Rola nowotworowych komórek macierzystych w patogenezie raka jelita grubego
Magdalena Szaryńska 1 , Agata Olejniczak 1 , Zbigniew Kmieć 1Abstrakt
Rak jelita grubego jest bardzo poważnym problem klinicznym ze względu na wciąż rosnącą liczbę zachorowań, jak i ze względu na trudności w leczeniu pacjentów, szczególnie jeśli choroba jest już w stadium zaawansowanym. W pracy kompleksowo omówiono problemy związane z podłożem molekularnym rozwoju raka jelita grubego, a zwłaszcza z pojawieniem się nowotworowych komórek macierzystych w obrębie nabłonka jelita i mechanizmami ich proliferacji. Wykazano, że nowotworowe komórki macierzyste są w znacznej mierze odpowiedzialne za rozwój oporności na leczenie i tworzenie przerzutów. Omówiono też rolę niszy nowotworowych komórek macierzystych w progresji raka jelita grubego. Dokładne poznanie mechanizmów transformacji nowotworowej oraz biologii nowotworowych komórek macierzystych może się przyczynić do wcześniejszego wykrywania raka jelita grubego oraz rozwoju skuteczniejszych terapii.
Wprowadzenie
Mimo ogromnego postępu, jaki się dokonał w medycynie w ostatnich latach, choroby nowotworowe wciąż pozostają główną przyczyną zgonów. Wśród nich wysoką pozycję zajmuje rak jelita grubego (RJG). Nowotwory jelita grubego są trzecim najczęściej występującym na świecie nowotworem u mężczyzn (10%) i drugim u kobiet (9%). Dla Polski dane statystyczne wynoszą odpowiednio 12 i 10% zachorowań. Zachorowania występują prawie dwukrotnie częściej w populacji mężczyzn niż kobiet. Większość zachorowań na nowotwory złośliwe jelita grubego występuje po 50 roku życia (94%). Przeżycia 5-letnie wśród pacjentów z nowotworami jelita grubego w ciągu pierwszej dekady XXI w. nieznacznie wzrosły: u mężczyzn: z 43,3 do 47,6%, natomiast u kobiet: z 44,1 do 49,1% (Krajowy Rejestr Nowotworów, Polska Unia Onkologii).
Uważa się, że czas rozwoju RJG od zapoczątkowania procesu nowotworowego do wystąpienia klinicznych objawów wynosi od kilku do kilkudziesięciu lat [48]. Wśród czynników sprzyjających powstaniu i rozwojowi raka jelita grubego należy wymienić przede wszystkim niewłaściwą dietę, niewielką aktywność fizyczną, chroniczne stany zapalne oraz czynniki genetyczne [46,80]. Na podstawie badań genetycznych, obserwacji makroskopowych oraz mikroskopowych w 1990 r. przedstawiono hipotezę wyjaśniającą procesy rozwoju nowotworu złośliwego z gruczolaka jelita („adenoma- -carcinoma sequence”) [33]. Tysiące badań przeprowadzonych w następnych latach potwierdziły słuszność tego tzw. „kanonicznego szlaku” powstawania RJG dla ponad 70% przypadków. Dokładne określenie zmian leżących u podstawy patogenezy RJG u konkretnego pacjenta jest bardzo ważne, ponieważ rzutuje to na późniejsze decyzje dotyczące zastosowanej terapii [14].
Uważa się, że rozwój RJG (ryc. 1) zaczyna się od pojawienia w nabłonku jelita małego ogniska dysplastycznego i jego stopniowej przemiany i wzrostu do raka inwazyjnego przez fazę gruczolaka. Dysplazja obejmuje zmiany ograniczone jedynie do warstwy nabłonkowej, która nie przekracza bariery błony podstawnej. Zmiany dotyczą morfologii enterocytów oraz zaburzeń w architekturze tkanki, wskazując na postępupostępujący proces przemiany nowotworowej. W zależności od zaawansowania zmian dysplazja klasyfikowana jest jako lekka, średnia lub ciężka. Im wyższy stopień dysplazji, tym większe prawdopodobieństwo jej przejścia w raka. Dysplazja ciężka jest uznawana za zmianę przedrakową i wymaga dalszej diagnostyki, kontroli i ewentualnego leczenia. Procesy powstawania gruczolaka i dalszej progresji choroby są następstwem skumulowania wielu genetycznych i epigenetycznych aberracji potrzebnych do tego, aby prawidłowe komórki organizmu uległy przemianie do nowotworowych komórek macierzystych. Zaburzenia dotyczą zarówno onkogenów (K-RAS, C-MYC), jak i genów supresorowych (APC, DCC, P53) i, co najważniejsze, zmiany w wielu genach są niezbędne do tego, by wywołać transformację nowotworową. Te charakterystyczne mutacje wywołują niestabilność genomu, czego następstwem jest zmiana liczby chromosomów i/lub zmiany w ich strukturze [14]. W wyniku nawarstwiających się mutacji dochodzi do selekcji klonów komórkowych, w których jest zaburzona prawidłowa kontrola cyklu komórkowego, proliferacji i różnicowania. Komórki są zdolne do niekontrolowanych podziałów i uniezależniają się od mechanizmów indukujących apoptozę, co stanowi jeden z mechanizmów unikania ich eliminacji przez układ odpornościowy [40].
Należy jednak podkreślić, że około 15% przypadków RJG rozwija się według innego szlaku molekularnego. Rak rozwija się najczęściej ze zmian pojawiających się w odcinku proksymalnym jelita grubego. W nabłonku tych okolic stwierdza się zmieniony wzór metylacji wysp CpG oraz mutacje onkogenu BRAF [11]. Ostatnią grupą przypadków są dziedziczne postaci RJG, które stanowią 3-5% wszystkich zachorowań [14]. Wrodzony rak jelita grubego występuje w dwóch postaciach [2,5]. Jedna jest związana z mutacją w genie białka z kompleksu degradującego β-kateninę – APC (FAP – Familiar Adenomatous Polyposis), a u podstawy drugiej leżą niewydajne mechanizmy naprawy uszkodzeń DNA wywołane mutacją w genach białek Mis-mach Repair (MMR) (HNPCC/ Lynch Syndrom – Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer). Oprócz wymienionych, opisano występowanie rodzinnej postaci raka jelita grubego, lecz nie zidentyfikowano w nich żadnej konkretnej mutacji leżącej u podłoża rozwoju choroby [14,56].
Nowotworowe komórki macierzyste
Dla wielu typów nowotworów wykazano, że rozwijają się z komórek o cechach przypominających komórki macierzyste pluripotencjalne [83] określane jako „nowotworowe komórki macierzyste” (NKM) (cancer stem cells, CSCs lub tumor initiating cells, TICs) [77,78,83]. Pojawienie się pierwszej komórki nowotworowej tłumaczy teoria somatycznych mutacji, według której w ciągu swojego życia komórka akumuluje mutacje i staje się komórką nowotworową, gdy osiągnie zdolność do niekontrolowanych podziałów. Hanahan i Weinberg [40] opisali zmiany, które zachodzą w czasie rozwoju nowotworu: nabycie zdolności do nieograniczonej proliferacji niezależnej od obecności czynników wzrostowych, oporności na czynniki hamujące wzrost i podziały, oporności na czynniki proapoptotyczne, zdolności do indukcji angiogenezy, do inwazji i przerzutowania. W procesie transformacji nowotworowej komórek zachodzą również zmiany w ich metabolizmie energetycznym (przełączenie na metabolizm beztlenowy) – tzw. efekt Warburga [63] oraz wykształcenie zdolności ucieczki przed aktywnością komórek układu odpornościowego, tzw. immune evasion [70]. NKM wykształcają także mechanizmy chroniące je przed działaniem chemioterapeutyków, m.in. przez indukowanie ekspresji w błonie komórkowej dużej liczby transporterów z rodziny ABC. Wspomniane przemiany komórek prawidłowych w kierunku fenotypu NKM mogą być indukowane i podtrzymywane przez ich mikrośrodowisko. Wykazano, że warunki mikrośrodowiska podtrzymującego samoodnawiające się prawidłowe komórki macierzyste nabłonka jelitowego, są takie same dla nowotworowych komórek macierzystych [59,83].
