Streszczenie

Białka są podstawowym elementem budulcowym organizmu człowieka. Słowo białko (proteina) pochodzi od greckiego słowa proteo, tzn. najważniejszy. Białka, bez których życie w postaci ob­serwowanej na Ziemi nie byłoby możliwe, mają ograniczony czas życia w komórce i organizmie. Ich tak zwany „okres półtrwania” jest zróżnicowany i wynosi od kilku minut do kilku dni. Białka regulatorowe pojawiają się w komórce na określony czas, są krótko żyjące. Białka zaangażowa­ne w podstawy funkcjonowania komórki są stabilne i długo żyjące. Po spełnieniu swoich funk­cji lub w przypadku nadmiaru, czy uszkodzenia, białka są eliminowane z komórki, w procesach określanych jako degradacja białek. Procesy przemian białek są ściśle kontrolowane. Istnieje też ścisła korelacja między metabolizmem białek a energetycznym stanem komórki.
Główne systemy proteolityczne w komórce to lizosomalny i proteasomalny. Pierwszy, lizosomy – organelle komórkowe, funkcjonują w sposób prosty i przejrzysty. Drugi, proteasomy, to system wysoce zorganizowany, który za pomocą ubikwityny dostarcza „etykietę molekularną” i kieruje oznakowane białko w proces degradacji.
Sprawna degradacja białek komórkowych przez szlak UPS (ubikwityna-proteasom) jest istotna dla transdukcji sygnału, regulacji transkrypcji, odpowiedzi na stres oraz kontroli czynności re­ceptorów.
Dysfunkcja szlaku UPS odgrywa rolę w rozwoju wielu chorób: nowotworowych, neurodegenera­cyjnych, o podłożu immunologicznym i infekcyjnych. Wyzwaniem zatem staje się opracowanie metod farmakologicznej interwencji w funkcjonowanie tego układu, polegających m.in. na za­stosowaniu swoistych, niskocząsteczkowych inhibitorów proteasomu i enzymów katalizujących ubikwitynację.
W pracy omówiono aktualną wiedzę, począwszy od odkrycia lizosomów – szlaku degradacji bia­łek niezależnego od ubikwityny, następnie proteasomów – szlaku zależnego od ubikwityny i zja­wiska agregacji białek oraz podsumowanie dotyczące stosowanych terapii, wykorzystujących jako podstawę procesy degradacji białek.

Słowa kluczowe: degradacja białka • lizosom • proteasom • UPS • nowotwory • choroba Huntingtona

Summary

Proteins constitute the basic building elements of living organisms. Proteins have a limited li­fetime in a cell. The so called „half-life period” of proteins is diverse and lasts from several mi­nutes to several days. Regulatory proteins appear in a cell for a definite time and are short-lived. The proteins responsible for basic cell functions are stable and long-lived. Once their func­tions are fulfilled or because of their surfeit or damage, proteins are eliminated by degradation. Transformation processes of proteins are precisely controlled. There is also a strict association between protein metabolism and the energetic state of a cell. The main proteolytic cell systems are lysosomal and proteasome ones. The first (lysosomes) function in a simple and transparent way. The second system (proteasomes) is highly organized; by using ubiquitin it delivers „mole­cular label” and sends a marked protein for degradation. Efficient degradation of cellular prote­ins by the UPS route (ubiquitin – proteasome system) is essential for signal transduction, trans­cription adjustment, response to stress and control of receptors’ activity. The dysfunction of the UPS route is crucial in the development of tumors, neurodegenerative diseases and diseases of immunological and infectious origin. Therefore, it is a challenge to elaborate methods of pharma­cological intervention within this system involving, for example, the use of specific, low molecu­lar-weight proteasome inhibitors and enzymes catalyzing the ubiquitination process. The article presents a review of advances in the field, including description of the lysosomal protein degra­dation route, proteasome model, and the phenomenon of protein aggregation. The summary of the experience on applied therapies, which use the processes of protein degradation as a basis, were also presented.

Key words:degradation of protein • lysosome • proteasome • UPS • cancers • Huntington’s disease

Wstęp

Nieraz zadawano sobie pytanie, jakie procesy muszą za­chodzić w naszej komórce, gdzie codziennie usuwanych jest 3-5% białek w organizmie zdrowym, nie wspomina­jąc o stanach patologicznych, w których ta liczba propor­cjonalnie wzrasta [8].

