Abstrakt

Integryny należą do dużej rodziny transbłonowych receptorów adhezyjnych, których głównym zadaniem jest odbieranie i przekazywanie sygnałów biochemicznych i mechanicznych przez błonę komórkową w obu kierunkach. Integryny i ich ligandy odgrywają główną rolę w licznych fizjologicznych i patologicznych procesach, takich jak migracja, różnicowanie komórek, hemostaza, angiogeneza, inwazja nowotworów i gojenie się ran. Sygnały powstające wewnątrz komórki powodują przejście integryny w stan zdolny do wiązania liganda na skutek zmian konformacyjnych wewnątrz jej cząsteczki. Wiązanie zewnątrzkomórkowych ligandów indukuje również zmiany w strukturze cząsteczki integryny, które są przekazywane do wnętrza komórki. Przejście integryn z postaci nieaktywnej do postaci sprzyjającej wiązaniu liganda towarzyszy reorganizacja wiązań disiarczkowych wewnątrz jej cząsteczki. Powstawanie, redukcja i reorganizacja wiązań disiarczkowych katalizowana jest przez izomerazę disiarczkową (PDI). PDI zidentyfikowano na powierzchni wielu typów komórek, takich jak: komórki śródbłonka, wątroby, nowotworowe, trzustki i typu B. Izomeraza disiarczkowa występuje na powierzchni płytek krwi, gdzie odgrywa ważną rolę w procesach adhezji, agregacji i wydzielania. PDI bezpośrednio oddziałuje z integrynami, a wymiana: grupa tiolowa-disiarczek może wpływać na zmiany przestrzenne podczas aktywacji integryn. W pracy omówiono strukturę przestrzenną integryn, a także rolę reorganizacji wiązań disiarczkowych w procesie ich aktywacji.

Struktura integryn

Wśród receptorów odpowiedzialnych za proces adhezji wyróżnia się receptory związane z adhezją między komórkami oraz receptory odpowiedzialne za adhezję komórek do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM – extracellular matrix). Do pierwszej grupy należą kadheryny oraz duża grupa białek powierzchniowych tworząca nadrodzinę immunoglobulin Ig-SF (immunoglobulin superfamily) [32]. Do drugiej grupy należą integryny, które występują jedynie w świecie zwierząt, ale są obecne już u prymitywnych organizmów wielokomórkowych, takich jak gąbki lub koralowce [12].

Integryny należą do rodziny receptorów glikoproteinowych. Podstawową właściwością integryn jest zdolność wiązania bardzo różnych białek macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak fibronektyna, fibrynogen, witronektyna, laminina, kolagen, plazminogen, osteopontyna, czynnik von Willebranda, czy sialoproteiny szkieletu macierzy. Mimo specjalizacji w kierunku wiązania białek macierzy zewnątrzkomórkowej, integryny mogą być zaangażowane w oddziaływania komórka-komórka [62]. Integryny są wykorzystywane przez mikroorganizmy chorobotwórcze np. echowirusy, adenowirusy, herpeswirusy, jako czynnik umożliwiający wnikanie ich do wnętrza komórek [76,91]. Pośredniczą w przekazywaniu sygnałów związanych z adhezją, migracją, proliferacją, różnicowaniem komórek oraz apoptozą [70]. Ze względu na bardzo dużą różnorodność ligandów, są zaangażowane w podstawowe dla funkcjonowania organizmu procesy, takie jak utrzymywanie homeostazy, odpowiedź immunologiczną, generowanie stanów zapalnych, nowotworzenie, przemieszczanie się elementów morfotycznych krwi, aktywacja płytek krwi [30], chondrogeneza [5], czy miogeneza [69].

Cząsteczki integryn są zbudowane z łańcucha α i β tworzących niekowalencyjnie związany heterodimer. Wyróżniono 18 różnych łańcuchów α i 8 łańcuchów β, które mogą się łączyć ze sobą dając odpowiednio 24 kombinacje różnych heterodimerów [31]. Integryny są zbudowane z dużej N-końcowej domeny zewnątrzkomórkowej, domeny transbłonowej oraz krótkiej domeny cytoplazmatycznej [1,86,87].

Ze względu na rodzaj przyłączanego liganda integryny można przyporządkować do odpowiednich grup: integryny przyłączające lamininę (α1 β1 , α2 β1 , α3 β1 , α6 β1 , α7 β1 , α6 β4 ), przyłączające kolagen (α1 β1 , α2 β1 , α3 β1 , α10β1 , α11β1 ), leukocytarne (αL β2 , αMβ2 , αXβ2 , αDβ2 ) oraz rozpoznające motyw RGD (α5 β2 , αVβ1 , αVβ3 , αVβ5 , αVβ6 , αVβ8 , αIIbβ3 ). Inny rodzaj klasyfikacji dotyczy występowania w łańcuchu α-swoistego – około 180-200-aminokwasowego regionu wewnętrznego o charakterze kwasowym, określanego mianem domeny αI. Wyróżnia się podjednostki α, które mają domenę αI (α1 , α10, α11, αL , αM, αX, αD, αE ) oraz pod jednostki α niemające domeny αI (α3 , α4 , α5 , α6 , α7 , α8 , α9 , αV, αIIb) (ryc. 1) [79].

Strukturę przestrzenną integryn opisuje się jako podobną do sylwetki ludzkiej, gdzie globularna „głowa” oparta jest na dwóch „nogach” przechodzących w domenę transbłonową (ryc. 2). Do interakcji między podjednostką α i β dochodzi głównie w obrębie „głowy” [29]. W miejscu interakcji może się tworzyć tzw. motyw wiązania typu RGD, do którego przyłącza się sekwencja Arg-Gly-Asp cząsteczki liganda [99].

W  obrębie „głowy” podjednostkę α tworzy struktura β-śmigła (β-propeller) składająca się z siedmiu motywów β-kartki. Jeżeli w podjednostce α danego typu występuje domena αI, to jest umiejscowiona między drugim a trzecim motywem β-kartki. W strukturze β-śmigła są obecne motywy spinki do włosów typu β (β-hairpin), które wiążą jony Ca2+ stabilizując całą strukturę „głowy”. W obrębie „nogi” podjednostki α wyróżniamy obszar „wyższej nogi” utworzony przez strukturę określaną mianem uda (thigh) oraz obszar „niższej nogi” składający się z dwóch domen typu „łydka” (calf), odpowiednio calf-1 i calf-2, które są- siadują z regionem transbłonowym. Między strukturą „uda” oraz domeną calf-1 jest obecny region wiążący jony Ca2+ określany mianem „kolana” (genu), będący miejscem, w którym dochodzi do zagięcia podjednostki α wówczas, gdy jest ona w konformacji nieaktywnej [48].

Podjednostka β w obrębie „odcinka głowowego” składa się z domeny βI wykazującej duże podobieństwo do domeny αI oraz hybrydowej i PSI (plexin/semahorin/ integrin domain). Nazwa pochodzi od białek, w których ta domena występuje. W regionie „odcinka ogonowego” podjednostkę β tworzą cztery powtórzenia EGF-like (epidermal growth factor-like) oraz terminalna domena β-ogona (β-tail) [57]. Zarówno domena PSI, jak i regiony I-EGF są bogate w reszty cysteinowe tworzące między sobą wiązania disiarczkowe [71,98].

Dojrzałe, w pełni funkcjonalne podjednostki α, takie jak α3, α4, α5, α6, α7, α8, α9, αV, αIIb i αE powstają w wyniku obróbki potranslacyjnej polegającej na proteolitycznym trawieniu odpowiednich prekursorów. Enzymatyczne cię- cie białka odbywa się w obrębie motywu: Arg-Xxx-Arg/Lys-Arg lub motywu: His-Xxx-Xxx-Xxx-Arg/Lys-Arg i prowadzi do utworzenia C-końcowego lekkiego łańcucha oraz N-końcowego ciężkiego łańcucha. Łańcuch lekki ma masę około 25 kDa i jest zbudowany z domeny cytoplazmatycznej, transbłonowej i fragmentu regionu zewnątrzkomórkowego. Łańcuch ciężki ma masę 120 kDa i składa się z pozostałej części domeny zewnątrzkomórkowej. Oba łańcuchy połączone są mostkiem disiarczkowym. Proces cięcia jest przeprowadzany przez konwertazę białkową podobną do furyny (furin-like protein convertase) [46].

Domena αI (lub αA) obecna w podjednostce α wykazuje homologię do tzw. domeny A obecnej w czynniku von Willebranda, która jest odpowiedzialna za wiązanie kolagenu. Domena αI przyjmuje kształt określany mianem konformacji Rossmanna (Rossmann fold) utworzony z siedmiu α-heliksów otaczających centralnie położoną strukturę β-kartki [45]. W obrębie domeny αI występuje motyw adhezji zależnej od jonów metalu MIDAS (metal ion dependent adhesion site). Region MIDAS w warunkach fizjologicznych przyłącza jony Mg2+ lub Mn2+ [99] w obrębie pięciu bocznych łańcuchów umiejscowionych na trzech różnych pętlach. Pierwsza z pętli zawiera trzy reszty aminokwasowe charakterystyczne dla całej domeny αI: Asp- -Xxx-Ser-Xxx-Ser. Druga pętla zawiera resztę treoniny (Thr), a trzecia resztę kwasu asparaginowego (Asp) [24].

W integrynach niemających domeny αI jej rolę przejmuje domena określana jako βI, αI-like, αA-like, lub βA, która zawiera motyw strukturalnie homologiczny do motywu MIDAS oraz sekwencję Asp-Xxx-Ser-Xxx-Ser. Domena βI różni się od domeny αI tym, że zawiera dwa dodatkowe segmenty. Jeden z tych segmentów oddziałuje z obszarem β-śmigła w podjednostce α, podczas gdy drugi jest określany jako pętla determinująca swoistość przyłą- czania liganda SDL (specificity determining loop). W domenie βI jest obecna także domena przylegająca do domeny MIDAS, tzw. ADMIDAS (adjusted to MIDAS) oraz region indukowanego przez ligand wiązania jonów LIMBS (ligand-assiciated metal binding site). Zarówno ADMIDAS jak LIMBS w odróżnieniu od kasety MIDAS mogą wiązać jony Ca2+ [57]. Przyłączenie jonów Ca2+ do regionu ADMIDAS powoduje hamowanie przyłączania liganda, podczas gdy przyłączenie Mn2+ stymuluje adhezję [56,75].