Stwierdzono, że NKM są odpowiedzialne za oporność guza na leczenia, mimo że stanowią zaledwie 2,5% masy guza RJG. Wiadomo, że zaledwie 1 komórka na 262 ma właściwości NKM [31,68,78]. Mimo że ponad 75% pacjentów udaje się wyleczyć dzięki zastosowaniu konwencjonalnej terapii, to wciąż u około 30% z nich ponownie rozwijają się dysplastyczne polipy w ścianie jelita grubego odpowiedzialne za progresję choroby nowotworowej [82]. Za to zjawisko odpowiedzialne są NKM, które są zdolne zarówno do migracji i tworzenia przerzutów, jak i do indukcji angiogenezy, by zapewnić komórkom niezbędnych składników odżywczych oraz tlenu. Czas potrzebny do wznowy choroby jest zróżnicowany, zależy od wielu czynników, począwszy od tych leżących w molekularnych podstawach choroby do czynników środowiskowych. Oszacowano, że czas potrzebny do zmiany łagodnej w nabłonku do raka wynosi przynajmniej 20 lat [53]. Obserwacje dotyczące NKM zmuszają do zmiany w podejściu terapeutycznym, które powinno być skierowane właśnie przeciwko populacji komórek inicjującej rozwój choroby, gdyż konwencjonalne leczenie nie jest wystarczające [69].
Komórki macierzyste nabłonka jelita
Jednowarstwowy walcowaty nabłonek jelita buduje miliony gruczołów (krypt) jelitowych tworzących układy krypta/kosmek w jelicie cienkim oraz układy krypt w okrężnicy [72]. Stanowi jedną z najważniejszych barier w organizmie, która odpowiada za regulację absorpcji składników odżywczych i wody oraz jedną z najaktywniej odnawiających się i dynamicznych tkanek. Ścisła kontrola procesów, takich jak proliferacja, morfogeneza i adhezja komórek nabłonkowych, szczególnie w czasie ich migracji podczas różnicowania się, jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania nabłonka i do utrzymania homeostazy, nie dopuszczając do rozwoju nowotworu [95]. Większość prac doświadczalnych dotyczących zarówno prawidłowych komórek macierzystych nabłonka, jak i ich znaczenia dla transformacji nowotworowej wykonano na jelicie cienkim myszy. Nabłonek ten stał się swego rodzaju modelowym układem do analizy lokalizacji, funkcji i potencjału komórek macierzystych.
Każda krypta jelitowa zawiera tubularną część zakończoną owalnym/okrągłym dnem, które ma około 250- 300 komórek z wyspecjalizowaną domeną, podstawną i apikalną [73]. W jelicie cienkim około dziesięciu krypt jelitowych łączy się w jednym kosmku jelitowym [57].
Zarówno w jelicie cienkim jak i grubym w nabłonku występują trzy podstawowe typy dojrzałych komórek: walcowate enterocyty (kolonocyty w jelicie grubym), komórki wydzielające śluz oraz endokrynowe. W prawidłowych warunkach komórki te ulegają ciągłemu złuszczaniu i są zastępowane przez nowe, będące komórkami potomnymi niewielkiej liczby komórek macierzystych znajdujących się w dnie krypty jelitowej lub w jego pobliżu. Oszacowano, że cały nabłonek jelita cienkiego u myszy ulega wymianie co 2-5 dni [84]. Należy zauważyć, że w nabłonku jelita cienkiego, w odróżnieniu od jelita grubego, występują także komórki M, a w dnie gruczołów jelitowych komórki Panetha, które stanowią jeden z mechanizmów odporności wrodzonej [26,84]. Wyższe partie krypty jelitowej zajmują komórki prekursorowe, które są odpowiedzialne za zwiększenie liczby komórek podlegających różnicowaniu w kolejnych etapach. Migrują wzdłuż długiej osi krypty w górę, a w jelicie cienkim kontynuują migrację jako dojrzałe komórki ku szczytowi kosmków jelitowych [26,72]. Cechy somatycznych komórek macierzystych z nabłonka jelitowego wskazują, że komórki inicjujące rozwój nowotworu wywodzą się z tej właśnie populacji [3,89].
Komórki macierzyste nabłonka jelita cienkiego
Liczba komórek macierzystych w krypcie jelita cienkiego jest trudna do precyzyjnego oszacowania ze względu na stosowane różne metody badawcze opierające analizy o różne właściwości tych komórek. Wymienione komórki bada się pod względem obecności swoistych markerów błonowych, takich jak Lgr-5 lub testów funkcjonalnych opartych na analizie cyklu komórkowego w celu określenia poziomu ich proliferacji. Na przykład, w krypcie jelitowej wykazano obecność 16 komórek Lgr- 5+ ulokowanych między komórkami Panetha [94] oraz 4 komórki Bmi1+ w pozycji +4 [84] (ryc. 2). Natomiast za pomocą metody szacowania liczby komórek proliferujących, wykazano, że w krypcie znajduje się około 15 komórek macierzystych w pobliżu jej dna [26]. Wykorzystując metodę traktowania komórek promieniami γ i przyjmując, że komórki o największym potencjale klonogennym są najwrażliwsze określono, że na dnie krypty znajduje się zaledwie 3-6 nabłonkowych komórek macierzystych [71]. Przedstawiono hipotezę o hierarchicznej strukturze populacji około 36 komórek macierzystych w dnie krypty jelitowej, obejmujących pozycje 1-7 (ryc. 2). Według niej, komórek macierzystych o największym potencjale klonogennym jest zaledwie 4-6, a po ich apoptozie (wywołanej promieniowaniem γ) kolejna grupa komórek, bardziej odporna, zastępuje pierwszą. Po zastosowaniu promieniowania γ o jeszcze większej mocy, które wywołało apoptozę dwóch pierwszych populacji, trzecia grupa (około 24 komórek), zaczyna się dzielić wypełniając miejsca po utraconych komórkach oraz zabezpieczając potrzeby regeneracyjne tkanki [74]. Schematyczną strukturę dolnej części krypty jelitowej w jelicie cienkim i w zstępującym odcinku jelita grubego przedstawiono na rycinie 2.
Według badań grupy Ricci–Vitiani krypty jelita cienkiego zawierają dwie grupy komórek macierzystych [77,100]. W dolnej części dna krypty znajdują się aktywne komórki macierzyste o fenotypie Lgr-5+ [4]. Druga grupa komórek macierzystych umiejscawia się w pozycji +4 dna krypty jelitowej. Są to komórki uśpione, charakteryzuje je ekspresja Bmi-1 oraz TERT (podjednostka telomerazy o aktywności odwrotnej transkryptazy), które mogą zastąpić komórki Lgr-5+ [102,110]. Małą aktywność proliferacyjną komórek Lgr5negBmi-1+TERT+ wykazano obserwując segregację znaczników radioaktywnych, które nie ulegały rozcieńczeniu w czasie kolejnych rund replikacji w komórkach potomnych. Początkowo wysunięto hipotezę o niesymetrycznym rozdziale nici DNA w czasie podziału. Matczyne nici miałyby być segregowane zawsze do komórki o potencjale komórki macierzystej, a komórka włączająca program różnicowania miałaby otrzymywać nici DNA bez znaczników [58,74]. Dokładniejsze obserwacje wykazały jednak, że chromosomy są segregowane w sposób przypadkowy w czasie podziału, co potwierdziło przypuszczenia o niewielkiej aktywności proliferacyjnej komórek macierzystych nabłonka jelita z pozycji +4 krypty jelitowej [22,30,97]. W eksperymentach z wykorzystaniem metody ablacji komórek Bmi1+ metodą miejscowo swoistej rekombinacji, wykazano, że komórki te są niezbędne do utrzymania homeostazy w nabłonku jelita. Po wyłączeniu ich aktywności nabłonek stracił zdolności regeneracji, obserwowano zanik krypt jelitowych oraz śmierć zwierząt doświadczalnych [84]. W odróżnieniu od komórek Lgr-5+, które dzielą się ciągle, komórki o fenotypie Bmi-1+ ulegają aktywacji dopiero po uszkodzeniu tkanki lub w celu zastąpienia komórek Lgr-5+ w przypadku wyczerpania ich puli [47,102].
Buczacki i wsp. opublikowali w 2013 r. wyniki badań, które tłumaczą paradoks, który mówi o jelitowych komórkach macierzystych wyciszonych, lecz jednocześnie pozytywnych pod względem markera komórek macierzystych aktywnie proliferujących – Lgr-5. Według nich około 20% komórek Lgr-5+ ma charakter komórek wyciszonych, które się różnicują w komórki Panetha. Prawdopodobnie komórki Lgr5+ mogą przejściowo różnicować się do komórek Panetha i komórek enteroendokrynowych w nabłonku jelita, nie tracąc jednocześnie możliwości powrotu do „macierzystego” stanu, gdy dojdzie do uszkodzenia tkanki [17]. Podobne obserwacje dotyczą komórek prekursorowych wywodzących się bezpośrednio z komórek macierzystych Lgr-5+. Ich identyfikację oparto o analizę ekspresji jednego z ligandów receptora Notch – Dll1. Komórki Dll1high miały potencjał różnicowania się do komórek wydzielniczych, lecz również cechowała je plastyczność pozwalająca na odróżnicowaniu do wcześniejszego stadium komórki Lgr-5+ po uszkodzeniu nabłonka [113]. Podstawowe znaczenie komórek Lgr-5+ w regeneracji nabłonka jelita zostało potwierdzono przez ich selektywne unieczynnienie (dzięki metodzie delecji fragmentu genu tego białka), co wyraziło się zanikiem krypt jelitowych. Ponieważ Lgr-5 występuje w bardzo niewielu miejscach (w nabłonku układu pokarmowego, mieszkach włosowych), to nie zaobserwowano zaburzeń w mikroarchitekturze innych narządów w czasie przeprowadzania eksperymentu [25,64]. Natomiast unieczynnienie genów kodujących inne markery jelitowych komórek macierzystych, białek Rnf43 lub Znrf3, doprowadziło do intensywnej ekspansji jelitowych komórek macierzystych Lgr-5+ oraz komórek Panetha i powstawania gruczolaków [32]. Mechanizm zjawiska wydaje się powiązany z funkcją białka Rnf43, które wraz z receptorem TNF (TROY, TNFRSF19), tworzą pętlę negatywnej modulacji ścieżki sygnałowania białek Wnt zapewniającej prawidłowe funkcjonowanie komórek macierzystych [32,112].