Długotrwałe poszukiwania, prowadzone na całym świecie przyniosły w dużej części wyjaśnienie mechanizmów de­gradacji białek w komórce. Chrystian de Duve opisał me­chanizm usuwania zbędnych w komórce białek za pomocą lizosomów, inna grupa badaczy odkryła, że w komórce ist­nieje również szlak pozalizosomalny związany z ubikwity­ną [7,8]. Odkrycie mechanizmu ubikwitynacji białek zapo­czątkowało nową erę w zrozumieniu cyklu komórkowego, podziału komórek, roli regulacyjnej czynników transkryp­cyjnych oraz mechanizmu kontroli wszystkich procesów zachodzących w komórce. Patogeneza wielu chorób, takich jak nowotwory, czy choroby neurodegeneracyjne, jest zwią­zana z utratą kontroli i wynikającymi z niej trudnościami w utrzymaniu homeostazy między biosyntezą a degrada­cją poszczególnych elementów komórki. Opisanie szlaku ubikwityno-proteasomalnego (UPS) jako precyzyjnego kompleksu o złożonej strukturze i nie mniej skompliko­wanym mechanizmie działania, pozwoliło zaprezentować go jako zintegrowaną platformę, która staje się celem te­rapeutycznym ostatnich lat w walce z licznymi chorobami.

Lizosomy

W 1955 r. Chrystian de Duve odkrył lizosomy – wewnątrz­komórkowe organelle – struktury w postaci pęcherzyków zawierających proteazy. Wówczas przedstawiono dwa typy proteolizy – endocytozę i pinocytozę, zachodzące w ko­mórce. Później wykazano, że tych typów jest więcej [8,48].

W świetle ostatnich danych literaturowych, lizosomy usuwa­ją białka zewnętrzne za pośrednictwem endocytozy, pino­cytozy i fagocytozy, zaś trawienie wewnątrzkomórkowych białek odbywa się w wyniku autofagii [7]. W obrębie au­tofagii wyróżnia się makroautofagię, mikroautofagię, au­tofagię swoistą i autofagię zależną od chaperonów [36].

W procesie makroautofagii tworzy się autofagosom, który za pomocą błony zwanej fagofor oddziela zdrową część komórki od części eliminowanej. Proces ten jest zależny od aktywności GTP-az (enzymów rozkładających guanozynotrifosforan). Fuzja autofagosomu i lizosomu prowadzi do powstania autolizosomu. Mikroautofagia to podobny proces, ale odbywający się w komórce na mniejszą skalę. Autofagia swoista (peksofagia) – to proces zachodzący w peroksysomach [36]. Natomiast autofagii zależnej od chaperonów podlegają tylko wybrane białka komórkowe, które są rozpoznawane przez białka szoku cieplnego (heat shock proteins – HSP), należące do grupy tzw. białek opiekuńczych (chaperonów). Po związaniu się kompleksu HSP i nieprawidłowego białka z receptorem błonowym lizosomu, kompleks ten jest przemieszczany do światła lizosomu, gdzie następnie ulega rozkładowi przez znajdujące się tam enzymy. Degradacja białek w wyniku autofagii stanowi jeden z mechanizmów eliminacji, m.in. alfa-synukleiny [11].

Wyodrębniono kilka postaci lizosomów: początkowe li­zosomy, w których nie zachodzi jeszcze proces trawienia; wczesne autofagalne pęcherzyki, które zawierają wewnątrz­komórkowe białka; późne (pośrednie) endosomy i fagocy­ty, zawierające elementy białkowe i wreszcie – struktury wielopęcherzykowe (multivesicular bodies – MVBs), któ­re przekształcają się w lizosomy trawienne. Ten łańcuszek zdarzeń od lizosomów początkowych do wielopęcherzy­kowych potwierdza, że proces trawienny ma swoją dyna­mikę rozwoju. Zrozumiały staje się też fakt, że niektórzy naukowcy określają lizosomy jako trawienny system pę­cherzykowy [7].

Za potwierdzeniem istnienia szlaku pozalizosomalnego przemawiają wyniki doświadczeń z zastosowaniem inhi­bitorów lizosomów, w których obserwowano zahamowa­nie degradacji długo żyjących białek, jednak pozostawało to bez większego wpływu na degradację krótko żyjących i zmutowanych białek [8]. Jak podaje Wilkinson [47] na początku lat osiemdziesiątych ub.w. I. Rose, A. Hershko i A. Ciechanover opublikowali dwa artykuły w PNAS, do­noszące o energozależnej proteolizie białek, zachodzącej po procesie ubikwitynacji z udziałem proteasomów

Ubikwitynacja

Ubikwitynacja jest potranslacyjną modyfikacją białek, która polega na połączeniu wiązaniem izopeptydowym ubikwi­tyny poprzez C-końcową resztę glicyny z grupą ε-aminową lizyny białka podlegającego modyfikacji [39].

W końcu lat siedemdziesiątych i początku osiemdziesią­tych ub.w., wykazano, że w lizatach z retykulocytów zacho­dzi zależna od ATP proteoliza białek, w której uczestniczy termostabilne białko nazwane początkowo APF-1 (ATP-dependent proteolytic factor 1), które następnie okazało się identyczne z odkrytą kilka lat wcześniej ubikwityną [17].