Wiązanie jonów dwuwartościowych jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania integryn. W zależności od rodzaju jonu, jego rola w pośredniczeniu przyłączania liganda może być różna. Jony Mn2+ i Mg2+ stymulują procesy adhezyjne. Funkcja jonów Ca2+ zależy od ich stężenia: duże stężenie jonów Ca2+ działa hamująco na adhezję, natomiast małe stężenie jonów Ca2+ w połączeniu z optymalnym lub zbliżonym do optymalnego stężeniem jonów Mg2+ stymuluje przyłączenie liganda do integryny [56]. W przypadku jonów Ca2+ również miejsce wiązania pełni istotną rolę w stymulacji bądź hamowaniu adhezji. Niewielkie stężenie jonów Ca2+ powoduje ich wiązanie do regionu LIMBS inicjując stymulację rozpoznawania i przyłączania liganda. Duże stężenie natomiast jest skorelowane z wiązaniem się jonów Ca2+ do regionu ADMIDAS i inhibicją adhezji [57].

Mechanizm aktywacji integryn

Aktywacja integryn może się odbywać na dwa sposoby, w zależności od kierunku, z którego pochodzi sygnał aktywacji: z zewnątrz komórki (outside-in signaling) oraz z wnętrza komórki (inside-out signaling). W przypadku przekazywania sygnału typu outside-inprzyłączenie liganda do zewnątrzkomórkowych domen integryny prowadzi do przemieszczenia części głowowej obu podjednostek, wydłużenia integryny w obszarze „kolana” oraz wyprostowania całej struktury. Nastepstwem wyprostowania integryny jest rozsunięcie się domen tworzących obszar „nóg”, temu procesowi towarzyszy rozsunięcie się regionów transbłonowych i cytoplazmatycznych obu podjednostek. Zaktywowane w ten sposób cząsteczki integryny wykazują zwiększone powinowactwo do ligandów i zaczynają tworzyć skupiska (clustering), co inicjuje procesy adhezyjne między komórką a macierzą zewnątrzkomórkową [24]. Ponadto po rozsunięciu „nóg” integryny, domeny cytoplazmatyczne mogą oddziaływać z wewnątrzkomórkowymi białkami odpowiedzialnymi za transdukcję sygnału, np. w przypadku integryny αVβ3 i szlaku kinazy MAPK/ ERK (mitogen-activated protein kinese/extracelular signal regulated kinese pathway) biorącej udział w odpowiedzi komórki na czynniki wzrostu [20]. Szlaki przekazywania sygnału uruchomione w wyniku aktywacji integryn, regulują zachowanie komórek, ich kształt, polarność, zdolność do przemieszczania się, wzrostu i różnicowania oraz mogą blokować procesy apoptotyczne [24].

Model aktywacji inside-out zakłada, że do przejścia integryny w stan aktywny nie jest wymagane przyłączenie liganda [102]. Aktywacja typu inside-out przebiega z udziałem wewnątrzkomórkowych białek związanych ze szkieletem cytoplazmatycznym: kindlin, talin oraz migflin [28,29]. Kindliny są odpowiedzialne za etap rekrutacji migflin w pobliżu domen cytoplazmatycznych integryn. Migfliny przeprowadzają proces przemieszczenia filamentów cytoszkieletu z dala od integryn. Cytoplazmatyczne domeny integryn wolne od blokujących je filamin pochodzących z filamentów cytoszkieletu mogą oddziaływać z talinami odpowiedzialnymi za finalny etap aktywacji, który prowadzi do rozsunięcia obu podjednostek integryn [56,82].

Integryny występują w trzech konformacjach: zamkniętej, zaktywowanej (wydłużonej zamkniętej) oraz aktywnej (wydłużonej otwartej). Podstawowym elementem, który ulega zmianie podczas przechodzenia z konformacji zamkniętej (ryc. 3) do zaktywowanej (ryc. 4) jest wydłużenie integryny w miejscu zgięcia, które leży między domeną calf-1 i udem w podjednostce α oraz domeną I-EGF1 i I-EGF2 w podjednostce β. Proces ten prowadzi do swoistego „wyprostowania” przestrzennej struktury całego białka i jest stabilizowany przez separację domen transbłonowych oraz regionu „niż- szych nóg” [73,75].

Model działania integryn

W obrębie domeny MIDAS podjednostki α pięć wspomnianych wcześniej reszt aminokwasowych (odpowiednio: dwie reszty seryny, dwie reszty kwasu asparaginowego i jedna reszta treoniny) tworzy tzw. podstawową i dodatkową domenę koordynacyjną, które otaczają dwuwartościowe jony metalu. Podstawowa domena koordynacyjna oddziałuje z jonem metalu bezpośrednio, podczas gdy dodatkowa domena koordynacyjna oddziałuje z jonem metalu za pośrednictwem cząsteczek wody dostarczających obdarzone ładunkiem ujemnym cząsteczki tlenu niezbędne do utworzenia wiązania koordynacyjnego z dodatnio naładowanym jonem metalu [21,89].

Gdy domena αI zmienia konformację z zamkniętej na otwartą reszty aminokwasowe zmieniają swoje położenie. Reszta kwasu asparaginowego przemieszcza się z podstawowej do dodatkowej domeny koordynacyjnej, a reszta treoniny w przeciwnym kierunku. Zmiana położenia reszt aminokwasowych zachodzi przez zmianę położenia łańcuchów bocznych domeny αI. Procesowi temu towarzyszy przemieszczanie się jonów metalu. Zmiana w podstawnikach koordynujących jon metalu dotyczy zamiany mającej ujemny ładunek elektryczny reszty asparaginy na pozbawioną ładunku resztę treoninową. Reakcja zwiększa elektrofilowość jonu metalu, co zapewnia łatwiejszą interakcję z ujemnie naładowanymi regionami liganda [21,72,89].

W konformacji otwartej integryny (ryc. 5) reszty aminokwasowe treoniny i seryny są obecne w podstawowej domenie koordynacyjnej, a dwie reszty kwasu asparaginowego wchodzą w skład dodatkowej domeny koordynacyjnej. W konformacji otwartej jedyną cząsteczkę tlenu obdarzoną ładunkiem ujemnym obecną w podstawowej domenie koordynacyjnej dostarcza ligand, zazwyczaj za pośrednictwem reszty kwasu glutaminowego. Brak ujemnie naładowanych podstawników w podstawowej domenie koordynacyjnej w konformacji otwartej integryny umożliwia silne oddziaływania między ligandem a jonem metalu [21,45,89].

Rearanżacji łańcuchów bocznych domeny αI mających bezpośredni kontakt z ligandem towarzyszy przemieszczanie pętli β6-α7 w obrębie podjednostki αI. Mimo że pętla β6-α7 nie jest częścią domeny MIDAS, ani też nie wiąże liganda, zmiana jej położenia umożliwia zmianę konformacji przestrzennej integryny [45,72,88].

W czasie „otwierania” części głowowej (ryc. 5) ruch pętli β6-α7 domeny αI wymusza przemieszczenie bocznej pętli β1-α1 domeny βI oraz przyłączonego do niej jonu metalu z motywu ADMIDAS w kierunku grupy karboksylowej liganda. Przemieszczenie powoduje przesunięcie pętli β6-α7 domeny βI, co powoduje wypchnięcie struktury α7-heliksu wzdłuż podjednostki β w kierunku domeny hybrydowej. Domena hybrydowa obraca się, a ruch jest przekazywany dalej w kierunku domeny PSI oraz I-EGF-1 powodując rozsunięcie się „nóg” podjednostki α oraz β. Przesunięcie pętli β6-α7 w kierunku domeny hybrydowej często jest określane jako podobne do ruchu tłoka (piston-like motion), ponieważ podczas obracania się domeny hybrydowej pętla β6-α7 zaczyna się przechylać do góry i do dołu, co w istocie może przypominać ruch tłoka połączonego z wałkiem rozrządu w silnikach samochodowych [24,47,75].

W przypadku integryn niemających w swojej cząsteczce domeny αI proces aktywacji przebiega podobnie. Różnicą jest brak etapów występujących w obrębie domeny αI, a ligand przyłącza się do cząsteczki integryny za pośrednictwem motywu RGD (Arg-Gly-Asp) właściwego dla cząsteczek fibronektyny. Ligand łączy się w jednakowym stopniu do domeny βI z podjednostki β – za pośrednictwem reszty asparaginy oraz do struktury β-śmigła z podjednostki α – za pośrednictwem reszty argininy. Zmiany konformacji w miejscu wiązania liganda zachodzące podczas aktywacji integryny dotyczą jedynie podjednostki β. Przyłączenie liganda wymusza przemieszczenie pętli β6-α7 oraz α7-heliksu podjednostki β w sposób analogiczny do ruchu pętli β6-α7 podjednostki αI w integrynach ją zawierających [89,99].

Modyfikacje mostków disiarczkowych w integrynach

W cząsteczkach integryn region bogaty w cysteiny obejmuje obszar domen typu I-EGF. Każda z domen I-EGF zawiera osiem reszt cysteinowych, które tworzą między sobą mostki disiarczkowe w konfiguracji 1-5, 2-4, 3-6 oraz 7-8. Wyjątkiem jest domena I-EGF1, która nie ma wiązania 2-4. O ile wiązania 2-4, 3-6 oraz 7-8 występują w innych białkach zawierających domeny typu EGF-like, to wiązanie 1-5 jest charakterystyczne jedynie dla integryn. Integryny zawierające podjednostkę β typu β3, takie jak αIIbβ3 oraz αVβ3 mają dodatkowo sekwencję Cys-Xxx-Xxx-Cys powtórzoną pięciokrotnie oraz sekwencję Cys-Gly-Xxx-Cys powtórzoną czterokrotnie i będącą elementem dłuższego motywu Gly-Xxx-Cys-Xxx-Cys- -Gly-Xxx-Cys-Xxx-Cys wchodzącego w skład tzw. regionów bogatych w powtórzenia cysteinowe CRRs (cysteine-rich repeat regions). Obecność mostków disiarczkowych w integrynach jest związana z procesem składania w pełni funkcjonalnych cząsteczek białka z odpowiednich prekursorów. Dopiero dojrzałe cząsteczki integryn o prawidłowej strukturze przestrzennej są transportowane na powierzchnię komórek. Ponadto modyfikacje mostków disiarczkowych umożliwiają aktywację integryn w sposób alternatywny, niezależnie od przyłączenia liganda [7,33,80,97].