Analiza profilu ekspresji genów w komórkach Lgr-5+ wyizolowanych z nabłonka jelita cienkiego myszy wykazała podwyższoną aktywność genu Olfm4 oraz genów białek efektorowych ścieżki Wnt, w tym takich jak Ascl2, Smoc2, Rnf43, które w modelu mysim są również uznawane za swoiste markery macierzystych komórek nabłonka jelita (tabela 1).
Komórki macierzyste nabłonka jelita grubego
Jak wspomniano, większość badań dotyczących właściwości i funkcji komórek macierzystych nabłonka jelita przeprowadzono na komórkach błony śluzowej jelita cienkiego. Obecność bardzo wielu podobieństw między mikroarchitekturą gruczołów jelitowych w jelicie cienkim i w jelicie grubym, pozwala na uznanie wyników badań doświadczalnych dotyczących proliferacji i różnicowania komórek w nabłonku jelita cienkiego za bardzo prawdopodobny odpowiednik zmian zachodzących w nabłonku jelita grubego.
W nabłonku wstępującego odcinka jelita grubego komórki Panetha zostają zastąpione przez tzw. „głębokie komórki wydzielnicze” o fenotypie CD24+ckit+ [81]. Pomiędzy nimi znajdują się spoczynkowe (quiescent) komórki macierzyste, a proliferujące komórki macierzyste Lgr-5+ są umiejscowione powyżej głębokich komórek wydzielniczych. Wykazano, że komórki macierzyste z pozycji 1-4 w nabłonku krypty pochodzą od komórek z pozycji 4-9. Jeżeli wykrywano komórki Lgr-5+ w niższych partiach krypt, to były one również pozytywne pod względem markera CD24. Po dokładniejszej analizie komórki obecne w dnie krypty jelitowej, zidentyfikowano jako wyciszone komórki macierzyste, które tworzą pulę zapasowych komórek uaktywnianych w stanach regeneracji nabłonka [36,49].
Jednak większe zainteresowanie budzi struktura i funkcja nabłonka odcinka zstępującego jelita grubego ze względu na to, że większość RJG rozwija się właśnie w tym odcinku. Na dnie krypt tego odcinka jelita znajdują się komórki wydzielające śluz podobne do komórek kubkowych o fenotypie CD24+cKit+. Między nimi umiejscawiają się wysokie walcowate komórki z wakuolami o fenotypie Lgr-5+, które są prawdopodobnie komórkami macierzystymi o dużym potencjale proliferacyjnym [75]. Komórki wakuolarne Lgr-5neg były wykrywane dopiero od pozycji +18, jednocześnie niedojrzałe, proliferujące komórki wydzielające śluz znajdowano w obszarze 1-6 krypty jelitowej [9]. Te ostatnie komórki nie miały morfologii typowej dla komórek śluzowych, miały mniej ziarnistości wydzielniczych, lecz profil transkrypcyjny był typowy dla komórek kubkowych (Spdef+) [39]. Na podstawie analizy fenotypu i właściwości określono, że w przedziale 1-7 współwystępują komórki macierzyste i komórki śluzowe podobne do komórek kubkowych (dominujące w pierwszych pozycjach) oraz pierwsze komórki prekursorowe [9,26,49], co różni ten odcinek od jelita cienkiego, w którym populacje o różnym potencjale są umiejscowione w oddzielnych strefach. Powyżej strefy 1-7 znajduje się strefa prekursorowych komórek przejściowo amplifikujących i różnicujących się. Mechanizm leżący u podstawy aktywacji wyciszonych komórek macierzystych nie jest jeszcze dokładnie poznany, lecz wiadomo już, że komórki te są pozytywne pod względem białka Lrig1, które odpowiada za aktywność proliferacyjną [75,116]. Populacje komórek Lgr-5+ i Lrig1+ współwystępują w obrębie dna krypt, lecz po analizie transkryptomu, okazało się, że nie są tożsame. Obie populacje zawierały markery komórek macierzystych, takie jak CD133, Bmi1 oraz mTERT, lecz tylko komórki Lgr-5+ wykazywały ekspresję Olfaktomedyny4, podczas gdy komórki Lrig1 były pozytywne pod względem białek hamujących wzrost i różnicowanie [26,109]. Komórki Lrig1+ są komórkami wyciszonymi w stanie homeostazy. Gen tego białka jest genem supresorowym, a utrata jego funkcji prowadzi do rozwoju gruczolaka [75,116]. Przejście między komórkami Lrig1+ a Lgr-5+ zachodzi tylko w przypadku uszkodzenia tkanki, nie zdarza się to w warunkach fizjologicznych [75].
Komórki macierzyste jelita mogą ulec transformacji nowotworowej
Według powszechnie przyjętej koncepcji rak jelita grubego rozwija się zgodnie ze schematem „bottom-up” [77,91]. Komórka macierzysta nabłonka jelitowego ulegająca transformacji nowotworowej, dzieląc się w sposób niekontrolowany wytwarza dużo komórek potomnych, które stopniowo zastępują wszystkie komórki nabłonka krypty jelitowej, od dna do szczytu krypty w procesie zwanym konwersją klonalną [77,91]. Wykazano, że marker Lgr5 ulega ekspresji na wysokim poziomie w komórkach wielu linii RJG oraz że profil ekspresji genów jest bardzo podobny między NKM analizowanych linii RJG i prawidłowymi komórkami macierzystymi dna krypty jelitowej [107].
Jednocześnie, pojawiły się dowody na istnienie alternatywnego schematu rozwoju RJG – „top-down” [91], według którego konwersja klonalna zaczyna się od odróżnicowanej komórki ze szczytu krypty. W badaniach na liniach komórkowych wykazano, że pod wpływem aktywacji szlaku Wnt następuje sekrecja czynnika martwicy nowotworu, TNF. TNF indukuje ekspresję czynnika transkrypcyjnego NF-κB, który może pobudzać odróżnicowanie się dojrzałej komórki nabłonka jelita do stanu bardziej pierwotnej nowotworowej komórki macierzystej [88]. Białko onkogenne κ-Ras może stymulować czynnik NF-κB, nasilając proces transformacji nowotworowej przez indukowanie odróżnicowywania się dojrzałych komórek z uszkodzonym białkiem Apc [100]. Na podstawie przedstawionych informacji można przypuszczać, że dopóki jelitowe komórki macierzyste aktywnie proliferują po uszkodzeniu tkanki (np. w warunkach stanu zapalnego), pod wpływem dużej aktywności szlaku Wnt, dopóty istnieje duże prawdopodobieństwo, że przyczyni się to do odróżnicowania się którejś z komórek nabłonka jelitowego i nabycia przez nią cech nowotworowej komórki macierzystej.
Najważniejsze zmiany genetyczne związane z powstaniem nowotworowych komórek macierzystych w raku jelita grubego
Teoretycznie, każda dowolna komórka może zakumulować tyle zmian, zarówno w sekwencji DNA (mutacje), jak i zmian epigenetycznych, w wyniku których może ulec transformacji do nowotworowej komórki macierzystej. NKM mają nieograniczony potencjał do podziałów i różnicowania się w komórki nowotworowe o różnym stopniu zróżnicowania oraz komórki nowotworowe pełniące różne funkcje w obrębie guza, co odpowiada za jego heterogenność, a ich zdolność do migracji sprzyja tworzeniu przerzutów. Istnienie „wyjściowej” nowotworowej komórki macierzystej, która zapoczątkowała rozwój ostrej białaczki szpikowej u myszy SCID charakteryzujących się brakiem odpowiedzi komórkowej, po raz pierwszy opisali Lapidot i wsp. w 1994 r. [52]. Występowanie NKM inicjującej karcynogenezę w przypadku RJG opisano po kilku latach, kiedy Ricci-Vitiani i wsp. wyizolowali komórki CD133+ z guza jelita grubego [77]. Klonalna ewolucja proliferujących NKM może doprowadzić do tego, że zyskają lub wręcz przeciwnie, tracą swoje cechy typowe dla komórek macierzystych. Jest to przeważnie kontrolowane przez warunki mikrośrodowiska rozwoju nowotworu [110]. Teoretycznie, w każdej odrębnej niszy tkankowej, takie zróżnicowane klonalne ekspansje mogą zachodzić niezależnie od siebie [98]. Dowodem na to mogą być zmiany fenotypu NKM raka jelita grubego, które po nabyciu zdolności do inwazji i tworzenia przeadarzutów zmieniają swój fenotyp z CD133high na CD133low [78]. Należy przy tym zaznaczyć, że obecność markera CD133 nie jest niezbędna do funkcjonowania NKM raka jelita grubego i tworzenia przerzutów. W modelu mysim komórki RJG o fenotypie CD133+ wytwarzały bardziej agresywne klony CD133neg, które tworzyły guzy po ksenotransplantacji [92].