Ubikwityna jest polipeptydem, złożonym z 76 aminokwa­sów, o masie 8,5 kDa, występującym we wszystkich zba­danych dotychczas komórkach i tkankach organizmów eu­kariotycznych. Białko to ma międzygatunkową homologię sekwencyjną. Ubikwityna drożdży różni się od ludzkiej tyl­ko 3 resztami aminokwasowymi, jest wysoce termostabilna i odporna na szeroki zakres pH oraz polarność środowiska. Monoubikwitynacja oznacza, że białko zmodyfikowano po­jedynczą resztą ubikwityny, poliubikwitynacja zaś oznacza, że dołączone są liczne reszty ubikwityny, które tworzą łańcu­chy proste lub rozgałęzione, inaczej: multimeryczne [5,17,24].

Proces ubikwitynacji u Eukaryota jest uniwersalnym sys­temem „oznakowania” białek przeznaczonych do degra­dacji. „Oznakowanie” białka ukierunkowuje je na proces proteolizy. Ubikwitynowane białka szybko ulegają degrada­cji przez proteazy pozalizosomalne w strukturach zwanych proteasomami. W ten sposób degradowane są w cytopla­zmie białka nieprawidłowo zsyntetyzowane, źle rozmiesz­czone w strukturach subkomórkowych lub starzejące się [39]. Proces ubikwitynacji jest procesem wieloetapowym, wymagającym aktywności wielu enzymów i energii pocho­dzącej z ATP. Białko naznaczone ubikwityną nie ma szans na przeżycie, musi zostać zdegradowane.

Rozpoznanie substratu przez proteasom wymaga jego po­liubikwitynacji przez przyłączenie cząsteczek ubikwityny do lizyny w pozycji 48 substratu białkowego [5].

W pierwszym etapie działa enzym E1, tzw. enzym aktywu­jący ubikwitynę (ubiquitin activating enzyme, E1 – UBA). Wówczas przy współudziale ATP w reakcji transestryfika­cji zostaje utworzone wysokoenergetyczne wiązanie między glicyną na C-końcu ubikwityny a grupą -SH reszty cyste­inowej w centrum E1 i powstaje produkt pośredni E1-U.

Następnie cząsteczka ubikwityny jest przenoszona na resz­tę cysteinową enzymu koniugującego (ubiquitin conjuga­ting enzyme, E2 – UBC) i tworzy się E2-U. W końcowym etapie, za pomocą enzymu zwanego ligazą ubikwitynową (ubiquitin ligase, E3 – UBL) reszta ubikwityny przenoszo­na jest na substrat z utworzeniem produktu U-NH₂-białko (ryc.1) [30,31,38].

Ryc. 1. Proces ubikwitynacji białka; U – ubikwityna; ATP – adenozynotrifosforan; SH-E1 – SH reszty cysteinowej w centrum E1; E1-U, E2-U – produkty pośrednie ubikwitynacji; E3 – ligaza ubikwitynowa; E4 – czynnik elongacji łańcucha; U-NH₂-białko – ubikwitynowane białko

Działanie ligazy ubikwitynowej doprowadza do powstania wiązania izopeptydowego między aktywowanym C-końcem ubikwityny i ε-NH₂ jednej z reszt lizynowych obecnych w białku. Proces powtarza się aż białko zostanie nazna­czone połączonymi w łańcuch cząsteczkami ubikwityny

Jeśli ubikwitynacja następuje przez Lys-48, a także niekie­dy Lys-29, to pociąga za sobą skierowanie białek do pro­teasomu 26S. Wiadomo, że łańcuch przeznaczony do de­gradacji proteasomalnej musi się składać z co najmniej 4 reszt ubikwityny [5]. Pewne substraty wymagają do swej poliubikwitynacji współdziałania także czynnika elonga­cji łańcucha (E4).

Monoubikwitynacja białek lub modyfikacja przez białka ubikwitynopodobne skierowuje je do różnych kompartmen­tów komórkowych, w tym także do lizosomów, w których mogą być degradowane [17,32].

Proces ubikwitynacji jest regulowany przez enzymy deu­bikwitynujące (DUB). Enzymy te mają zdolność hydrolizy łańcuchów ubikwityny tworzonych przez kaskadę enzyma­tyczną E1-E2-E3 zarówno uwolnionych z substratów rozło­żonych przez proteasomy, jak i związanych z niezdegrado­wanymi białkami. W tym drugim przypadku, DUB mogą chronić substrat przed hydrolizą proteasomalną, mogą też skracać łańcuchy poliubikwitynowe połączone z cząstecz­kami substratu [5]. Ubikwityna kierowana jest w ten sposób do wtórnego obiegu znakowania następnego białka [39].

