAV ukierunkowane na podniesienie żywotności komórek nerwowych przez ograniczenie aktywności p38MAPK [35]. Ponadto wiele badań poświęcono zagadnieniu skutecznego przeciwdziałania poniedokrwiennym lub pourazowym uszkodzeniom układu nerwowego z zastosowaniem terapii genowych zwiększających poziom Bcl-2 w neuronach. W eksperymentach wykorzystano różnorodne wektory – adenowirusowy [67], herpeswirusowy [18, 24] oraz wektor skonstruowany w oparciu o wirusy adenosatelitarne (adeno-associated viruses, AAV) [53], uzyskując obiecujące rezultaty w zwiększaniu żywotności komórek nerwowych. Niewykluczone, że podobna strategia byłaby skuteczna w próbach złagodzenia przebiegu i objawów zakażenia mózgu IAV.

Podsumowanie

Badania nad aktywnością Bcl-2 i Mcl-1 nabierają szczególnego znaczenia w projektowaniu terapii anty-IAV. Umiarkowany potencjał apoptotyczny zakażonej komórki – utrzymujący się na poziomie, przy którym jej żywotność jest zharmonizowana z cyklem replikacyjnym IAV – warunkuje efektywność wirusowej infekcji. Opisywane mechanizmy anty-IAV opierają się na indukcji apoptozy na wczesnym etapie zakażenia i eliminacji patogenu wraz ze środowiskiem jego replikacji; jednak badania sugerują powiązanie kaskady kaspaz z transportem vRNP do cytozolu, a więc – ze zjawiskiem poprzedzającym i determinującym skuteczny montaż potomnych wirionów. Rola antyapoptotycznych białek z rodziny Bcl-2 w infekcji IAV jest zatem niejednoznaczna. W zależności od etapu cyklu replikacyjnego, apoptoza może przeciwdziałać zakażeniu lub przeciwnie – odpowiadać za jego promocję. Strategie proponowanych terapii przeciwwirusowych, przedstawione w artykule, opierają się na modyfikacji wewnątrzkomórkowego poziomu i aktywności białkowych regulatorów apoptozy. Unieczynnienie Bcl-2, Bcl-xL i Bcl-w z użyciem ABT-263, ABT199 lub ABT-737, a także zmniejszenie wewnątrzkomórkowego poziomu lub zahamowanie aktywności Mcl-1, wykonane odpowiednio z wykorzystaniem IL-24 lub obatoklaksu, może prowadzić do przedwczesnej apoptozy i przerwania cyklu replikacyjnego IAV. Jednak badania dowodzą również przeciwwirusowej roli Bcl-2 na późnym etapie zakażenia. Antyapoptotyczne właściwości Bcl-2 mogą sprzyjać ograniczeniu uszkodzeń tkanki nerwowej podczas infekcji mózgu, co – w tym kontekście – przemawiałoby za skutecznością strategii terapeutycznej opartej na zwiększeniu aktywności lub wewnątrzkomórkowego poziomu białka Bcl-2.

Pełna treść artykułu