Efektory ścieżki Wnt w czasie embriogenezy pełnią główną rolę jako morfogeny zaangażowane w wiele procesów związanych z proliferacją, różnicowaniem, migracją komórek oraz ich polaryzacją. Po zakończeniu różnicowania ta ścieżka sygnalizacyjna jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania tkankowych komórek macierzystych i prekursorowych, np. w czasie regeneracji tkanek po ich uszkodzeniu [51,90]. Mutacje genu APC (adenomotous polyposis coli), który koduje białko stanowiące składnik kompleksu degradującego β-kateninę, wykrywane są u około 80% chorych na RJG oraz leżą u podstaw rozwoju rodzinnej postaci RJG – Familiar Adenomatous Polyposis (FAP) [56]. Mutacje APC, indukujące wzmożoną aktywność ścieżki Wnt, powodują nagromadzanie się czynnej postaci β-kateniny w jądrze komórkowym i aktywacji transkrypcji genów związanych z proliferacją i różnicowaniem się komórek nawet przy braku sygnałów ze strony ligandów szlaku Wnt. Poza tym, białko Apc łączy się m.in. z mikrotubulami, a w wyniku mutacji jego genu może doprowadzić do zaburzenia funkcji wrzeciona kariokinetycznego i do powstawania aberracji chromosomowych w czasie licznych podziałów (indukowanych przez β-kateninę) [98].
Jednak w komórkach nowotworowych RJG uszkodzeniu mogą ulegać także inne ścieżki sygnałowe regulujące proliferację, dojrzewanie, migrację i/lub apoptozę, tj. TGF-β lub Notch-1 [21,93], co prowadzi do utraty ich funkcji, związanych m.in. z zahamowaniem podziałów komórkowych. Wprawdzie wysoka ekspresja białka Notch-1 jest typowa dla prawidłwych komórek macierzystych jelita, ale jednocześnie nadekspresja Notch-1 jest jednym z molekularnych wyróżników NKM w RJG. Wykazano, że ekspresja Notch-1 jest 10-30 razy wyższa w komórkach RJG pobranych od pacjentów w porównaniu z komercyjnymi liniami nowotworowymi stosowanymi rutynowo w doświadczeniach [21,93]. Nadekspresja Notch-1 chroni komórki raka przed sygnałami proapoptotycznymi oraz powoduje represję genów związanych z różnicowaniem [21,93].
Ważnym elementem w mechanizmach karcynogenezy są mutacje w obrębie genu DCC (deleted in colorectal cancer), które wykrywane są u ponad 70% chorych na raka jelita grubego [62]. Gdy dochodzi do utraty prawidłowej funkcji tego białka, zaburzona zostaje ścieżka regulująca dojrzewanie komórek nabłonka. Gen DCC jest bardzo dużym genem (zawiera przynajmniej 29 eksonów), którego transkrypcja dzięki mechanizmom alternatywnego splicingu może dostarczać kilka produktów białkowych. Wszystkie znane izoformy DCC są glikoproteinami błonowymi mającymi jedną domeną transbłonową.
Wykazano, że utrata aktywności DCC była związana z gorszym rokowaniem u chorych na RJG i ze wzrostem częstości przerzutów [62]. Receptor DCC, prawdopodobnie przez oddziaływania z białkiem netryną 1, reguluje proliferację i dojrzewanie komórek w obrębie krypt jelitowych. Wraz z przesuwaniem się komórek dojrzewających w górę gruczołu jelitowego, dużej redukcji ulega poziom netryny 1, co włącza proapoptotyczną funkcję receptora DCC, który aktywuje kaspazę 9 [62].
Mikrośrodowisko nowotworowych komórek macierzystych raka jelita grubego
Nisza tkankowa komórek macierzystych w obrębie krypty jelita grubego jest dynamicznym środowiskiem, na które składają się komórki macierzyste i pozostałe komórki obecne w nabłonku (śluzowe, endokrynowe i limfocyty śródnabłonkowe) oraz w tkance łącznej zrębu, takie jak limfocyty, makrofagi, fibroblasty, miofibroblasty oraz miocyty, otoczone składnikami macierzy pozakomórkowej. Nisza krypty jelitowej reaguje na zmieniające się warunki otoczenia, zarówno czynników obecnych w świetle jelita, jak i w otaczającej tkance i dostosowuje się do nich zapewniając tym samym adaptację komórek macierzystych oraz optymalne warunki do ich przeżycia, proliferacji i różnicowania [90,110].
NKM, które w czasie rozwoju nowotworu zastępują prawidłowe komórki macierzyste, mają duży wpływ na swoją niszę. Wydzielają m.in. czynniki proangiogenne, co zwiększa dopływ krwi [79]. Nisza nowotworowa różni się od prawidłowej niszy krypty jelitowej obecnością zrekrutowanych prekursorowych komórek śródbłonka, makrofagów, aktywowanych fibroblastów i miofibroblastów, które mogą przybrać postać tzw. „cancer associated fibroblasts” (CAF). Komórki swoją aktywnością wspierają rozwój choroby przez indukcję angiogenezy, rekrutację prekursorów dla komórek śródbłonka oraz rearanżację macierzy pozakomórkowej. Fibroblasty i miofibroblasty kontrolują warunki niszy oraz układ odpornościowy przez wydzielanie wielu działających miejscowo cytokin i czynników wzrostu, m.in. TNF-α, IL-6, czynnika wzrostu hepatocytów (HGF), który jest aktywatorem ścieżki Wnt [61,114]. Fibroblasty wydzielają chemokiny CXCL1 i CXCL2 oraz cytokiny IL-1β i IL-6, co zwiększa angiogenezę i progresję i choroby [29].
Populacja komórkowa, która wywiera znaczny wpływ na warunki niszy sprzyjające rozwojowi nowotworu, progresji choroby, tworzeniu przerzutów oraz oporności na leczenie to mezenchymalne komórki macierzyste (MKM). Wykazano ich obecność i aktywność w wielu rodzajach guzów litych, w tym w raku jelita grubego [55,96]. Wpływ MKM na rozwój nowotworu zaznacza się bardzo wcześnie przez wiele mechanizmów. MKM obecne w ścianie okrężnicy w odpowiedzi na stymulację IFN-γ lub TNF-α, wydzielają duże ilości czynników proangiogennych (VEGF) [55]. Rekrutują komórki śródbłonka przez wydzielanie chemokiny CXCL12 [65]. Wykazano, że wydzielana przez MKM IL-6 pobudza w prawidłowych komórkach macierzystych ekspresję markerów typowych dla NKM indukując przez to rozwój nowotworu w mysim modelu RJG [106]. Interleukina-6 indukuje sekrecję endoteliny-1 (ET-1) przez komórki nowotworowe, która jest czynnikiem chemotaktycznym endoteliocytów i ich prekursorów [45]. Wykazano to przez ksenotransplantację mieszaniny komórek linii HT-29 oraz nienowotworowych MKM do organizmu myszy. Zaobserwowano również obiecujący wynik hamowania rozwoju nowotworu u myszy po zastosowaniu przeciwciał anty-IL-6 lub anty-ET-1 [45]. Chorzy na RJG, u których we krwi obwodowej wykrywa się wyższe stężenia IL-6 i VEGF cechują się wyższym stopniem zaawansowania choroby i obecnością przerzutów [28,50].
Znaczenie interleukin 4 i 6 w progresji raka jelita grubego
Wykazano, że autokrynna sekrecja IL-4 przez komórki nowotworowe chroni je przed apoptozą i chemioterapeutykami [34,104]. Wysokie stężenia tej cytokiny wykrywano w hodowlach komórek RJG o fenotypie CD133+ i Msi+, a brak jej było w czasie hodowli prawidłowych kolonocytów [103]. Jednocześnie, blokowanie receptora IL-4 lub indukowanie mutacji w obrębie genu tej cytokiny, przywracało ich wrażliwość na oxaliplatynę, 5-fluorouracyl lub TRAIL. Miało to bezpośredni związek ze spadkiem ekspresji białek antyapoptotycznych, takich jak Bcl-xL, cFlip oraz Ped, których wysoki poziom obserwuje się w komórkach raka jelita grubego. Zjawisko to obserwowano zarówno w dojrzałych komórkach guza CD133neg, jak i w NKM CD133+ [103].