Ubikwityna pełni w komórce także inne funkcje, nie­związane ze szlakiem proteasomalnym, np. odgrywa rolę w regulacji procesów transkrypcyjnych, kierowaniu bia­łek z błony komórkowej do kompartmentu endosomalne­go, przemieszczaniu białek z endosomów do ciałek wie­lopęcherzykowych [5,34].

Pośredni udział ubikwityny w regulacji transkrypcji wy­daje się oczywisty, jeśli uwzględni się jej wpływ na sta­bilność białek biorących udział w tym złożonym procesie. Transkrypcja genów zachodzi w obrębie aktywnej euchro­matyny, na stan której mają wpływ histony. Histon 2A był pierwszym opisanym ubikwitynowanym białkiem. Obecnie wiadomo, że także histony H2B, H1 podlegają ubikwity­nacji i obecne są w aktywnych transkrypcyjnie regionach chromatyny. Ubikwitynacja może zmieniać strukturę hi­stonów i ich wzajemne oddziaływania, a także oddziaływa­nie z DNA i jest niezbędna do powstawania „rozluźnionej” struktury chromatyny, koniecznej do odsłonięcia rejonów promotorowych genów. Może także ułatwiać następczą me­tylację histonów i wpływać na wyciszanie genów [17,34].

Docenianie ubikwityny, jako jednego z istotnych regulatorów coraz większej liczby procesów komórkowych, rozpoczęło się ponad 20 lat temu. Okres ten przyniósł wiele odkryć, pozwalających na docenienie znaczenia procesu ubikwity­nacji, chociaż wiele zagadnień z tym związanych wyma­ga dalszych badań. Zbyt mało też jeszcze wiadomo o pro­cesach deubikwitynacji białek, czy też o działaniu białek pokrewnych ubikwitynie. Niemniej jednak wydaje się już niemal pewne, że ubikwitynacja stanowi równie ważną mo­dyfikację białek, tak jak ich fosforylacja, czy metylacja [17].

Proteasom

W 2004 roku doceniono wieloletnie badania i uhonorowano Nagrodą Nobla z dziedziny chemii trzech badaczy Avrama Hershko i Aarona Ciechanovera z Izraela oraz Irwina Rose z USA – za odkrycie ubikwityno-proteasomalnej degrada­cji białek, procesu ściśle regulowanego i swoistego w sto­sunku do białkowego substratu, jego lokalizacji komórko­wej i momentu, w którym ma nastąpić degradacja [5,17].

Proteasomy oczyszczono po raz pierwszy w 1980 roku z wołowych przysadek mózgowych. Są to złożone kom­pleksy białkowe o stałej sedymentacji. Ze względu na to, iż proteasomy w obrębie jednego kompleksu wykazują różne aktywności enzymatyczne, początkowo nazwano je wielokatalicznymi kompleksami proteaz MPC (multicata­lytic proteinase complex). Nazwę proteasom zapropono­wano w 1988 roku [5].

Proteasomy eukariotyczne występują w 2 podstawowych postaciach: 20S i 26S. Proteasom 20S nie jest zdolny do proteolizy ubikwitynowanych białek komórkowych i nie wykazuje aktywności ATP-azowej. Proteasom 26S ma zdolność hydrolizy białek połączonych z łańcuchami ubi­kwityny [5], a centrum aktywności ATP-azowej znajduje się w podstawie aktywatora kompleksu.

Proteasom 26S (1500-2000 kDa) składa się z rdzeniowego kompleksu katalitycznego 20S około 700 kDa (core par­ticle – CP) i kompleksu regulatorowego 19S (regulatory particie – RP, activator PA700) [5,24].

Proteasom 20S jest zbudowany z 4 pierścieni, które tworzą strukturę cylindryczną. Każdy pierścień składa się z 7 różnych podjednostek, których masa cząsteczkowa waha się między 20 i 35 kDa. Zewnętrzne pierścienie są zbudo­wane z 7 podjednostek α (α1-α7) każdy, a dwa pierścienie wewnętrzne – z 7 różnych podjednostek β (β1-β7). Rolę w utrzymaniu połączenia między pierścieniami β odgrywa podjednostka β7. U drożdży oddziaływanie między COOH-końcowym fragmentem tej podjednostki a podjednostka­mi β1 i β2 z przeciwległego pierścienia β wpływa na sta­bilizację proteasomu. NH₂-końcowe fragmenty łańcuchów podjednostek α zamykają kanał wiodący do wnętrza prote­asomu (α-bramka). Do otwarcia kanału i aktywacji prote­asomu może dojść wskutek połączenia z aktywatorem lub chemicznie, np. pod wpływem SDS [5,24,46].