Rolę mostków disiarczkowych w regulacji procesów składania oraz w aktywacji cząsteczek integryn najlepiej obrazują eksperymenty, w których przeprowadzono modyfikacje polegające na podstawieniu reszty seryny w miejsce jednej lub obu cystein tworzących pierwotne wiązanie. Substytucje seryny w miejsce reszty cysteiny w wiązaniu Cys-567 i Cys- 581 (wiązanie 2-4 w obrębie I-EGF4) oraz Cys-575 i Cys-586 (wiązanie 3-6 w I-EGF4) znacznie obniżają poziom ekspresji integryny αIIbβ3 oraz αVβ3 na powierzchni komórek, przez zaburzenia procesów składania białka, a tym samym wywołując nieprawidłowości w jego konformacji przestrzennej. Podobnie jest w przypadku zmian w tworzeniu wiązań między Cys-549–Cys-558 (wiązanie 5–6 w I-EGF3) oraz Cys- 567–Cys-581 (1-3 w I-EGF4) [54]. Przekształcenia wiązania Cys-437-Cys-457 w obrębie domeny I-EGF1 w wyniku substytucji hamują umiejscawianie αIIbβ3 na powierzchni komórek znacznie silniej niż w przypadku takiej samej modyfikacji w integrynie αVβ3 . Zmiany w wiązaniu Cys-473-Cys-503 na obszarze I-EGF2 bardziej obniżają poziom powierzchniowej ekspresji αVβ3 niż αIIbβ3 . Natomiast przerwanie wiązania Cys-588-Cys598 (5-6 w I-EGF3) nie ma żadnego wpływu na poziom ekspresji integryn na powierzchni komórek [33,54,55,68].

Modyfikacje mostków disiarczkowych w domenach I-EGF mogą wpływać także na ich aktywność. W przypadku integryny αIIbβ3 zaburzenia w obrębie wiązań Cys-549-Cys-558, Cys-536-Cys-544 oraz Cys-523-Cys-544 (wszystkie w domenie I-EGF3) powodują, że αIIbβ3 jest w stanie konstytutywnie aktywnym. Przekształcenia wiązań Cys-437-Cys-457 w I- -EGF1 oraz Cys-473-Cys-503 w I-EGF2 utrzymują w stanie aktywnym zarówno αIIbβ3 jak i αVβ3 z silniejszym skutkiem w przypadku αIIbβ3 . Natomiast zmiany w obrębie wiązania Cys-567-Cys-581 w I-EGF4 utrzymują αIIbβ3 w stanie nieaktywnym jednocześnie całkowicie uniemożliwiając aktywację [33,53,54,68]. Zarówno Cys-437 jak i Cys-457 to pierwsze reszty cysteinowe sekwencji Cys-Xxx-Xxx-Cys, które są typowe dla oksydoreduktaz, czyli enzymów katalizujących reakcje typu redoks. Ze względu na obecność tych sekwencji oraz to, że jej modyfikacje powodują przejście cząsteczki integryny w stan aktywny, sugeruje się, że integryny αIIbβ3 jak i αVβ3 mogą wykazywać endogenną aktywność izomerazy tiolowej. Aktywność ta przejawiałaby się potencjalną zdolnością integryn do przeprowadzania modyfikacji własnych mostków disiarczkowych za pośrednictwem reakcji utlenienia-redukcji [16,60,99].

W przypadku integryn mających podjednostkę β typu β3 należy dodatkowo zwrócić uwagę na unikalne dla nich wiązanie Cys-560-Cys-583 łączące domenę I-EGF3 oraz I-EGF4. Przekształcenia wiązania łączącego dwie domeny I-EGF przez utworzenie wolnej grupy tiolowej w jedynej z cystein indukują reorganizację obu domen względem siebie [55]. Substytucja seryny, argininy lub fenyloalaniny w miejsce Cys-560 inicjuje przejście integryny w stan aktywny, podczas gdy podstawienie seryny w pozycji Cys-583 bądź obu reszt cysteinowych jednocześnie nie powoduje takich skutków. W związku z powyższym możliwe, że za aktywację integryny nie odpowiada bezpośrednio proces rozerwania mostka disiarczkowego, ale prawdopodobnie będące następstwem tego mechanizmu pojawienie się wolnych grup tiolowych w reszcie cysteiny – w tym wypadku w Cys-560. Jest to szczególnie istotne spostrzeżenie ze względu na późniejsze rozważania dotyczące białek modyfikujących strukturę integryn. Podobny skutek konstytutywnej aktywacji obserwuje się w przypadku rozerwania wiązania Cys-523-Cys544 w I-EGF3 w integrynie αVβ3 [54].

Integryny αVβ3 oraz αIIbβ3 zawierają motywy typowe dla białek zaangażowanych w redukcję mostków disiarczkowych do wolnych grup tiolowych, a tym samym mogłyby przeprowadzać modyfikacje własnych mostków disiarczkowych indukując przejście do postaci aktywnej lub nieaktywnej bez obecności innych białek. Jednak dużo bardziej prawdopodobnym wydaje się, że za modyfikacje wiązań disiarczkowych w cząsteczkach integryn są odpowiedzialne nie same integryny, ale izomerazy tiolowe.

W osoczu są obecne niskocząsteczkowe czynniki określane wspólnym mianem wolnych tioli, które mogłyby przeprowadzać reakcje typu redoks prowadzące do aktywacji integryn. Do grupy tej zalicza się glutation (GSH), cysteinę (CSH), cysteino-glicynę (CGSH) oraz homocysteinę (HCSH). Aktywność wolnych, niskocząsteczkowych tioli osocza jest związana z utrzymywaniem prawidłowego stanu redoks krwi na zasadzie czynnika buforującego, dostarczającego wolne grupy -SH lub mostki disiarczkowe niezbędne do reakcji utleniania-redukcji. Wolne tiole są zaangażowane w przemiany związane z utworzeniem bądź rozerwaniem wiązań disiarczkowych modyfikujące strukturę wielu białek obecnych zarówno na powierzchni komórek jak i w przestrzeni zewnątrzkomórkowej.

Glutation zawiera zarówno wolne grupy tiolowe, jak i mostki disiarczkowe; w postaci utlenionej katalizuje utlenienie substratu, natomiast w zredukowanej przeprowadza reakcję odwrotną [6,60]. W prawidłowych komórkach występuje w dużym stężeniu, bo sięgającym nawet kilku milimoli na litr, tylko w obszarze siateczki śródplazmatycznej ER (endoplasmic reticulum). W obrębie ER przeważa glutation w postaci utlenionej, która potencjalnie mogłaby generować nowe mostki disiarczkowe w integrynach. Jednak w przestrzeni zewnątrzkomórkowej stężenie glutationu jest znacznie niższe. W osoczu waha się w granicach 3-25 μmoli. Istotne również jest to, że glutation w przeciwieństwie do ER, poza komórką występuje głównie w postaci zredukowanej w proporcji GSH/GSSG od 4:1 nawet do 13:1 [2,52]. W warunkach fizjologicznych glutation w postaci zredukowanej zwiększa liczbę wolnych grup tiolowych w podjednostce β zarówno w integrynie αIIbβ3 jak i αVβ3 . [7,60]. Możliwe, że liczba wolnych grup tiolowych generowanych przez glutation przyczynia się do powstania puli zapasowej wolnych grup -SH, które mogą zostać potencjalnie użyte do tworzenia nowych wiązań disiarczkowych przez enzymy [7].

Z pozostałych niskocząsteczkowych wolnych tioli osocza, cysteina osiąga stężenie rzędu 200 μmoli/L, cysteino-glicyna 30 μmoli/L, a homocysteina 10 μmoli/L. Zarówno cysteiny jak i cysteino-glicyny obecne w osoczu osiągają wyższy poziom niż glutation, jednak prawdopodobieństwo, że samodzielnie przeprowadzają rearanżacje mostków disiarczkowych jest znikome. Prawdopodobnie wolne tiole osocza wykazują zdolność do częściowej aktywacji integryn. Jednak integryny pozostające w stanie częściowo aktywnym mogą być odporne na działanie czynników przeprowadzających pełną aktywację, a więc rola wolnych tioli polegałaby raczej na inhibicji niż aktywacji integryn. Możliwe jednak, że częściowa aktywacja jest tylko jednym z czynników w całym procesie. Wówczas wolne tiole osocza generowałyby w cząsteczkach integryn niezwiązane grupy -SH, które później biorą udział w procesie tworzenia nowych mostków disiarczkowych, katalizowanym przez oksydoreduktazy czy izomerazy tiolowe (ryc. 6) [3,49,84].

Budowa izomerazy disiarczkowej

Białkowa izomeraza disiarczkowa (PDI) (protein disulfide isomerase) została odkryta już w 1963 r. przez dwie niezależne grupy badaczy: Venetianera i Strauba oraz Goldbergera i wsp. [27,85]. PDI jest enzymem o aktywności oksydoreduktazy, przeprowadzającym reakcje redukcji przez tworzenie wolnych grup tiolowych oraz utleniania przez tworzenie mostków disiarczkowych w białkach substratowych. Aktywność PDI dotyczy przede wszystkim białek umiejscowionych w obrębie siateczki śródplazmatycznej. Tworzenie mostków disiarczkowych przez PDI w białkach, które ulegają dojrzewaniu w obszarze światła ER (ER lumen) jest nieodłącznym elementem procesów składania prawidłowych, w pełni funkcjonujących cząsteczek białkowych z odpowiednich prekursorów. Białkowa izomeraza disiarczkowa należy do nadrodziny tioredoksyn (thioredoxin superfamily) obejmującej białka mające w swojej cząsteczce elementy strukturalne zbliżone do tioredoksyny, która jest cytosolowym białkiem zaangażowanym w reakcje typu redoks opierające się na wymianach grup tiolowych. PDI ulega ekspresji w większości prawidłowo funkcjonujących tkanek i narządów, a stanowi około 1% wszystkich białek znajdujących się w organizmie człowieka. Występuje przede wszystkim wewnątrz komórki, w siateczce śródplazmatycznej i aparacie Golgiego. Obecna jest tak- że na powierzchni komórek: płytek krwi [22], limfocytów [10], tyreocytów [94], neutrofilów [9] oraz komórek śródbłonka [23]. W przestrzeni zewnątrzkomórkowej oddziałuje z trombospondyną, fibrynogenem oraz czynnikiem von Willebranda [96]. Doniesienia o umiejscowieniu PDI w innych przestrzeniach komórkowych, takich jak jądro komórkowe, mitochondria i cytosol [67,83,93] wydają się kontrowersyjne.