Interleukina 6 jest wydzielana przez aktywowane makrofagi, monocyty oraz same komórki nowotworowe. W badaniach in vitro wykazano, że IL-6 stymuluje proliferację komórek różnych linii RJG i wzrost kolonii NKM w sposób zależny od dawki [42,87], a także zwiększa inwazyjność komórek nowotworowych oraz indukuje angiogenezę [42,87]. Podwyższone stężenie IL-6 w surowicy krwi u chorych na RJG ze średnim zaawansowaniem choroby sugeruje jej wpływ na progresję choroby [15,16]. W badaniach in vitro IL-6 wiązała się do swojego rozpuszczalnego receptora, który następnie indukował fosforylację STAT3 i podziały komórek nowotworowych [7,8]. Mechanizm, który odpowiada za wzrost stężenia IL-6 w surowicy krwi chorych na RJG nie jest jeszcze jednoznacznie wyjaśniony. Jedna z teorii mówi o roli polimorfizmu par G/C w obrębie promotora genu IL-6 (w pozycji -174). Allel z nukleotydem cytozynowym w pozycji -174 (-174C) ulega transkrypcji mniej wydajnie w porównaniu z allelem, który ma nukleotyd guanylowy (-174G) w obrębie promotora [10]. Najnowsze metaanalizy dotyczące tego problemu zdają się jednak wykluczać związek występowania którejś z postaci z większym ryzykiem zachorowalności na RJG [43]. Innym wytłumaczeniem jest sugerowana amplifikacja genu IL-6, którą zaobserwowano u chorych na glejaka [101].
Podsumowanie
Badania nad właściwościami somatycznych komórek macierzystych odpowiedzialnych w warunkach fizjologicznych za regenerację komórek nabłonka jelita, stanowiły punkt wyjścia do poznania cech nowotworowych komórek macierzystych w raku jelita grubego. Od czasu, gdy udowodniono istnienie populacji NKM o wysokim potencjale proliferacyjnym, są one uważane za jedną z głównych przyczyn niepowodzeń terapii przeciwnowotworowej w RJG, a tym samym stanowić powinny nowy, ważny cel terapeutyczny. Z tego względu wydaje się, że inhibitory ścieżek proproliferacyjnych i proprzeżyciowych łącznie z czynnikami cytotoksycznymi i indukującymi różnicowanie się nowotworowych komórek macierzystych mogą stworzyć podstawę bardziej skutecznego leczenia chorych na raka jelita grubego.
Przypisy
- 1. Ashktorab H., Schäffer A.A., Daremipouran M., Smoot D.T., LeeE., Brim H.: Distinct genetic alterations in colorectal cancer. PLoSOne, 2010; 5: e8879
Google Scholar - 2. Balmana J., Stockwell D.H., Steyerberg E.W., Stoffel E.M., DeffenbaughA.M., Reid J.E., Ward B., Scholl T., Hendrickson B., Tazelaar J.,Burbidge L.A., Syngal S.: Prediction of MLH1 and MSH2 mutationsin Lynch syndrome. JAMA, 2006; 296: 1469-1478
Google Scholar - 3. Barker N., Ridgway R.A., van Es J.H., van de Wetering M., BegthelH., van den Born M., Danenberg E., Clarke A.R., Sansom O.J., CleversH.: Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature,2009; 457: 608-611
Google Scholar - 4. Barker N., van Es J.H., Kuipers J., Kujala P., van den Born M., CozijnsenM., Haegebarth A., Korving J., Begthel H., Peters P.J., CleversH.: Identification of stem cells in small intestine and colon by markergene Lgr5. Nature, 2007; 449: 1003-1007
Google Scholar - 5. Barnetson R.A., Tenesa A., Farrington S.M., Nicholl I.D., CetnarskyjR., Porteous M.E., Campbell H., Dunlop M.G.: Identification andsurvival of carriers of mutations in DNA mismatch-repair genes incolon cancer. N. Engl. J. Med., 2006; 354: 2751-2763 6 Bartel D.P.: MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, andfunction. Cell, 2004; 116: 281-297
Google Scholar - 6. in patients with colorectal cancer. Saudi J. Gastroenterol.,2011; 17: 170-173
Google Scholar - 7. Becker C., Fantini M.C., Schramm C., Lehr H.A., Wirtz S., NikolaevA., Burg J., Strand S., Kiesslich R., Huber S., Ito H., NishimotoN., Yoshizaki K., Kishimoto T., Galle P.R., Blessing M., Rose-John S.,Neurath M.F.: TGF-β suppresses tumor progression in colon cancerby inhibition of IL-6 trans-signaling. Immunity, 2004; 21: 491-501
Google Scholar - 8. Becker C., Fantini M.C., Wirtz S., Nikolaev A., Lehr H.A., Galle P.R.,Rose-John S., Neurath M.F.: IL-6 signaling promotes tumor growthin colorectal cancer. Cell Cycle, 2005; 4: 217-220
Google Scholar - 9. Bellis J., Duluc I., Romagnolo B., Perret C., Faux M.C., Dujardin D.,Formstone C., Lightowler S., Ramsay R.G., Freund J.N., De Mey J.R.:The tumor suppressor Apc controls planar cell polarities central togut homeostasis. J. Cell Biol., 2012; 198: 331-341
Google Scholar - 10. Belluco C., Olivieri F., Bonafe M., Giovagnetti S., Mammano E.,Scalerta R., Ambrosi A., Franceschi C., Nitti D., Lise M.: -174 G>Cpolymorphism of interleukin 6 gene promoter affects interleukin 6 serum level in patients with colorectal cancer. Clin. Cancer Res.,2003; 9: 2173-2176
Google Scholar - 11. Bettington M., Walker N., Clouston A., Brown I., Leggett B.,Whitehall V.: The serrated pathway to colorectal carcinoma: currentconcepts and challenges. Histopathology, 2013; 62: 367-386
Google Scholar - 12. Bonasio R., Tu S., Reinberg D.: Molecular signals of epigeneticstates. Science, 2010; 330: 612-616
Google Scholar - 13. Botchkina I.L., Rowehl R.A., Rivadeneira D.E., Karpeh M.S.Jr.,Crawford H., Dufour A., Ju J., Wang Y., Leyfman Y., Botchkina G.I.:Phenotypic subpopulations of metastatic colon cancer stem cells:genomic analysis. Cancer Genomics Proteomics, 2009; 6: 19-29
Google Scholar - 14. Brenner H., Kloor M., Pox C.P.: Colorectal cancer. Lancet, 2014;383: 1490-1502
Google Scholar - 15. Brozek W., Bises G., Fabjani G., Cross H.S., Peterlik M.: Clonespecificexpression, transcriptional regulation, and action of interleukin- 6 in human colon carcinoma cells. BMC Cancer, 2008; 8: 13
Google Scholar - 16. Brozek W., Bises G., Girsch T., Cross H.S., Kaiser H.E., PeterlikM.: Differentiation-dependent expression and mitogenic action ofinterleukin-6 in human colon carcinoma cells: relevance for tumourprogression. Eur. J. Cancer, 2005; 41: 2347-2354
Google Scholar - 17. Buczacki S.J., Zecchini H.I., Nicholson A.M., Russell R., VermeulenL., Kemp R., Winton D.J.: Intestinal label-retaining cells are secretoryprecursors expressing Lgr5. Nature, 2013; 495: 65-69
Google Scholar - 18. Chalitchagorn K., Shuangshoti S., Hourpai N., KongruttanachokN., Tangkijvanich P., Thong-ngam D., Voravud N., Sriuranpong V.,Mutirangura A.: Distinctive pattern of LINE-1 methylation level innormal tissues and the association with carcinogenesis. Oncogene,2004; 23: 8841-8846
Google Scholar - 19. Cheah M.S., Wallace C.D., Hoffman R.M.: Hypomethylation ofDNA in human cancer cells: a site-specific change in the c-myc oncogene.J. Natl. Cancer Inst., 1984; 73: 1057-1065
Google Scholar - 20. Chen J., Röcken C., Lofton-Day C., Schulz H.U., Müller O., KutznerN., Malfertheiner P., Ebert M.P.: Molecular analysis of APC promotermethylation and protein expression in colorectal cancer metastasis.Carcinogenesis, 2005; 26: 37-43
Google Scholar - 21. Chowdhury S., Howell G.M., Rajput A., Teggart C.A., Brattain L.E.,Weber H.R., Chowdhury A., Brattain M.G.: Identification of a novelTGFβ/PKA signaling transduceome in mediating control of cellsurvival and metastasis in colon cancer. PLoS One, 2011; 6: e19335
Google Scholar - 22. Clevers H.: The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment.Cell, 2013; 154: 274-284
Google Scholar - 23. Cui H., Horon I.L., Ohlsson R., Hamilton S.R., Feinberg A.P.: Lossof imprinting in normal tissue of colorectal cancer patients withmicrosatellite instability. Nat. Med., 1998; 4: 1276-1280