Proteasom 20S konformacyjnie jest strukturą elastyczną. Aktywne miejsca katalityczne są umiejscowione na wewnętrz­nej powierzchni cylindra, do której są wiązane substraty biał­kowe. Wszystkie podjednostki α i większość β są nieaktywne enzymatycznie, oprócz podjednostek β1, β2 i β5, które mają centra aktywne. Różnią się one między sobą wrażliwością na inhibitory i pH optymalnym dla swej aktywności. W ko­mórce większość wśród proteasomów stanowi postać 20S.

W badaniach in vitro wyróżniono 3 podstawowe aktywno­ści proteasomu 20S: chymotrypsynopodobną (β5), trypsy­nopodobną (β2) i kaspazopodobną (β1).

Proteasom nie jest zgrupowaniem niezależnych od siebie podjednostek, tylko funkcjonalną całością, w której na pod­jednostki katalityczne oddziałują podjednostki sąsiadują­ce. U drożdży COOH-końcowy fragment podjednostki β7, tworzący kilka wiązań wodorowych z podjednostką β1, po­przez stabilizację centrum aktywnego podjednostki β1, jest konieczny dla aktywności kaspazopodobnej. Jedynie pod­jednostka β5 proteasomu może występować jako wolna [5].

Proteasom 26S powstaje przez połączenie proteasomu 20S z kompleksem aktywatora PA700 (19S) (ryc. 2). Białka zna­kowane ubikwityną są rozpoznawane przez kompleks re­gulatorowy 19S, w związku z czym pełni on dwojaką rolę – rozpoznaje ubikwitynowane białko, ale także otwiera ka­nał do cylindra proteasomu 20S. Takie działanie wymaga energii ATP-azy o aktywności chaperonopodobnej u pod­stawy regulatora, ponieważ powinno nastąpić rozwinięcie substratu białkowego i wprowadzenie go do wewnętrz­nych przedziałów cylindra. Kanał wejściowy jest strze­żony przez bramkę molekularną, tj. N-końcowy fragment łańcucha podjednostki α3. Białka wchodzące do komory wewnętrznej ulegają hydrolizie w aktywnych miejscach proteolitycznych, w podjednostkach b na małe polipepty­dy o długości 3-22 aminokwasów [24].

Ryc. 2. Proces degradacji białka w proteasomie; U – ubikwityna; AA – aminokwasy

Aktywator PA700 (19S) składa się z podstawy (base) i wieczka (lid). W skład podstawy aktywatora wchodzi pierścień 6 ATP-az nazywanych Rpt (Rpt1-Rpt6) i 3 pod­jednostki niemające aktywności ATP-az (Rpn1, Rpn2, Rpn10). Podstawa ma aktywność ATP-azową, a wiecz­ko wykazuje się jej brakiem i składa się z podjednostek: Rpn3, Rpn5-Rpn9, Rpn11, Rpn12, UCH37. Białko enzy­matyczne UCH37 – hydrolaza C-końca ubikwityny (ubi­quitin C-terminal hydrolase) – tworzy kompleks z podjed­nostką Rpn12. UCH37 jest integralnym składnikiem PA700 u ssaków i Drosophila, natomiast nie stwierdza się tej pod­jednostki u drożdży [5].

Podjednostki podstawy pełnią różnorodne funkcje. Podjednostki Rpt biorą udział w wiązaniu i rozwijaniu substratów białkowych. Rpn10 wiąże ubikwitynowany substrat poprzez domenę UIM (ubiquitin-interacting mo­tif). Rpt 2 bierze udział w otwarciu kanału proteasomu 20S zamkniętego NH₂-końcem łańcuchów podjednostek a. Podjednostka Rpt 2 uczestniczy w procesie przemiesz­czania substratu do cylindra proteasomu i uwalnianiu z nie­go produktów. Rpn4 i Rpn6 są niezbędne do prawidłowe­go funkcjonowania proteasomu 26S [5].

W literaturze spotyka się doniesienia o istnieniu immu­noproteasomów.

Interferon γ (IFN-γ) indukuje w komórkach syntezę pod­jednostek proteasomalnych oraz podjednostek aktywato­ra PA28 (11S) o składzie podjednostek α3β4. Aktywator ten pełni podobną aktywującą rolę, z tym że aktywuje hy­drolizę peptydów, a nie białek [5].

Znaczenie szlakuubikwityno-proteasomalnego

Sprawna degradacja białek komórkowych przez szlak ubi­kwityna-proteasom jest istotna dla transdukcji sygnału, regulacji transkrypcji, odpowiedzi na stres oraz kontro­li czynności receptorów. Szlak ten kontroluje aktywację czynnika jądrowego NF-κB przez degradację jego inhi­bitora. Proteasom odgrywa również ważną rolę w prezen­tacji antygenu. Zaburzenia funkcjonalne układu UPS na­ruszają równowagę między białkami regulatorowymi, co wywołuje zablokowanie cyklu komórkowego w fazie G1-S i G2-M oraz apoptozę [24].