Białkowa izomeraza disiarczkowa jest białkiem o masie około 55 kDa i zawiera 491 aminokwasów tworzących cztery podstawowe domeny strukturalne: a, b, b’, a’. Dodatkowymi elementami wchodzącymi w skład dojrzałej cząsteczki białka są: 17-19-aminokwasowa wstawka mię- dzy domeną b’ i a’, tzw. x-łącznik (x-linker) oraz region C-końcowy o charakterze silnie kwasowym (ryc. 7) [29].

Domeny a i a’ są domenami katalitycznymi, zawierają motyw Cys-Xxx-Xxx-Cys właściwy dla białek, których funkcja jest związana z metabolizmem grup -SH. Domeny a i a’ wykazują 36,8% homologii względem siebie oraz stosunkowo wysoki stopień homologii z tioredoksyną [28]. Domeny b i b’ nie zawierają katalitycznie aktywnych reszt cysteinowych. Nie wykazują homologii do domen a i a’, natomiast względem siebie mają jedynie 19,3% homologii. Krótkie odcinki między domeną a i b oraz między b i b’ zawierają zaledwie kilka aminokwasów, co ogranicza elastyczność ruchów wszystkich czterech domen w przestrzeni. Rola obszarów b i b’ jest związana głównie z rozpoznawaniem i przyłączaniem substratu. Obecność regionów b i b’ w cząsteczce PDI pozwala na oddalenie domen katalitycznych względem siebie w przestrzeni, a tym samym umożliwia ich prawidłowe funkcjonowanie [29,42].

W obrębie domeny x-łącznika wyróżniamy region N-końcowy oraz C-końcowy. Odcinek N-końcowy jest zbudowany z siedmiu aminokwasów i układa się równolegle wzdłuż domeny b’ łącząc się z nią za pomocą wiązań hydrofobowych. Dwunastoaminokwasowy odcinek C- oddziałuje z domeną a’ w sposób stosunkowo swobodny, bez udziału silnych wiązań hydrofobowych bądź mostków solnych. Obecność x-łącznika w cząsteczce PDI zapewnia całemu białku ograniczoną możliwość zmian konformacji przestrzennej [42]. Bogaty w podstawniki o charakterze kwasowym C-koniec cząsteczki PDI zawiera motyw Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL), za pomocą którego oddziałuje z receptorem obecnym w ER. Motyw KDEL jest elementem sygnałowym, uniemożliwiającym sekrecję białek funkcjonujących w obrębie ER poza obszar siateczki śródplazmatycznej oraz kierującym białka z innych regionów komórki do wnętrza ER [14,39,44].

Konformacja przestrzenna PDI jest określana mianem tzw. struktury tioredoksyny (thioredoxin fold), która występuje w wielu białkach zaangażowanych w przemiany związane z grupami tiolowyni np. w peroksydazie glutationu, S-transferazie glutationowej. Struktura tioredoksyny składa się z trzech warstw, z których każda zawiera motyw α-β-α. Motyw ten jest zbudowany z dwóch struktur α-heliksu ułożonych po jednej stronie czteroniciowej struktury β-kartki oraz pojedynczej struktury α-heliksu umiejscowionej po stronie przeciwnej. Spośród czterech nici struktury β-kartki trzy są ułożone przeciwrównolegle [64].

Sekwencje katalityczne Cys-Xxx-Xxx-Cys domen a i a’ są umiejscowione w α2-heliksie, gdzie N-końcowa cysteina tworząca domenę katalityczną znajduje się na samym N- -końcu heliksu, podczas gdy C-końcowa cysteina wykazuje jedynie ograniczony kontakt z substratami. Cysteina umiejscowiona bliżej N-końca białka jest odpowiedzialna za tworzenie wiązania disiarczkowego z cząsteczką liganda, podczas gdy cysteina położona bliżej C-końca PDI inicjuje rozerwanie tego wiązania i uwolnienie liganda. C-końcowa cysteina nie jest potrzebna do przeprowadzenia reakcji bezpośredniej izomeryzacji, ale jest niezbędna w funkcjonowaniu PDI w cyklicznych reakcjach utlenienia i redukcji oraz w tzw. drodze ucieczki (escape pathway), czyli uwolnienia PDI z połączenia disiarczkowego z substratem, gdzie PDI zostało kinetycznie zablokowane podczas tworzenia produktu pośredniego [40,41,90].

PDI w stanie zredukowanym wykazuje zdolność do przeprowadzania reakcji redukcji wiązań disiarczkowych oraz reakcji izomeryzacji. Ponieważ katalizowanie reakcji izomeryzacji jest podstawową funkcją PDI wydaje się, że białko to powinno przyjmować w komórce głównie postać zredukowaną. Jednak stan redoks PDI jest bardzo płynny i zmienia się w zależności od warunków panujących w komórce zwłaszcza pod wpływem zmian równowagi redoks w ER [29].

Za wiązanie białek substratowych do PDI odpowiadają niekatalityczne domeny b i b’. Cząsteczka liganda przy- łącza się głównie do regionu tworzącego swego rodzaju „kieszeń” ograniczoną z obu stron przez domeny b i b’. Kieszeń zawiera znaczną liczbę podstawników hydrofobowych między heliksami α1 i α3: Phe-233, Ala-228, Phe-232, Ile-284, Phe-287, Phe-288, Leu-303, Met-307 [42]. Proces wiązania substratów przeprowadzany przez domenę b’ występuje wtedy, gdy substratami są duże i średnie białka. Jest również bardzo wrażliwy na konformacyjne zaburzenia struktury pozostałych domen PDI [36]. Krótkie peptydy oraz białka o nie do końca zdefiniowanej lub nieprawidłowej strukturze przestrzennej (misfolded proteins) są wiązane dodatkowo przez domenę b z niewielkim współudziałem obszaru a’ [36,37]. Istotny dla wiązania substratu jest także 26-aminokwasowy region o charakterze silnie kwasowym obejmują- cy ostatni α-helix domeny a’ oraz pierwszą połowę domeny C. Pełni jedynie rolę pomocniczą, gdyż PDI wiąże substraty przede wszystkim za pośrednictwem wiązań hydrofobowych [38,59].

Z pozostałych motywów istotnych dla funkcjonowania PDI należy wymienić zachowane ewolucyjnie podstawniki prolinowe (Pro-61 i Pro-405) umiejscowione w regionie centralnym α2-heliksu, które wprowadzają skręt do struktury przestrzennej α-heliksu i umożliwiają jej zawinięcie dookoła struktury β-kartki. Innym ważnym elementem są pary podstawników obdarzonych ładunkiem elektrycznym, które są ulokowane od spodniej strony centrum aktywnego PDI: Glu-47 i Lys-81 w domenie a oraz Glu-391 i Lys-424 w domenie a’. Podstawniki te są istotne dla katalitycznych właściwości PDI, gdyż są zaangażowane w reakcje związane z transferem protonów podczas reakcji utleniania-redukcji przeprowadzanych przez PDI [19].

Białkowa izomeraza disiarczkowa wykazuje niewielkie możliwości zmian konformacyjnych w obrębie własnej cząsteczki. Uwzględniając, że większość substratów PDI to białka w fazie składania możliwym wydaje się, że to właśnie substraty PDI, a nie samo PDI zmieniają swoją konformację w czasie interakcji. Świadczy o tym to, że białka w fazie składania są mniej stabilne i łatwiej ulegają modyfikacjom przestrzennym. Niemniej jednak PDI będąc w postaci zredukowanej łączy się z innymi substratami niż w utlenionej, a więc pewne zmiany konformacji PDI muszą wystąpić [44]. Jedną z takich zmian może być przemieszczenie bocznego łańcucha argininy w pozycji 120 domeny a. Boczny guanylowy łańcuch Arg-120 przemieszcza się w pobliże jednej z katalitycznych cystein C- -końca: Cys-56, która jest częściowo schowana wewnątrz domeny katalitycznej. Przemieszczenie Arg-120 z jednej strony może „wypychać” Cys-56 na zewnątrz, tym samym ułatwiając jej kontakt z ligandem, a z drugiej dostarcza ładunek dodatni w pobliże Cys-56 niezbędny do przeprowadzenia reakcji utleniania-redukcji [43]. Kolejnym elementem biorącym udział w zmianach konformacyjnych PDI jest domena x-łącznika, ze szczególnym uwzględnieniem tryptofanu (Trp) w pozycji 364. Domena x zmienia swoją konformację w sposób, który powoduje ograniczenie przestrzenne regionu wiążącego substrat – utworzenie „kieszeni” z obszaru b i b’ na skutek zagięcia struktury PDI. Taki mechanizm może modyfikować swoistość wiązania substratu. Niewykluczone, że powoduje również przesunięcie domeny b’ względem a’, co wymusza zmiany przestrzenne w obrębie cząsteczki substratu [92].

Białkowa izomeraza disiarczkowa pełni funkcje białka chaperonowego zarówno względem białek mających wiązania disiarczkowe [63,95,101], jak i białek, które ich nie mają [15,74]. Aktywność nie ma związku z domenami katalitycznymi PDI, choć wymaga obecności pełnej, niezaburzonej struktury przestrzennej. Właściwości chaperonowe PDI wiążą się przede wszystkim z procesem składania białek i mogą być blokowane przez przyłączenie peptydu o niewielkich rozmiarach do regionu b’ lub usunięcie regionu C-końcowego wraz z fragmentem domeny a’ [65]. Aktywność chaperonowa PDI jest niezbędna w procesie rozpoznawania liganda i poprzedza wiązanie białek za pomocą mostków disiarczkowych. PDI wykazuje także aktywność antychaperonową, która w warunkach in vitro sprowadza się do rozerwania wiązań hydrofobowych wewnątrz substratu i ekspozycji grup hydrofobowych na zewnątrz cząsteczki substratu, co prowadzi do jego agregacji. Jednak w warunkach in vivo lub przy wysokim stężeniu PDI także in vitro, wyeksponowane grupy hydrofobowe są wiązane przez inne białka chaperonowe (lub przez samo PDI), uniemożliwiając agregację protein. Antychaperonowa aktywność PDI może więc nie mieć znaczenia z fizjologicznego punktu widzenia [29].