Google Scholar - 24. Dalerba P., Dylla S.J., Park I.K., Liu R., Wang X., Cho R.W., Hoey T.,Gurney A., Huang E.H., Simeone D.M., Shelton A.A., Parmiani G., CastelliC., Clarke M.F.: Phenotypic characterization of human colorectalcancer stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007; 104: 10158-10163
Google Scholar - 25. de Lau W., Barker N., Low T.Y., Koo B.K., Li V.S., Teunissen H.,Kujala P., Haegebarth A., Peters P.J., van de Wetering M., Stange D.E.,van Es J.E., Guardavaccaro D., Schasfoort R.B., Mohri Y., NishimoriK., Mohammed S., Heck A.J., Clevers H.: Lgr5 homologues associatewith Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature,2011; 476: 293-297
Google Scholar - 26. De Mey J.R., Freund J.N.: Understanding epithelial homeostasisin the intestine: an old battlefield of ideas, recent breakthroughs andremaining controversies. Tissue Barriers, 2013; 1: e24965
Google Scholar - 27. Ebert M.P., Mooney S.H., Tonnes-Priddy L., Lograsso J., HoffmannJ., Chen J., Röcken C., Schulz H.U., Malfertheiner P., Lofton-Day C.:Hypermethylation of the TPEF/HPP1 gene in primary and metastaticcolorectal cancers. Neoplasia, 2005; 7: 771-778
Google Scholar - 28. Eldesoky A., Shouma A., Mosaad Y., Elhawary A.: Clinical relevanceof serum vascular endothelial growth factor and interleukin-
Google Scholar - 29. Erez N., Truitt M., Olson P., Arron S.T., Hanahan D.: Cancer-associatedfibroblasts are activated in incipient neoplasia to orchestratetumor-promoting inflammation in an NF-κB-dependent manner.Cancer Cell, 2010; 17: 135-147
Google Scholar - 30. Escobar M., Nicolas P., Sangar F., Laurent-Chabalier S., Clair P.,Joubert D., Jay P., Legraverend C.: Intestinal epithelial stem cells donot protect their genome by asymmetric chromosome segregation.Nat. Commun., 2011; 2: 258
Google Scholar - 31. Fábián A., Barok M., Vereb G., Szöllosi J.: Die hard: are cancerstem cells the Bruce Willises of tumor biology? Cytometry A, 2009;75: 67-74
Google Scholar - 32. Fafilek B., Krausova M., Vojtechova M., Pospichalova V., TumovaL., Sloncova E., Huranova M., Stancikova J., Hlavata A., Svec J., SedlacekR., Luksan O., Oliverius M., Voska L., Jirsa M., Paces J., KolarM., Krivjanska M., Klimesova K., Tlaskalova-Hogenova H., KorinekV.: Troy, a tumor necrosis factor receptor family member, interactswith lgr5 to inhibit wnt signaling in intestinal stem cells. Gastroenterology,2013; 144: 381-391
Google Scholar - 33. Fearon E.R., Vogelstein B.: A genetic model for colorectal tumorigenesis.Cell, 1990; 61: 759-767
Google Scholar - 34. Francipane M.G., Alea M.P., Lombardo Y., Todaro M., MedemaJ.P., Stassi G.: Crucial role of interleukin-4 in the survival of coloncancer stem cells. Cancer Res., 2008; 68: 4022-4025
Google Scholar - 35. Furuyama K., Kawaguchi Y., Akiyama H., Horiguchi M., KodamaS., Kuhara T., Hosokawa S., Elbahrawy A., Soeda T., Koizumi M., MasuiT., Kawaguchi M., Takaori K., Doi R., Nishi E. i wsp.: Continuous cellsupply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrinepancreas and intestine. Nat. Genet, 2011; 43: 34-41
Google Scholar - 36. Gândara R.M., Mahida Y.R., Potten C.S.: Regional differences instem and transit cell proliferation and apoptosis in the terminal ileumand colon of mice after 12 Gy. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.,2012; 82: e521-528
Google Scholar - 37. Goelz S.E., Vogelstein B., Hamilton S.R., Feinberg A.P.: Hypomethylationof DNA from benign and malignant human colon neoplasms.Science, 1985; 228: 187-190
Google Scholar - 38. Goto T., Mizukami H., Shirahata A., Sakata M., Saito M., IshibashiK., Kigawa G., Nemoto H., Sanada Y., Hibi K.: Aberrant methylation ofthe p16 gene is frequently detected in advanced colorectal cancer.Anticancer Res., 2009; 29: 275-277
Google Scholar - 39. Gregorieff A., Stange D.E., Kujala P., Begthel H., van den BornM., Korving J., Peters P.J., Clevers H.: The ets-domain transcriptionfactor Spdef promotes maturation of goblet and paneth cells in theintestinal epithelium. Gastroenterology, 2009; 137: 1333-1345
Google Scholar - 40. Hanahan D., Weinberg R.A.: The hallmarks of cancer. Cell, 2000;100: 57-70
Google Scholar - 41. Haraguchi N., Ohkuma M., Sakashita H., Matsuzaki S., TanakaF., Mimori K., Kamohara Y., Inoue H., Mori M.: CD133+CD44+ populationefficiently enriches colon cancer initiating cells. Ann. Surg.Oncol., 2008; 15: 2927-2933
Google Scholar - 42. Hsu C.P., Chung Y.C.: Influence of interleukin-6 on the invasivenessof human colorectal carcinoma. Anticancer Res., 2006; 26:4607-4614
Google Scholar - 43. Hu J.J., Wang Z.T., Zhong J.: Lack of association between theinterleukin 6 gene -174G>C polymorphism and colorectal cancer:evidence from a meta-analysis. Genet. Mol. Res., 2013: 12: 2205-2214
Google Scholar - 44. Huang E.H., Hynes M.J., Zhang T., Ginestier C., Dontu G., AppelmanH., Fields J.Z., Wicha M.S., Boman B.M.: Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stemcells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis.Cancer Res., 2009; 69: 3382-3389
Google Scholar - 45. Huang W.H., Chang M.C., Tsai K.S., Hung M.C., Chen H.L., HungS.C.: Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis oftumors in mice. Oncogene, 2013; 32: 4343-4354
Google Scholar - 46. Isoda T., Nakatsu Y., Yamauchi K., Piao J., Yao T., Honda H., NakabeppuY., Tsuzuki T.: Abnormality in Wnt signaling is causativelyassociated with oxidative stress-induced intestinal tumorigenesisin MUTYH-null mice. Int. J. Biol. Sci., 2014; 10: 940-947
Google Scholar - 47. Itzkovitz S., Blat I.C., Jacks T., Clevers H., van Oudenaarden A.:Optimality in the development of intestinal crypts. Cell, 2012; 148:608-619
Google Scholar - 48. Jass J.R.: Classification of colorectal cancer based on correlationof clinical, morphological and molecular features. Histopathology,2007; 50: 113-130
Google Scholar - 49. King J.B., von Furstenberg R.J., Smith B.J., McNaughton K.K.,Galanko J.A., Henning S.J.: CD24 can be used to isolate Lgr5+ putativecolonic epithelial stem cells in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest.Liver Physiol., 2012; 303: G443-G452
Google Scholar - 50. Knüpfer H., Preiss R.: Serum interleukin-6 levels in colorectalcancer patients – a summary of published results. Int. J. Colorectal.Dis., 2010; 25: 135-140
Google Scholar - 51. Krausova M., Korinek V.: Wnt signaling in adult intestinal stemcells and cancer. Cell Signal., 2014; 26: 570-579
Google Scholar - 52. Lapidot T., Sirard C., Vormoor J., Murdoch B., Hoang T., Caceres-Cortes J., Minden M., Paterson B., Caligiuri M.A., Dick J.E.: A cellinitiating human acute myeloid leukaemia after transplantationinto SCID mice. Nature, 1994; 367: 645-648
Google Scholar - 53. Leedham S.J.: Measuring stem cell dynamics in the human colon- where there›s a wiggle, there›s a way. J. Pathol., 2014; 234: 292-295
Google Scholar - 54. Li Q., Chen H.: Transcriptional silencing of N-Myc downstream-regulated gene 1 (NDRG1) in metastatic colon cancer cell lineSW620. Clin. Exp. Metastasis, 2011; 28: 127-135
Google Scholar - 55. Liu Y., Han Z.P., Zhang S.S., Jing Y.Y., Bu X.X., Wang C.Y., Sun K.,Jiang G.C., Zhao X., Li R., Gao L., Zhao Q.D., Wu M.C., Wei L.X.: Effectsof inflammatory factors on mesenchymal stem cells and their role inthe promotion of tumor angiogenesis in colon cancer. J. Biol. Chem.,2011; 286: 25007-25015