W większości białek, które są degradowane na szlaku UPS charakteryzują się obecnością na N-końcu cząsteczki tzw. degronów, czyli określonych sekwencji aminokwasowych pełniących funkcje destabilizujące i zawierających reszty lizynowe, do których jest dołączany łańcuch poliubikwi­tynowy (ryc. 2) [7].

Do precyzyjnego rozpoznawania białkowych substratów przez enzymy ubikwitynowe przyczyniają się też liczne modyfikacje potranslacyjne, z których najczęściej opisy­wane są fosforylacja i hydroksylacja określonych reszt ami­nokwasowych. Ułatwiają one lub często są wręcz niezbęd­ne do rozpoznawania białek przez odpowiednie ligazy [7].

Degradacji przez szlak UPS ulegają zarówno białka regu­latorowe, jak i supresory nowotworowe [24].

Deregulacja układu UPS prowadzi do wielu schorzeń. Warto podkreślić, że dysfunkcja proteasomu może mieć dwie postaci: następuje drastyczny wzrost aktywności lub jej zmniejszenie. Lista chorób związana z utratą prawidło­wego funkcjonowania proteasomu zawiera różne choro­by, niektóre z nich są dziedziczone, a inne nabyte. W po­szczególnych przypadkach są związane bezpośrednio lub pośrednio z zaburzeniami układu UPS. Dotyczy to głów­nie schorzeń nowotworowych, w których obserwuje się wzrost aktywności proteasomu, takich jak: rak płuc, okręż­nicy, jajnika, nerki, czy białaczce mieloblastycznej [40].

Wśród chorób neurodegeneracyjnych związanych z zabu­rzeniami układu UPS, wymienia się choroby Alzheimera, Parkinsona, Huntingtona, prionowe, a także ataksje rdze­niowo-móżdżkowe. Osłabienie funkcjonalności UPS ob­serwuje się również w zakażeniach wirusami HIV, HBV, a także chorobie Wilsona, anemii Fanconiego i innych [40].

Zaburzenia szlaku UPS odgrywają ważną rolę w rozwo­ju nowotworów, chorób neurodegeneracyjnych, o podło­żu immunologicznym i infekcyjnym. Wyzwaniem zatem staje się opracowanie metod farmakologicznej interwen­cji w funkcjonowanie tego układu, m.in. polegających na zastosowaniu swoistych, niskocząsteczkowych inhibito­rów proteasomu i enzymów katalizujących ubikwityna­cję. Myśli się również o precyzyjnym kierowaniu wybra­nych białek na drogę proteolizy z użyciem syntetycznych chimerycznych białek adaptorowych [7,24].

UPSa agregacja białek

Zaburzenia homeostazy białek komórkowych, prowadzą­ce do ich agregacji, stanowią wspólne ogniwo w patome­chanizmie wielu chorób neurodegeneracyjnych. Główną przyczyną tego zjawiska są liczne mutacje w genach lub nieprawidłowości występujące w potranslacyjnych mody­fikacjach białek. Zaburzenia struktury przestrzennej biał­ka mogą też wystąpić pod wpływem różnych czynników uszkadzających komórkę, takich jak np. stany niedokrwie­nie oraz stany zapalne i urazy [11].

Agregacja nieprawidłowo pofałdowanych lub uszkodzo­nych białek jest istotnym zjawiskiem odgrywającym rolę w mechanizmach neurodegeneracyjnych. Sama akumula­cja patologicznych białek w komórce nie wyjaśnia jeszcze mechanizmu ich agregacji. Białka o nieprawidłowej struktu­rze przestrzennej charakteryzują się obecnością dużej licz­by struktur typu β o silnie hydrofobowych właściwościach. Cząsteczki o takiej budowie przestrzennej mają tendencję do autoagregacji. Powstanie nierozpuszczalnych makromolekuł białkowych zachodzi w sposób uporządkowany w wyniku zarodkowania (nukleacji), której przebieg jest podobny do procesu krystalizacji. Czynnik wyzwalający zarodkowanie nie został jeszcze poznany. Zarodkowanie rozpoczyna się od wytworzenia jądra agregacji zbudowanego z oligome­rów białkowych, wokół którego agregują monomery pep­tydowe. W ten sposób tworzą się początkowo małe struk­tury włókienkowe, tzw. protowłókienka (protofilamenty), a potem większe filamenty. Zarodkowanie i agregacja są procesami energochłonnymi, niekorzystnymi z punktu wi­dzenia kinetyki komórki. Dlatego zachodzą one bardzo po­woli, co może wyjaśniać pojawienie się objawów niektó­rych chorób dopiero w średnim i starszym wieku [11,37].