Mechanizm działania

Aktywność PDI jest związana z tworzeniem, redukcją i izomeryzacją wiązań disiarczkowych w białkach. Zasada funkcjonowania PDI jest zbliżona do sposobu funkcjonowania glutationu w utlenionej postaci, tzn. PDI w postaci utlenionej katalizuje przeniesienie wiązania disiarczkowego obecnego w jego własnej cząsteczce na cząsteczkę modyfikowanego białka, a tym samym przechodzi do stanu zredukowanego. PDI może przeprowadzać reakcje tworzenia mostków disiarczkowych na dwa sposoby: w wyniku cyklicznych reakcji utlenienia i redukcji oraz za pośrednictwem bezpośredniej izomeryzacji (ryc. 8). Reakcje katalizowane przez PDI najprawdopodobniej zależą od rodzaju substratu. Mechanizm cyklicznych reakcji utleniania i redukcji polega na redukcji pierwotnego wiązania disiarczkowego w substracie i powstania wolnych grup tiolowych, a następnie utworzenia nowego wiązania w innym miejscu. W przypadku reakcji izomeryzacji dochodzi do ataku nukleofilowego wolnej grupy tiolowej enzymu na mostek disiarczkowy substratu z utworzeniem przejściowego wiązania międzycząsteczkowego, które także podlega nukleofilowemu atakowi wolnej grupy tiolowej substratu z utworzeniem nowego mostka łączącego dwie cysteiny, z których tylko jedna tworzyła pierwotne wiązanie [29].

Aktywność PDI jest nierozerwalnie związana z białkiem Ero1 (endoplasmic reticulum oxidoreductin 1), które jest enzymem o właściwości oksydoreduktazy katalizującym reakcje izomeryzacji wiązań disiarczkowych w białkach siateczki śródplazmatycznej. U ssaków występuje dwóch przedstawicieli rodziny Ero1: Ero1α, który ulega ekspresji w odpowiedzi na hipoksję [26] i czynniki stresowe [50] oraz Ero1β ulegający ekspresji w sytuacji, gdy w ER dochodzi do akumulacji białek, których proces składania nie przebiegł do końca prawidłowo [61]. Ero1a wiąże się z cząsteczką PDI za pośrednictwem domeny b’ i przeprowadza reakcję utlenienia w obrębie domeny katalitycznej a’ [29].

Ero1α zawiera aż 15 podstawników cysteinowych konserwatywnych ewolucyjnie tworzących łącznie różne kombinacje mostków disiarczkowych: Cys-94-Cys-99, Cys-94-Cys-104, Cys-94-Cys-131, Cys-85-Cys391, Cys-394-Cys397, Cys-208-Cys241 [4]. Oprócz wiązań disiarczkowych peł- niących rolę strukturalną w cząsteczce Ero1α są obecne dwie pary cystein o charakterze katalitycznym: Cys- 352-Cys-355 w obrębie centrum aktywnego na obszarze rdzenia oraz Cys-100-Cys-105 umiejscowione w pętli zewnętrznej i nazywane cysteinami „komunikacji wahadłowej” (shuttle cysteins) [25].

Mechanizm przyłączenia Ero1 do PDI jest związany z przemieszczeniem obecnej w Ero1 struktury spinki do włosów typu β, bogatej w reszty alaniny i tryptofanu w kierunku aromatycznych podstawników domeny b’ PDI. Wiązanie Ero1 do PDI przypomina proces rozpoznawania i opłaszczania niezłożonych białek, a więc opiera się na właściwościach chaperonowych PDI. Skuteczność przyłączania Ero1 zależy nie od konformacji przestrzennej PDI, ale od stanu redoks białka i osiąga najwyższy poziom, gdy PDI jest w postaci zredukowanej. Utworzenie wiązań hydrofobowych między strukturą spinki typu β Ero1 a kieszenią wiążącą substraty PDI umożliwia kontakt między grupami tiolowymi PDI a disiarczkami obecnymi w zewnętrznej pętli Ero1 [51]. Zewnętrzna pętla Ero1 charakteryzuje się dużą ruchliwością i elastycznością, które umożliwiają jej pełnienie roli pośrednika między cząsteczką PDI a centrum katalitycznym Ero1. Mechanizm działania zewnętrznej pętli Ero1 przypomina nieco model funkcjonowania promu lub wahadłowca (stąd też nazwa „shuttle cysteins”) kursującego między jednym brzegiem a drugim. Centrum katalityczne Ero1 jest umiejscowione w regionie rdzeniowym białka, który cechuje się małą elastycznością i mobilnością, a więc cysteiny centrum katalitycznego nie mogą wchodzić w bezpośredni kontakt z PDI. Disiarczki znajdujące się w centrum aktywnym Ero1 przeprowadzają więc reakcję utleniania cystein pętli zewnętrznej, która następnie przemieszcza sie w kierunku domen a i a’ PDI. W następnym etapie disiarczki pętli zewnętrznej Ero1 katalizują utlenienie grup tiolowych PDI z utworzeniem mostka disiarczkowego w centrum aktywnym PDI. Ostatnim etapem procesu jest „powrót promu na pierwotny brzeg” – zewnętrzna pętla Ero1 zawierająca reszty cysteinowe, które uległy redukcji w wyniku utleniania PDI cofa się w stronę centrum aktywnego. Zredukowane disiarczki pętli zewnętrznej przenoszą elektrony na disiarczki centrum katalitycznego, które ulegają zależnemu od dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD) ponownemu utlenieniu. Procesowi towarzyszy przeniesienie elektronów na tlen cząsteczkowy i w rezultacie utworzenie nadtlenku wodoru [8,81]. Możliwe, że oprócz FAD występują także inne czynniki funkcjonujące jako akceptory elektronów w procesie reoksydacji Ero1 np. cytochrom C, cytochrom b5 [28] (ryc. 9).

Aktywność PDI, jak wspomniano wcześniej, wiąże się również z obecnością glutationu. Glutation w postaci zredukowanej współzawodniczy z wolnymi grupami tiolowymi białek, w tym także PDI, o utlenienie przeprowadzane prze Ero1, co może mieć bezpośrednie przełożenie na utrzymanie Ero1 w stanie zredukowanym. Ero1 w stanie zredukowanym nie może przeprowadzać procesu utlenienia PDI i tym samym glutation hamuje tworzenie wiązań disiarczkowych w białkach obecnych w ER [53]. Glutation w postaci utlenionej przeprowadza reakcję utlenienia PDI przez reakcję sieciowej izomeryzacji, której towarzyszy redukcja cząsteczki glutationu. Glutation funkcjonuje tak- że jak bufor stanu redoks PDI obecnego w ER, czyli jest swego rodzaju zapasem zarówno czynników redukujących jak utleniających, co pozwala komórkom na szybką reakcję w zależności od równowagi redoks w ER. Ze względu na niższe stężenie glutationu w przestrzeni zewnątrzkomórkowej w porównaniu do ER, jego rola jako buforu stanu redoks PDI poza komórką jest słabsza [29] (ryc. 10).

Rola pdi w aktywacji integryn

Aktywacja integryn reguluje wiele procesów, takich jak stany zapalne, hemostaza, adhezja, migracja, proliferacja komórek, angiogeneza i  przerzutowanie komórek nowotworowych. Molekularny mechanizm przejścia integryny w postać aktywną polega na zmianie struktury przestrzennej receptora prowadzącej do ekspozycji domeny wiążącej ligand. W ostatnim czasie pojawiło się coraz więcej dowodów potwierdzających rolę reorganizacji wiązań disiarczkowych w procesie aktywacji integryn. Cząsteczka integryny jest bogata w reszty cysteinowe tworzące mostki disiarczkowe, nadające im odpowiednią konformację. Powstawanie wiązań disiarczkowych, ich redukcja i izomeryzacja są katalizowane przez izomerazę disiarczkową (PDI). Proces agregacji płytek krwi jest przykładem udziału PDI w aktywacji integryn. W nieaktywnych płytkach krwi liczba cząsteczek PDI na ich powierzchni wynosi w przybliżeniu 2400 cząsteczek na płytkę. Natomiast w czasie aktywacji liczba ta wzrasta aż do 6500 kopii PDI na płytkę [11]. PDI występuje na powierzchni pochodzących z płytek krwi mikropęcherzyków, które są najliczniej występującymi mikropęcherzykami we krwi [66]. Sposób w jaki PDI unika retencji do wnętrza ER zależnej od sekwencji KDEL oraz jest transportowane na zewnątrz komórki i pozostaje przyłączone do błony komórkowej płytek krwi nie jest wyjaśniony. Prawdopodobnie PDI transportowane jest z ER na zewnątrz płytek w wyniku tworzenia pęcherzyków, a do błony komórkowej przytwierdza się na zasadzie oddziaływań elektrostatycznych [17].

Stosując przeciwciała anty-PDI wykryto, że blokowanie aktywności PDI powodowało hamowanie agregacji płytek krwi, w którą zaangażowana była integryna αIIbβ3 . Przeciwciała anty-PDI blokowały także niezależną od systemów przekazywania sygnału aktywację αIIbβ3 indukowaną przez jony Mn2+ [23]. PDI może być zaangażowane w drugą fazę agregacji płytek, która wymagałaby zmian konformacyjnych w obrębie integryn. Użycie bacytracyny, inhibitora PDI powodowało zahamowanie drugiego, nieodwracalnego etapu agregacji płytek, a jedynie w niewielkim stopniu zahamowanie pierwszego etapu [24]. Jednym z potencjalnych miejsc działania PDI w integrynie αIIbβ3, jest wiązanie Cys-663-Cys-687, które jest allosterycznym mostkiem disiarczkowym łatwo ulegającym przecięciu. Rozerwanie tego wiązania powoduje utrzymywanie integryny αIIbβ3 w stanie konstytutywnie aktywnym warunkującym konformację przestrzenną, która umożliwia wiązanie fibrynogenu [13]. Blokowanie aktywności PDI prowadzi także do zahamowania późniejszych etapów krzepnięcia: wytwarzania i akumulacji trombiny, która przekształca fibrynogen do fibryny tworzącej szkielet zakrzepu [18].