Google Scholar - 56. Lynch H.T., de la Chapelle A.: Hereditary colorectal cancer. N.Engl. J. Med., 2003; 348: 919-932
Google Scholar - 57. Magney J.E., Erlandsen S.L., Bjerknes M.L., Cheng H.: Scanningelectron microscopy of isolated epithelium of the murine gastrointestinaltract: morphology of the basal surface and evidence forparacrinelike cells. Am. J. Anat., 1986; 177: 43-53
Google Scholar - 58. Marshman E., Booth C., Potten C.S.: The intestinal epithelialstem cell. Bioessays, 2002; 24: 91-98
Google Scholar - 59. Mathonnet M., Perraud A., Christou N., Akil H., Melin C., BattuS., Jauberteau M.O., Denizot Y.: Hallmarks in colorectal cancer: angiogenesisand cancer stem-like cells. World J. Gastroenterol., 2014;20: 4189-4196
Google Scholar - 60. May R., Riehl T.E., Hunt C., Sureban S.M., Anant S., HouchenC.W.: Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell andadenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, followingradiation injury and in adenomatous polyposis coli/multipleintestinal neoplasia mice. Stem Cells, 2008; 26: 630-637
Google Scholar - 61. Medema J.P., Vermeulen L.: Microenvironmental regulationof stem cells in intestinal homeostasis and cancer. Nature, 2011;474: 318-326
Google Scholar - 62. Mehlen P., Fearon E.R.: Role of the dependence receptor DCC incolorectal cancer pathogenesis. J. Clin. Oncol., 2004; 22: 3420-3428
Google Scholar - 63. Menendez J.A., Joven J., Cufi S., Corominas-Faja B., Oliveras-Ferraros C., Cuyas E., Martin-Castillo B., López-Bonet E., AlarcónT., Vazquez-Martin A.: The Warburg effect version 2.0: metabolicreprogramming of cancer stem cells. Cell Cycle, 2013; 12: 1166-1179
Google Scholar - 64. Metcalfe C., Kljavin N.M., Ybarra R., de Sauvage F.J.: Lgr5+ stemcells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration.Cell Stem Cell, 2014; 14: 149-159
Google Scholar - 65. Mishra P.J., Mishra P.J., Humeniuk R., Medina D.J., Alexe G., MesirovJ.P., Ganesan S., Glod J.W., Banerjee D.: Carcinoma-associatedfibroblast-like differentiation of human mesenchymal stem cells.Cancer Res., 2008; 68: 4331-4339
Google Scholar - 66. Montgomery R.K., Carlone D.L., Richmond C.A., Farilla L.,Kranendonk M.E., Henderson D.E., Baffour-Awuah N.Y., AmbruzsD.M., Fogli L.K., Algra S., Breault D.T.: Mouse telomerase reversetranscriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinalstem cells. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 2011; 108: 179-184
Google Scholar - 67. Nishimura S., Wakabayashi N., Toyoda K., Kashima K., MitsufujiS.: Expression of Musashi-1 in human normal colon crypt cells:a possible stem cell marker of human colon epithelium. Dig. Dis.Sci., 2003; 48: 1523-1529
Google Scholar - 68. O›Brien C.A., Pollett A., Gallinger S., Dick J.E.: A human coloncancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficientmice. Nature, 2007; 445: 106-110
Google Scholar - 69. Paldino E., Tesori V., Casalbore P., Gasbarrini A., Puglisi M.A.: Tumorinitiating cells and chemoresistance: which is the best strategyto target colon cancer stem cells? Biomed. Res. Int., 2014; 2014: 859871
Google Scholar - 70. Pancione M., Giordano G., Remo A., Febbraro A., Sabatino L.,Manfrin E., Ceccarelli M., Colantuoni V.: Immune escape mechanismsin colorectal cancer pathogenesis and liver metastasis. J. Immunol.Res., 2014; 2014: 686879
Google Scholar - 71. Potten C.S.: Extreme sensitivity of some intestinal crypt cells toX and gamma irradiation. Nature, 1977; 269: 518-521
Google Scholar - 72. Potten C.S.: Stem cells in gastrointestinal epithelium: numbers,characteristics and death. Philos. Trans R. Soc. Lond. B Biol. Sci.,1998; 353: 821-830
Google Scholar - 73. Potten C.S., Loeffler M.: A comprehensive model of the cryptsof the small intestine of the mouse provides insight into the mechanismsof cell migration and the proliferation hierarchy. J. Theor.Biol., 1987; 127: 381-391
Google Scholar - 74. Potten C.S., Owen G., Booth D.: Intestinal stem cells protecttheir genome by selective segregation of template DNA strands. J.Cell Sci., 2002; 115: 2381-2388
Google Scholar - 75. Powell A.E., Wang Y., Li Y., Poulin E.J., Means A.L., WashingtonM.K., Higginbotham J.N., Juchheim A., Prasad N., Levy S.E., Guo Y.,Shyr Y., Aronow B.J., Haigis K.M., Franklin J.L., Coffey R.J.: The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker thatfunctions as a tumor suppressor. Cell, 2012; 149: 146-158
Google Scholar - 76. Raver-Shapira N., Marciano E., Meiri E., Spector Y., RosenfeldN., Moskovits N., Bentwich Z., Oren M.: Transcriptional activationof miR-34a contributes to p53-mediated apoptosis. Mol. Cell, 2007;26: 731-743
Google Scholar - 77. Ricci-Vitiani L., Fabrizi E., Palio E., De Maria R.: Colon cancerstem cells. J. Mol. Med., 2009; 87: 1097-1104
Google Scholar - 78. Ricci-Vitiani L., Lombardi D.G., Pilozzi E., Biffoni M., Todaro M.,Peschle C., De Maria R.: Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature, 2007; 445: 111-115
Google Scholar - 79. Ricci-Vitiani L., Pallini R., Biffoni M., Todaro M., Invernici G.,Cenci T., Maira G., Parati E.A., Stassi G., Larocca L.M., De Maria R.:Tumour vascularization via endothelial differentiation of glioblastomastem-like cells. Nature, 2010; 468: 824-828
Google Scholar - 80. Rogler G.: Chronic ulcerative colitis and colorectal cancer. CancerLett., 2014; 345: 235-241
Google Scholar - 81. Rothenberg M.E., Nusse Y., Kalisky T., Lee J.J., Dalerba P., ScheerenF., Lobo N., Kulkarni S., Sim S., Qian D., Beachy P.A., PasrichaP.J., Quake S.R., Clarke M.F.: Identification of a cKit(+) colonic cryptbase secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology,2012; 142: 1195-1205
Google Scholar - 82. Roy S., Majumdar A.P.: Cancer stem cells in colorectal cancer:genetic and epigenetic changes. J. Stem Cell Res. Ther., 2012; Suppl. 7
Google Scholar - 83. Salama P., Platell C.: Colorectal cancer stem cells. ANZ J. Surg.,2009; 79: 697-702
Google Scholar - 84. Sangiorgi E., Capecchi M.R.: Bmi1 is expressed in vivo in intestinalstem cells. Nat. Genet., 2008; 40: 915-920
Google Scholar - 85. Sasaki J., Konishi F., Kawamura Y.J., Kai T., Takata O., TsukamotoT.: Clinicopathological characteristics of colorectal cancerswith loss of imprinting of insulin-like growth factor 2. Int. J. Cancer,2006; 119: 80-83
Google Scholar - 86. Sato T., Vries R.G., Snippert H.J., van de Wetering M., BarkerN., Stange D.E., van Es J.H., Abo A., Kujala P., Peters P.J., Clevers H.:Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro withouta mesenchymal niche. Nature, 2009; 459: 262-265
Google Scholar - 87. Schneider M.R., Hoeflich A., Fischer J.R., Wolf E., Sordat B.,Lahm H.: Interleukin-6 stimulates clonogenic growth of primaryand metastatic human colon carcinoma cells. Cancer Lett., 2000;151: 31-38
Google Scholar - 88. Schwitalla S., Fingerle A.A., Cammareri P., Nebelsiek T., GoktunaS.I., Ziegler P.K., Canli O., Heijmans J., Huels D.J., Moreaux G., RupecR.A., Gerhard M., Schmid R., Barker N., Clevers H. i wsp.: Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem–cell-like properties. Cell, 2013; 152: 25-38
Google Scholar - 89. Sell S.: On the stem cell origin of cancer. Am. J. Pathol., 2010;176: 2584-2594
Google Scholar - 90. Shaker A., Rubin D.C.: Intestinal stem cells and epithelial-mesenchymalinteractions in the crypt and stem cell niche. Transl.Res., 2010; 156: 180-187