W ciągu ostatnich lat pojawiło się wiele prac, w których wykazano, że za zwyrodnienie komórek nie są odpowiedzialne same złogi, lecz pośrednie formy strukturalne powstające podczas stopniowo przebiegającego procesu agregacji białek. Duże złogi białkowe są prawdopodobnie nieaktywne lub odgrywają rolę cytoprotekcyjną, zapobiegając poprzez izolację nieprawidłowych białek ich interakcji z innymi składnikami komórki. Neurotoksyczny wpływ na komórkę mogą natomiast wywierać protowłókienka i rozpuszczalne oligomery białkowe. Mogą one wpływać na funkcje kanałów jonowych i powodować wzrost przepuszczalności błon komórkowych, jak to prawdopodobnie się dzieje w chorobie Parkinsona i Huntingtona lub też oddziaływać na inne struktury komórki i wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe, zaburzając przepływ informacji. Przykładem tego ostatniego zaburzenia jest zahamowanie aktywności transkrypcji przez zmutowaną huntingtynę [11,37].

Zbyt mała wydajność ubikwitynozależnych mechanizmów eliminujących może odgrywać istotną rolę w patogenezie chorób neurodegeneracyjnych, w których stwierdza się od­kładanie agregatów białkowych. Prowadzi to do akumula­cji patologicznych białek, dysfunkcji komórki, a następnie jej śmierci. Ze względu na to, że zarówno do ubikwitynacji białka, jak i do jego degradacji w proteasomach potrzeb­na jest energia magazynowana w ATP, istnieje potencjalna możliwość, że odkładanie się agregatów białkowych może być spowodowane spadkiem syntezy ATP na skutek de­fektu mitochondrialnych łańcuchów oddechowych [11,44].

Modulacja funkcji proteasomu

Czynniki regulatorowe zaangażowane w modulację ak­tywności proteasomu sklasyfikowano w poszczególne gru­py, przede wszystkim są to aktywatory i inhibitory. Huang i Chen [20] donoszą o 3 typach komórkowych aktywato­rów: PA 28, PA 200, PA 700. Autorzy wspominają również o kwasach: linolenowym, linolowym, betulinowym. W ob­rębie inhibitorów rozróżnia się 2 grupy: niskocząsteczko­we związki pochodzące z syntezy chemicznej oraz inhi­bitory pochodzenia naturalnego, takie jak tyropeptin A, TMC-86, TMC-89, TMC-95A, PR-171 [20].

W celu opracowania kontrolowanego zahamowania aktyw­ności proteasomu, podjęto wiele prób syntezy związków chemicznych o spodziewanym działaniu w tym kierunku.

Najczęściej stosowane in vitro grupy inhibitorów to alde­hydowe formy peptydów (np. PSI, MG132, MG115, CEP-1612), epoksyketony (np. epoksomycyna, eponemycyna) oraz laktacystyna i jej pochodne (np. PS-519). Inhibitory te w komórkach wielu linii nowotworowych powodują za­hamowanie cyklu komórkowego i apoptozę [40].

Jak podaje Jurczyszyn i wsp. [24] laktacystyna (nieod­wracalny inhibitor podjednostki β) indukuje apoptozę w ludzkich komórkach monoblastycznych U937, nato­miast Shinohara i wsp. odnotowali, że benzylooksykarbo­nylo-(Z)-Leu-Leu-leucynal – tripeptydo-aldehyd – inhi­bitor proteasomu, indukuje w komórkach białaczkowych apoptozę zależną od białka p53. Podobne badania dostar­czyły dowodów na to, że proteasom jest ważnym celem w terapii przeciwnowotworowej, jednak dostępnym inhi­bitorom brakuje swoistości.

Zaprojektowano i stworzono kilka związków będących pochodnymi kwasu boronowego. Większość z tych inhi­bitorów proteasomu wykazała aktywność w obrębie pane­lu 60 nowotworowych linii komórkowych zgromadzonych w Narodowym Instytucie Raka (NCI) w USA. Na podsta­wie swoistości działania oraz efektu cytotoksycznego wy­brano bortezomib jako najlepszy związek do dalszych ba­dań klinicznych [5,24].

Bortezomib (kwas N-pyrazynokarbonylo-L-fenyloalanino-L-leucyno-boronowy; inne nazwy PS-341, MLN-341, di­peptyd kwasu boronowego), jest unikatowym i swoistym inhibitorem szlaku UPS. Hamuje proteasom szybko i w spo­sób odwracalny przez bezpośrednie wiązanie do kompleksu 26S i blokowanie aktywności enzymatycznej. Jest pierw­szym inhibitorem proteasomu, stosowanym w praktyce kli­nicznej. Aktywność bortezomibu wykazano w wielu ty­pach nowotworów, co podnosi jego wartość terapeutyczną. Dlatego też lek z tą substancją czynną został zarejestrowa­ny w ciągu zaledwie kilku miesięcy, w 2003 r. jednocze­śnie we wszystkich krajach UE, ze wskazaniami do lecze­nia opornego szpiczaka mnogiego (MM).