Innym przykładem potwierdzającym rolę PDI w aktywacji integryn są procesy zachodzące w komórkach śródbłonka naczyniowego. Ekspozycja komórek śródbłonka naczyniowego na działanie jonów Mn2+ nasila zjawiska adhezyjne. Jony Mn2+ indukują zwiększenie powinowactwa integryny αVβ3 do liganda, prawdopodobnie pod wpływem zwiększonej ekspresji grup tiolowych na powierzchni cząsteczki. Proces ten nie może być traktowany jako etap „aktywacji” integryny αVβ3 sensu stricte ponieważ obecność samych jonów Mn2+ nie może wymusić zmian konformacyjnych w kierunku utworzenia trwale aktywnej cząsteczki integryny [78]. Dodanie jonów Ca2+ do komórek traktowanych wcześniej Mn2+ zmniejsza zdolność integryny αVβ3 do wiązania fibrynogenu, a więc powoduje reakcję powrotu do stanu nieaktywnego [100]. Sytuacja wydaje się jeszcze bardziej skomplikowana, gdyż w przypadku integryny αIIbβ3 traktowanie komórek śródbłonka naczyniowego jonami Mn2+, powoduje jedynie niewielkie nasilenie adhezji, a więc integryny αVβ3 i αIIbβ3 muszą się różnić odpowiedzią na jony Mn2+. Istotne jest również to, że najmniejszym elementem integryny αIIbβ3 zdolnym do odpowiedzi na aktywację jonami wapnia jest region calf- 2 w podjednostce α, który nie zawiera żadnych potencjalnych miejsc wiązania jonów dwuwartościowych [47].

Jony Mn2+ inicjują tworzenie kompleksów między integryną αVβ3 oraz PDI. Kompleksy te są stosunkowo trwałe i ulegają dysocjacji dopiero po zajściu reakcji utleniania- -redukcji. Analizując procesy, w których inkubacja komórek śródbłonka naczyniowego z jonami Mn2+ bezpośrednio aktywuje integryny i to, że jony Mn2+ samodzielnie nie mogą inicjować wszystkich etapów aktywacji, ale indukują tworzenie kompleksów αVβ3 z PDI otrzymamy wyraźne potwierdzenie teorii, że to właśnie PDI pełni główną rolę w mechanizmie aktywacji integryn zależnym od reorganizacji wiązań disiarczkowych. [77,78].

W przypadku płytek krwi PDI tworzy kompleksy z integryną αIIbβ3 oraz białkiem Ero1α, które funkcjonuje jako elementarny czynnik przeprowadzający PDI ze stanu nieaktywnego do aktywnego na zasadzie reakcji utleniania- -redukcji. PDI, αIIbβ3 oraz Ero1α tworzą kompleksy zarówno kowalencyjnie, jak i niekowalencyjnie związane, a przy tym cechujące się różną wielkością, bo wahającą się w granicach 250-300 kDa. Różna wielkość kompleksów PDI i Ero1α może obrazować różne etapy wiązania tych dwóch białek i byłaby kolejnym dowodem na ich wspólną interakcję na powierzchni płytek krwi [77]. Oddziaływanie między integryną, PDI i Ero1 na powierzchni komórek może być jednym z mechanizmów aktywacji integryn.

W ciągu ostatnich lat obserwuje się szybki postęp w poznaniu i zrozumieniu struktury i funkcji integryn, co doprowadziło do wykrycia nowych terapeutycznych związków przeciwdziałających procesom zakrzepowym i zapalnym. Poznanie mechanizmu aktywacji integryn jest istotne ze względu na poszukiwanie nowych terapii w przypadku zawałów serca, zatorów żylnych czy przerzutowania nowotworów. Integryny są jedynymi receptorami niekonstytutywnie aktywnymi. Aktywacja integryn prowadzi do zmian konformacyjnych w obrębie ich cząsteczki, co umożliwia wiązanie liganda. Podczas reakcji ligand-receptor, integryny funkcjonują jako allosteryczny receptor zdolny do przejścia ze stanu o niewielkim do stanu o dużym powinowactwie do liganda. Przejściu towarzyszą zmiany konformacyjne receptora. Ostatnie lata dostarczyły przekonują.