Google Scholar - 91. Shih I.M., Wang T.L., Traverso G., Romans K., Hamilton S.R., Ben–Sasson S., Kinzler K.W., Vogelstein B.: Top-down morphogenesis ofcolorectal tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001; 98: 2640-2645
Google Scholar - 92. Shmelkov S.V., Butler J.M., Hooper A.T., Hormigo A., KushnerJ., Milde T., St Clair R., Baljevic M., White I., Jin D.K., Chadburn A.,Murphy A.J., Valenzuela D.M., Gale N.W., Thurston G. i wsp.: CD133expression is not restricted to stem cells, and both CD133+ andCD133- metastatic colon cancer cells initiate tumors. J. Clin. Invest.,2008; 118: 2111-2120
Google Scholar - 93. Sikandar S.S., Pate K.T., Anderson S., Dizon D., Edwards R.A.,Waterman M.L., Lipkin S.M.: NOTCH signaling is required for formationand self-renewal of tumor-initiating cells and for repressionof secretory cell differentiation in colon cancer. Cancer Res., 2010;70: 1469-1478
Google Scholar - 94. Snippert H.J., Schepers A.G., van Es J.H., Simons B.D., CleversH.: Biased competition between Lgr5 intestinal stem cells drivenby oncogenic mutation induces clonal expansion. EMBO Rep., 2014;15: 62-69
Google Scholar - 95. Solanas G., Batlle E.: Control of cell adhesion and compartmentalizationin the intestinal epithelium. Exp. Cell Res., 2011; 317:2695-2701
Google Scholar - 96. Stagg J.: Mesenchymal stem cells in cancer. Stem Cell Rev., 2008;4: 119-124
Google Scholar - 97. Steinhauser M.L., Bailey A.P., Senyo S.E., Guillermier C., PerlsteinT.S., Gould A.P., Lee R.T., Lechene C.P.: Multi-isotope imagingmass spectrometry quantifies stem cell division and metabolism.Nature, 2012; 481: 516-519
Google Scholar - 98. Takebe N., Ivy S.P.: Controversies in cancer stem cells: targetingembryonic signaling pathways. Clin. Cancer Res., 2010; 16: 3106-3112
Google Scholar - 99. Tamagawa H., Oshima T., Shiozawa M., Morinaga S., NakamuraY., Yoshihara M., Sakuma Y., Kameda Y., Akaike M., Masuda M., ImadaT., Miyagi Y.: The global histone modification pattern correlateswith overall survival in metachronous liver metastasis of colorectalcancer. Oncol. Rep., 2012; 27: 637-642
Google Scholar - 100. Tan S., Barker N.: Epithelial stem cells and intestinal cancer.Semin. Cancer Biol., 2015; 32: 40-53
Google Scholar - 101. Tchirkov A., Khalil T., Chautard E., Mokhtari K., Véronese L.,Irthum B., Vago P., Kémény J.L., Verrelle P.: Interleukin-6 gene amplificationand shortened survival in glioblastoma patients. Br. J.Cancer, 2007; 96: 474-476
Google Scholar - 102. Tian H., Biehs B., Warming S., Leong K.G., Rangell L., Klein O.D.,de Sauvage F.J.: A reserve stem cell population in small intestinerenders Lgr5-positive cells dispensable. Nature, 2011; 478: 255-259
Google Scholar - 103. Todaro M., Alea M.P., Di Stefano A.B., Cammareri P., VermeulenL., Iovino F., Tripodo C., Russo A., Gulotta G., Medema J.P., Stassi G.:Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell deathby production of interleukin-4. Cell Stem Cell., 2007; 1: 389-402
Google Scholar - 104. Todaro M., Perez Alea M., Scopelliti A., Medema J.P., Stassi G.:IL-4-mediated drug resistance in colon cancer stem cells. Cell Cycle,2008; 7: 309-313
Google Scholar - 105. Toyota M., Ahuja N., Ohe-Toyota M., Herman J.G., Baylin S.B.,Issa J.P.: CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1999; 96: 8681-8686
Google Scholar - 106. Tsai K.S., Yang S.H., Lei Y.P., Tsai C.C., Chen H.W., Hsu C.Y.,Chen L.L., Wang H.W., Miller S.A., Chiou S.H., Hung M.C., Hung S.C.:Mesenchymal stem cells promote formation of colorectal tumors inmice. Gastroenterology, 2011; 141: 1046-1056
Google Scholar - 107. Uchida H., Yamazaki K., Fukuma M., Yamada T., Hayashida T.,Hasegawa H., Kitajima M., Kitagawa Y., Sakamoto M.: Overexpressionof leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5 incolorectal cancer. Cancer Sci., 2010; 101: 1731-1737
Google Scholar - 108. Umetani N., Takeuchi H., Fujimoto A., Shinozaki M., Bilchik A.J.,Hoon D.S.: Epigenetic inactivation of ID4 in colorectal carcinomascorrelates with poor differentiation and unfavorable prognosis. Clin.Cancer Res., 2004; 10: 7475-7483
Google Scholar - 109. Upadhyay G., Yin Y., Yuan H., Li X., Derynck R., Glazer R.I.: Stemcell antigen-1 enhances tumorigenicity by disruption of growth differentiationfactor-10 (GDF10)-dependent TGF-β signaling. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 2011; 108: 7820-7825
Google Scholar - 110. Vaiopoulos A.G., Kostakis I.D., Koutsilieris M., PapavassiliouA.G.: Colorectal cancer stem cells. Stem Cells, 2012; 30: 363-371
Google Scholar - 111. van der Flier L.G., Haegebarth A., Stange D.E., van de WeteringM., Clevers H.: OLFM4 is a robust marker for stem cells in humanintestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology,2009; 137: 15-17
Google Scholar - 112. van der Flier L.G., van Gijn M.E., Hatzis P., Kujala P., HaegebarthA., Stange D.E., Begthel H., van den Born M., Guryev V., OvingI., van Es J.H., Barker N., Peters P.J., van de Wetering M., Clevers H.:Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stemcell fate. Cell, 2009; 136: 903-912
Google Scholar - 113. van Es J.H., Sato T., van de Wetering M., Lyubimova A., NeeA.N., Gregorieff A., Sasaki N., Zeinstra L., van den Born M., KorvingJ., Martens A.C., Barker N., van Oudenaarden A., Clevers H.: Dll1+secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.Nat. Cell Biol., 2012; 14: 1099-1104
Google Scholar - 114. Vermeulen L., De Sousa E.M., van der Heijden M., Cameron K., de Jong J.H., Borovski T., Tuynman J.B., Todaro M., Merz C., RodermondH., Sprick M.R., Kemper K., Richel D.J., Stassi G., Medema J.P.:Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by themicroenvironment. Nat. Cell Biol., 2010; 12: 468-476
Google Scholar - 115. Vermeulen L., Todaro M., de Sousa Mello F., Sprick M.R., KemperK., Perez Alea M., Richel D.J., Stassi G., Medema J.P.: Single-cellcloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiationcapacity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008; 105: 13427-13432
Google Scholar - 116. Wong V.W., Stange D.E., Page M.E., Buczacki S., Wabik A., ItamiS., van de Wetering M., Poulsom R., Wright N.A., Trotter M.W., WattF.M., Winton D.J., Clevers H., Jensen K.B.: Lrig1 controls intestinalstem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nat.Cell Biol., 2012; 14: 401-408
Google Scholar - 117. Yu J., Tao Q., Cheung K.F., Jin H., Poon F.F., Wang X., Li H., ChengY.Y., Röcken C., Ebert M.P., Chan A.T., Sung J.J.: Epigenetic identificationof ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1 as a functionaltumor suppressor and biomarker for hepatocellular carcinoma andother digestive tumors. Hepatology, 2008; 48: 508-518
Google Scholar - 118. Zhu L., Gibson P., Currle D.S., Tong Y., Richardson R.J., BayazitovI.T., Poppleton H., Zakharenko S., Ellison D.W., Gilbertson R.J.: Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastictransformation. Nature, 2009; 457: 603-607
Google Scholar - 119. Zhu S., Si M.L., Wu H., Mo Y.Y.: MicroRNA-21 targets the tumorsuppressor gene tropomyosin 1 (TPM1). J. Biol. Chem., 2007;282: 14328-14336
Google Scholar - 120. Zuo X., Morris J.S., Shureiqi I.: Chromatin modification requirementsfor 15-lipoxygenase-1 transcriptional reactivation in coloncancer cells. J. Biol. Chem., 2008; 283: 31341-31347
Google Scholar