Przypisy

• 1. Adair B.D., Yeager M.: Three-dimensional model of the humanplatelet integrin αIIbβ3 based on electron cryomicroscopy and x-raycrystallography. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002; 99: 14059-14064
  Google Scholar
• 2. Anderson M.E., Meister A.: Dynamic state of glutathione in bloodplasma. J. Biol. Chem., 1980; 255: 9530-9533
  Google Scholar
• 3. Andersson A., Isaksson A., Brattström L., Hultberg B.: Homocysteineand other thiols determined in plasma by HPLC and thiolspecificpostcolumn derivatization. Clin. Chem., 1993; 39: 1590-1597
  Google Scholar
• 4. Appenzeller-Herzog C., Riemer J., Christensen B., Sorensen E.S.,Ellgaard L.: A novel disulphide switch mechanism in Ero1α balancesER oxidation in human cells. EMBO J., 2008; 27: 2977-2987
  Google Scholar
• 5. Aszodi A., Hunziker E.B., Brakebusch C., Fässler R.: β1 integrinsregulate chondrocyte rotation, G1 progression, and cytokinesis.Genes Dev., 2003; 17: 2465-2479
  Google Scholar
• 6. Baciu P.C., Suleiman E.A., Deryugina E.I, Strongin A.Y.: Membranetype-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) processing of pro-αv integrin regulates cross-talk between αvβ3 and α2β1 integrins inbreast carcinoma cells. Exp. Cell Res., 2003; 291: 167-175
  Google Scholar
• 7. Beglova N., Blacklow S.C., Takagi J., Springer T.A.: Cysteine-richmodule structure reveals a fulcrum for integrin rearrangement uponactivation. Nat. Struct. Biol., 2002; 9: 282-287
  Google Scholar
• 8. Benham A.M., Cabibbo A., Fassio A., Bulleid N., Sitia R., BraakmanI.: The CXXCXXC motif determines the folding, structure and stabilityof human Ero1-Lα. EMBO J., 2000; 19: 4493-4502
  Google Scholar
• 9. Bennett T.A., Edwards B.S., Sklar L.A., Rogelj S.: Sulfhydryl regulationof L-selectin shedding: phenylarsine oxide promotes activation-independentL-selectin shedding from leukocytes. J. Immunol.,2000; 164: 4120-4129
  Google Scholar
• 10. Bi S., Hong P.W., Lee B., Baum L.G.: Galectin-9 binding to cellsurface protein disulfide isomerase regulates the redox environmentto enhance T-cell migration and HIV entry. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 2011; 108: 10650-10655
  Google Scholar
• 11. Burgess J.K., Hotchkiss K.A., Suter C., Dudman N.P., SzöllösiJ., Chesterman C.N., Chong B.H., Hogg P.J.: Physical proximity andfunctional association of glycoprotein 1bα and protein-disulfideisomerase on the platelet plasma membrane. J. Biol. Chem., 2000;275: 9758-9766
  Google Scholar
• 12. Burke R.D.: Invertebrate integrins: structure, function and evolution.Int. Rev.Cytol., 1999; 191: 257-284
  Google Scholar
• 13. Butta N., Arias-Salgado E.G., González-Manchón C., Ferrer M.,Larrucea S., Ayuso M.S., Parrilla R.: Disruption of the β3 663-687 disulfidebridge confers constitutive activity to β3 integrins. Blood,2003; 102: 2491-2497
  Google Scholar
• 14. Cabrera M., Muñiz M., Hidalgo J., Vega L., Martín M.E., VelascoA.: The retrieval function of the KDEL receptor requires PKA phosphorylationof its C-terminus. Mol. Biol. Cell, 2003; 14: 4114-4125
  Google Scholar
• 15. Cai H., Wang C.C., and Tsou C.L.: Chaperone-like activity of proteindisulfide isomerase in the refolding of a protein with no disulfidebonds. J. Biol. Chem., 1994; 269: 24550-24552
  Google Scholar
• 16. Calvete J.J., Henschen A., González-Rodríguez J.: Complete localizationof the intrachain disulphide bonds and the N-glycosylationpoints in the alpha-subunit of human platelet glycoprotein IIb. Biochem.J., 1989; 261: 561-568
  Google Scholar
• 17. Chen K., Detwiler T.C., Essex D.W.: Characterization of proteindisulphide isomerase released from activated platelets. Br. J. Haematol.,1995; 90: 425-431
  Google Scholar
• 18. Cho J., Furie B.C., Coughlin S.R., Furie B.: A critical role for extracellularprotein disulfide isomerase during thrombus formationin mice. J. Clin. Invest., 2008; 118: 1123-1131
  Google Scholar
• 19. Dyson H.J., Jeng M.F., Tennant L.L., Slaby I., Lindell M., Cui D.S.,Kuprin S., Holmgren A.: Effects of buried charged groups on cysteinethiol ionization and reactivity in Escherichia coli thioredoxin:structural and functional characterization of mutants of Asp26 andLys57. Biochemistry, 1997; 36: 2622-2636
  Google Scholar
• 20. Eliceiri B.P., Klemke R., Stromblad S., Cheresh D.A.: Integrin αVβ3requirement for sustained mitogen-activated protein kinase activityduring angiogenesis. J. Cell Biol., 1998; 140: 1255-1263
  Google Scholar
• 21. Emsley J., Knight C.G., Farndale R.W., Barnes M.J., LiddingtonR.C:. Structural basis of collagen recognition by integrin α2β1. Cell,2000; 101: 47-56
  Google Scholar
• 22. Essex, D.W.: Redox control of platelet function. Antioxid. RedoxSignal., 2009; 11: 1191-1225
  Google Scholar
• 23. Essex D.W., Chen K., Swiatkowska M.: Localization of proteindisulfide isomerase to the external surface of the platelet plasmamembrane. Blood, 1995; 86: 2168-2173
  Google Scholar
• 24. Essex D.W., Li M.: Protein disulphide isomerase mediates plateletaggregation and secretion. Br. J. Haematol., 1999; 104: 448-454
  Google Scholar
• 25. Frand A.R., Kaiser C.A.: Two pairs of conserved cysteines are requiredfor the oxidative activity of Ero1p in protein disulfide bond formationin the endoplasmic reticulum. Mol. Biol. Cell, 2000; 11: 2833-2843
  Google Scholar
• 26. Gess B., Hofbauer K.H., Wenger R.H., Lohaus C., Meyer H.E.,Kurtz A.: The cellular oxygen tension regulates expression of theendoplasmic reticulum oxidoreductase ERO1-Lα. Eur. J. Biochem.,2003; 270: 2228-2235
  Google Scholar
• 27. Goldberger R.F., Epstein C.J., Anfinsen C.B.: Acceleration of reactivationof reduced bovine pancreatic ribonuclease by a microsomalsystem from rat liver. J. Biol. Chem., 1963; 238: 628-635
  Google Scholar
• 28. Gross E., Sevier C.S., Heldman N., Vitu E., Bentzur M., KaiserC.A., Thorpe C., Fass D.: Generating disulfides enzymatically: reactionproducts and electron acceptors of the endoplasmic reticulumthiol oxidase Ero1p. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006; 103: 299-304
  Google Scholar
• 29. Hatahet F., Ruddock L.W.: Protein disulfide isomerase: a criticalevaluation of its function in disulfide bond formation. Antioxid.Redox Signal., 2009; 11: 2807-2850
  Google Scholar
• 30. Humphries M.J.: Integrin structure. Biochem. Soc. Trans., 2000;28: 311-339
  Google Scholar
• 31. Hynes R.O.: Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines.Cell, 2002; 110: 673-687
  Google Scholar
• 32. Hynes R.O., Zhao Q.: The evolution of cell adhesion. J. Cell Biol.,2000; 150: F89-F96
  Google Scholar
• 33. Kamata T., Ambo H., Puzon-McLaughlin W., Tieu K.K., Handa M.,Ikeda Y., Takada Y.: Critical cysteine residues for regulation of integrinαIIbβ3 are clustered in the epidermal growth factor domainsof the β3 subunit. Biochem. J., 2004; 378: 1079-1082
  Google Scholar
• 34. Kamata T., Handa M., Sato Y., Ikeda Y., Aiso S.: Membrane-proximalα/β stalk interactions differentially regulate integrin activation.J. Biol. Chem., 2005; 280: 24775-24783
  Google Scholar
• 35. Kiema, T., Lad Y., Jiang P., Oxley C.L., Baldassarre M., WegenerK.L., Campbell I.D., Ylanne J., Calderwood D.A.: The molecular basisof filamin binding to integrins and competition with talin. Mol.Cell, 2006; 21: 337-347
  Google Scholar
• 36. Klappa P., Hawkins H.C., Freedman R.B.: Interactions betweenprotein disulphide isomerase and peptides. Eur. J. Biochem., 1997;248: 37-42
  Google Scholar
• 37. Klappa P., Koivunen P., Pirneskoski A., Karvonen P., RuddockL.W., Kivirikko K.I., Freedman R.B.: Mutations that destabilize thea’ domain of human protein-disulfide isomerase indirectly affectpeptide binding. J. Biol. Chem., 2000; 275: 13213-13218
  Google Scholar
• 38. Klappa P., Ruddock L.W., Darby N.J., Freedman R.B.: The b’ domainprovides the principal peptide-binding site of protein disulfideisomerase but all domains contribute to binding of misfoldedproteins. EMBO J., 1998; 17: 927-935
  Google Scholar
• 39. Koivunen P., Pirneskoski A., Karvonen P., Ljung J., Helaakoski T.,Notbohm H., Kivirikko K.I.: The acidic C-terminal domain of proteindisulfide isomerase is not critical for the enzyme subunit functionor for the chaperone or disulfide isomerase activities of the polypeptide.EMBO J., 1999; 18: 65-74
  Google Scholar
• 40. Kortemme T., Creighton T.E.: Ionisation of cysteine residues atthe termini of model α-helical peptides: relevance to unusual thiolpKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol., 1995;253: 799-812
  Google Scholar
• 41. Kortemme T., Darby N.J., Creighton T.E.: Electrostatic interactionsin the active site of the N-terminal thioredoxin-like domainof protein disulfide isomerase. Biochemistry, 1996; 35: 14503-14511
  Google Scholar
• 42. Kozlov G., Määttänen P., Thomas D.Y., Gehring K.: A structuraloverview of the PDI family of proteins. FEBS J., 2010; 277: 3924-3936
  Google Scholar
• 43. Lappi A.K., Lensink M.F., Alanen H.I., Salo K.E., Lobell M., Juffer A.H.,Ruddock L.W.: A conserved arginine plays a role in the catalytic cycleof the protein disulphide isomerases. J. Mol. Biol., 2004; 335: 283-295
  Google Scholar
• 44. Laurindo F.R., Pescatore L.A., Fernandes D.C.: Protein disulfideisomerase in redox cell signaling and homeostasis. Free Radic. Biol.Med., 2012; 52: 1954-1966
  Google Scholar
• 45. Lee J.O., Rieu P., Arnaout M.A., Liddington R.: Crystal structureof the A domain from the α subunit of integrin CR3 (CD11b/CD18).Cell, 1995; 80: 631-638
  Google Scholar
• 46. Lissitzky J.C., Luis J., Munzer J.S., Benjannet S., Parat F., ChrétienM., Marvaldi J., Seidah N.G.: Endoproteolytic processing of integrinpro-α subunits involves the redundant function of furin and proproteinconvertase (PC) 5A, but not paired basic amino acid convertingenzyme (PACE) 4, PC5B or PC7. Biochem. J., 2000; 346: 133-138
  Google Scholar
• 47. Loftus J.C., Liddington R.C.: Cell adhesion in vascular biology.New insights into integrin-ligand interaction. J. Clin. Invest., 1997;99: 2302-2306
  Google Scholar
• 48. Luo B.H., Carman C.V., Springer T.A.: Structural basis of integrinregulation and signaling. Annu. Rev. Immunol., 2007; 25: 619-647
  Google Scholar
• 49. Mansoor M.A., Svardal A.M., Ueland P.M.: Determination of thein vivo redox status of cysteine, cysteinylglycine, homocysteine, andglutathione in human plasma. Anal. Biochem., 1992; 200: 218-229
  Google Scholar
• 50. Marciniak S.J., Yun C.Y., Oyadomari S., Novoa I., Zhang Y., JungreisR., Nagata K., Harding H.P., Ron D.: CHOP induces death by promoting protein synthesis and oxidation in the stressed endoplasmicreticulum. Genes Dev., 2004; 18: 3066-3077
  Google Scholar
• 51. Masui, S., Vavassori, S., Fagioli, C., Sitia, R., Inaba K.: Molecularbases of cyclic and specific disulfide interchange between humanERO1α protein and protein-disulfide isomerase (PDI). J. Biol. Chem.,2011; 286: 16261-16271
  Google Scholar
• 52. Meister A.: A glutathione metabolism. Methods Enzymol., 199339: 1590-1597
  Google Scholar
• 53. Molteni S.N., Fassio A., Ciriolo M.R., Filomeni G., Pasqualetto E.,Fagioli C., Sitia R.: Glutathione limits Ero1-dependent oxidation inthe endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem., 2004; 279: 32667-32673
  Google Scholar
• 54. Mor-Cohen R., Rosenberg N., Einav Y., Zelzion E., Landau M.,Mansour W., Averbukh Y., Seligsohn U.: Unique disulfide bonds inepidermal growth factor (EGF) domains of β3 affect structure andfunction of αIIbβ3 and αvβ3 integrins in different manner. J. Biol.Chem., 2012; 287: 8879-8891
  Google Scholar
• 55. Mor-Cohen R., Rosenberg N., Landau M., Lahav J., Seligsohn U.:Specific cysteines in β3 are involved in disulfide bond exchangedependentand -independent activation of αIIbβ3. J. Biol. Chem.,2008; 283: 19235-19244
  Google Scholar
• 56. Mould A.P., Akiyama S.K., Humphries M.J.: Regulation of integrinα5β1-fibronectin interactions by divalent cations. Evidence for distinctclasses of binding sites for Mn2+, Mg2+, and Ca2+. J. Biol. Chem.,1995; 270: 26270-26277
  Google Scholar
• 57. Mould A.P., Barton S.J., Askari J.A., Craig S.E., Humphries M.J.:Role of ADMIDAS cation-binding site in ligand recognition by integrinα5β1. J. Biol. Chem., 2003; 278: 51622-51629
  Google Scholar
• 58. Mould A.P., Humphries M.J.: Regulation of integrin functionthrough conformational complexity: not simply a knee-jerk reaction?Curr. Opin. Cell Biol., 2004; 16: 544-551
  Google Scholar
• 59. Noiva R., Freedman R.B., Lennarz W.J.: Peptide binding to proteindisulfide isomerase occurs at a site distinct from the active sites. J.Biol. Chem., 1993; 268: 19210-19217
  Google Scholar
• 60. O’Neill S., Robinson A., Deering A., Ryan M., Fitzgerald D.J., MoranN.: The platelet integrin αIIbβ3 has an endogenous thiol isomeraseactivity. J. Biol. Chem., 2000; 275: 36984-36990
  Google Scholar
• 61. Pagani M., Fabbri M., Benedetti C., Fassio A., Pilati S., BulliedN.J., Cabibbo A., Sitia R.: Endoplasmic reticulum oxidoreductin 1-Lβ(ERO1-Lβ), a human gene induced in the course of the unfolded proteinresponse. J. Biol. Chem., 2000; 275: 23685-23692
  Google Scholar
• 62. Plow E.F., Haas T.A., Zhang L., Loftus J., Smith J.W.: Ligand bindingto integrins. J. Biol. Chem., 2000; 275: 21785-21788
  Google Scholar
• 63. Puig A., Gilbert H.F.: Protein disulfide isomerase activity exhibitschaperone and anti-chaperone activity in the oxidative refolding oflysozyme. J. Biol. Chem., 1994; 269: 7764-7771
  Google Scholar
• 64. Qi Y., Grishin N.V.: Structural classification of thioredoxin-likefold proteins. Proteins, 2005; 58: 376-388
  Google Scholar
• 65. Quan H., Fan G., Wang C.C.: Independence of the chaperone activityof protein disulfide isomerase from its thioredoxin-like activesite. J. Biol. Chem., 1995; 270: 17078-17080
  Google Scholar
• 66. Raturi A., Miersch S., Hudson J.W., Mutus B.: Platelet microparticleassociatedprotein disulfide isomerase promotes platelet aggregationand inactivates insulin. Biochim. Biophys. Acta, 2008; 1778: 2790-2796
  Google Scholar
• 67. Rigobello M.P., Donella-Deana A., Cesaro L., Bindoli A.: Distributionof protein disulphide isomerase in rat liver mitochondria.Biochem. J., 2001; 356: 567-570
  Google Scholar
• 68. Ruiz C., Liu C.Y., Sun Q.H., Sigaud-Fiks M., Fressinaud E., MullerJ.Y., Nurden P., Nurden A.T., Newman P.J., Valentin N.: A point mutationin the cysteine-rich domain of glycoprotein (GP) IIIa resultsin the expression of a GPIIb-IIIa (αIIbβ3) integrin receptor locked ina high-affinity state and a Glanzmann thrombasthenia-like phenotype.Blood, 2001; 98: 2432-2441
  Google Scholar
• 69. Schwander M., Leu M., Stumm M., Dorchies O.M., Ruegg U.T.,Schittny J., Müller U.: β1 integrins regulate myoblast fusion andsarcomere assembly. Dev. Cell, 2003; 4: 673-685
  Google Scholar
• 70. Schwartz M.A., Schaller M.D., Ginsberg M.H.: Integrins: emergingparadigms of signal transduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol.,1995; 11: 549-599
  Google Scholar
• 71. Shi M., Sundramurthy K., Liu B., Tan S.M., Law S.K., Lescar J.:The crystal structure of the plexin-semaphorin-integrin domain/hybrid domain/I-EGF1 segment from the human integrin β2 subunitat 1.8-A resolution. J. Biol. Chem., 2005; 280: 30586-30593
  Google Scholar
• 72. Shimaoka M., Xiao T., Liu J.H., Yang Y., Dong Y., Jun C.D., McCormackA., Zhang R., Joachimiak A., Takagi J., Wang J.H., SpringerT.A: Structures of the αL I domain and its complex with ICAM-1reveal a shape-shifting pathway for integrin regulation. Cell, 2003;112: 99-111
  Google Scholar
• 73. Smagghe B.J., Huang P.S., Ban Y.E., Baker D., Springer T.A.: Modulationof integrin activation by an entropic spring in the β-knee. J.Biol. Chem., 2010; 285: 32954-32966
  Google Scholar
• 74. Song J.L.,Wang C.C.: Chaperone-like activity of protein disulfide-isomerasein the refolding of rhodanese. Eur. J. Biochem., 1995;231: 312-316
  Google Scholar
• 75. Springer T.A., Dustin M.L.: Integrin inside-out signaling andthe immunological synapse. Curr. Opin. Cell Biol., 2012; 24: 107-115
  Google Scholar
• 76. Stewart P.L., Nemerow G.R.: Cell integrins: commonly used receptorsfor diverse viral pathogens. Trends Microbiol., 2007; 15: 500-507
  Google Scholar
• 77. Swiatkowska M., Padula G., Michalec L., Stasiak M., SkurzynskiS., Cierniewski C.S.: Ero1α is expressed on blood platelets in associationwith protein-disulfide isomerase and contributes to redoxcontrolledremodeling of αIIbβ3. J. Biol. Chem., 2010; 285: 29874-29883
  Google Scholar
• 78. Swiatkowska M., Szymański J., Padula G., Cierniewski C.S.: Interactionand functional association of protein disulfide isomerasewith αVβ3 integrin on endothelial cells. FEBS J., 2008; 275: 1813-1823
  Google Scholar
• 79. Takada Y., Ye X., Simon S.: The integrins. Genome Biol., 2007;8: 215
  Google Scholar
• 80. Takagi J., Beglova N., Yalamanchili P., Blacklow S.C., SpringerT.A.: Definition of EGF-like, closely interacting modules that bearactivation epitopes in integrin β subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2001; 98: 11175-11180
  Google Scholar
• 81. Tavender T.J., Bulleid N.J.: Molecular mechanisms regulatingoxidative activity of the Ero1 family in the endoplasmic reticulum.Antioxid. Redox Signal., 2010; 13: 1177-1187
  Google Scholar
• 82. Tu Y., Wu S., Shi X., Chen K., Wu C.: Migfilin and Mig-2 link focaladhesions to filamin and the actin cytoskeleton and function incell shape modulation. Cell, 2003; 113: 37-47
  Google Scholar
• 83. Turano C., Coppari S., Altieri, F., Ferraro A.: Proteins of the PDIfamily: unpredicted non-ER locations and functions. J. Cell. Physiol.,2002; 193: 154-163
  Google Scholar
• 84. Ueland P.M., Mansoor M.A., Guttormsen A.B., Müller F., AukrustP., Refsum H., Svardal A.M.: Reduced, oxidized and protein-boundforms of homocysteine and other aminothiols in plasma comprisethe redox thiol status a possible element of the extracellular antioxidantdefense system. J. Nutr., 1996; 126: 1281S-1294S
  Google Scholar
• 85. Venetianer P. Straub F.B.: Enzymic formation of the disulfidebridges of ribonuclease. Acta Physiol. Acad. Sci. Hung., 1963; 24:41-53
  Google Scholar
• 86. Vinogradova O., Haas T., Plow E.F., Qin J.: A structural basis forintegrin activation by the cytoplasmic tail of the αIIb-subunit. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 2000; 97: 1450-1455
  Google Scholar
• 87. Vinogradova O., Vaynberg J., Kong X., Haas T.A., Plow E.F., QinJ.: Membrane-mediated structural transitions at the cytoplasmicface during integrin activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004;101: 4094-4099
  Google Scholar
• 88. Vorup-Jensen T., Ostermeier C., Shimaoka M., Hommel U.,Springer T.A.: Structure and allosteric regulation of the αXβ2 integrinI domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: 1873-1878
  Google Scholar
• 89. Vorup-Jensen T., Waldron T.T., Astrof N., Shimaoka M., SpringerT.A.: The connection between metal ion affinity and ligand affinityin integrin I domains. Biochim. Biophys. Acta, 2007; 1774: 1148-1155
  Google Scholar
• 90. Walker K.W., Gilbert H.F.: Scanning and escape during proteindisulfideisomerase assisted protein folding. J. Biol. Chem., 1997;272: 8845-8848
  Google Scholar
• 91. Wan S.W., Lin C.F., Lu Y.T., Lei H.Y., Anderson R., Lin Y.S.: Endothelialcell surface expression of protein disulfide isomerase activatesβ1 and β3 integrins and facilitates dengue virus infection. J.Cell. Biochem., 2012; 113: 1681-1691
  Google Scholar
• 92. Wang L., Wang L., Vavassori S., Li S., Ke H., Anelli T., Degano M.,Ronzoni R., Sitia R., Sun F., Wang C.C.: Crystal structure of humanERp44 shows a dynamic functional modulation by its carboxy-terminaltail. EMBO Rep., 2008; 9: 642-647
  Google Scholar
• 93. Wilkinson B., Gilbert H.F.: Protein disulfide isomerase. Biochim.Biophys. Acta, 2004; 1699: 35-44
  Google Scholar
• 94. Willems S.H., Tape C. J., Stanley P.L., Taylor N. A., Mills I.G., NealD.E., McCafferty J., Murphy G.: Thiol isomerases negatively regulatethe cellular shedding activity of ADAM17. Biochem. J., 2010;428: 439-450
  Google Scholar
• 95. Winter J., Klappa P., Freedman R.B., Lilie H., Rudolph R.: Catalyticactivity and chaperone function of human protein-disulfideisomerase are required for the efficient refolding of proinsulin. J.Biol. Chem., 2002; 277: 310-317
  Google Scholar
• 96. Xie L., Chesterman C.N., Hogg P.J.: Reduction of von Willebrandfactor by endothelial cells. J. Thromb. Haemost., 2000; 84: 506-513
  Google Scholar
• 97. Xiong J.P., Mahalingham B., Alonso J.L., Borrelli L.A., Rui X.,Anand S., Hyman B.T., Rysiok T., Müller-Pompalla D., GoodmanS.L., Arnaout M.A.: Crystal structure of the complete integrin αVβ3ectodomain plus an α/β transmembrane fragment. J. Cell Biol., 2009;186: 589-600
  Google Scholar
• 98. Xiong J.P., Stehle T., Goodman S.L., Arnaout M.A.: A novel adaptationof the integrin PSI domain revealed from its crystal structure.J. Biol. Chem., 2004; 279: 40252-40254
  Google Scholar
• 99. Xiong J.P., Stehle T., Zhang R., Joachimiak A., Frech M., GoodmanS.L., Arnaout M.A.: Crystal structure of the extracellular segmentof integrin αVβ3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. Science,2002; 296: 151-155
  Google Scholar
• 100. Yan B., Hu D.D., Knowles S.K., Smith J.W.: Probing chemical andconformational differences in the resting and active conformers ofplatelet integrin αIIbβ3. J. Biol. Chem., 2000; 275: 7249-7260
  Google Scholar
• 101. Yao Y., Zhou Y.C., Wang C.: Both the isomerase and chaperoneactivities of protein disulfide isomerase are required for the reactivationof reduced and denatured acidic phospholipase A2. EMBOJ., 1997; 16: 651-658
  Google Scholar
• 102. Ye F., Hu G., Taylor D., Ratnikov B., Bobkov A.A., McLean M.A,.Sligar S.G., Taylor K.A., Ginsberg M.H.: Recreation of the terminalevents in physiological integrin activation. J. Cell Biol., 2010; 188:157-173
  Google Scholar

Pełna treść artykułu