Bortezomib w terapii przeciwnowotworowej działa po­przez indukcję apoptozy, będącej następstwem zahamo­wania proteasomu (ryc. 3). Leżące u podłoża wywołanej apoptozy mechanizmy, obejmują inhibicję NF-κB wiążą­cą się ze zwiększeniem aktywności szlaków apoptotycz­nych oraz oddziaływaniem na mikrośrodowisko nowotworu. Oprócz indukcji apoptozy bortezomib zmniejsza ekspre­sję insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 i receptora in­sulinopodobnego czynnika wzrostu 1. Hamuje również in­dukowaną przez IL-6 aktywację szlaku Ras/Raf/MAPK, co prowadzi do zahamowania wzrostu komórek szpicza­ka mnogiego [24,41].

Ryc. 3. Regulacja proteasomu przez inhibitor bortezomib; NF-κB – czynnik transkrypcyjny; IκBα – inhibitor NF-κB; p50/p65 – heterodimer czynnika transkrypcyjnego NF-κB; U – ubikwityna

Rodzina białek Rel/NF-κB to indukowalne dimeryczne czynniki transkrypcyjne rozpoznające i wiążące wspól­ny motyw sekwencji w jądrowym DNA. NF-κB – głów­ny czynnik transkrypcyjny z tej rodziny, jest heterodime­rem p50/RelA (p50/p65) obecnym w cytoplazmie prawie wszystkich komórek. Sekwencja κB znajduje się w ob­rębie genów, wśród których można wyróżnić następują­ce kategorie:
1) geny istotne dla procesów odpowiedzi immunologicz­nej i procesów zapalnych;
2) geny istotne dla procesów apoptozy i proliferacji komórek;
3) geny regulujące aktywność NF-κB, aktywowane za po­średnictwem sprzężenia zwrotnego [16].

W cytoplazmie NF-κB jest połączony z podjednostką in­hibitorową IκBα i stanowi postać nieaktywną. W wyniku działania bodźca stresującego, aktywacji ulegają kaskady sygnałowe prowadzące do aktywacji kinaz IKK i następuje fosforylacja IkBa [24]. Fosforylacji ulegają dwie reszty se­rynowe IκBα w N-końcowej domenie – Ser-32 i Ser-36. Ufosforylowane miejsca w IκBα są następnie rozpozna­wane przez ligazę ubikwityny SCF, co prowadzi do ubi­kwitynacji, a następnie degradacji inhibitora z udziałem proteasomu 26S i uwolnienia podjednostek p50 i p65 czyn­nika transkrypcyjnego NF-κB. Odłączenie IκBα powodu­je odsłonięcie sekwencji NLS i translokację podjednostek do jądra komórkowego, gdzie wiążą się ze swoistym miej­scem w cząsteczce DNA o wielkości 10 par zasad, regulu­jąc transkrypcję genów [24,41].

Bortezomib hamuje aktywność NF-κB w komórkach przez blokowanie degradacji IκBα. Inhibicja aktywności trans­krypcjnej NF-κB odgrywa korzystną rolę w etiologii no­wotworów przez zmniejszenie ekspresji różnych czynników wzrostu, przeżycia i angiogenezy. Następuje uwalnianie cy­tochromu c, aktywacja kaspazy 9 i apoptoza [24].

Bezpieczeństwo i skuteczność bortezomibu w leczeniu opornego szpiczaka mnogiego (MM) oceniano na podsta­wie badań klinicznych II fazy: badania CREST i badania SUMMIT. Wyniki osiągnięte w obu badaniach były po­równywalne. Badanie SUMMIT przeprowadzono w gru­pie 202 pacjentów z 14 ośrodków USA, uczestniczących wcześniej w co najmniej 2 programach leczenia oraz w gru­pie chorych, u których mimo leczenia obserwowano po­stęp choroby. Chorym podawano bortezomib w dawce 1,3 mg/m² powierzchni ciała, 2 razy w tygodniu przez 2 tygo­dnie. Leczenie powtarzano po tygodniowej przerwie, łącz­nie do 8 cykli. Odpowiedź na leczenie polegająca na cofa­niu się objawów choroby wynosiła 35%, przy czym u 10% chorych osiągnięto pełną remisję. Całkowita odpowiedź na leczenie (remisje kliniczne + stabilizacja procesu nowotwo­rowego) wynosiła 59%. Mediana czasu do wystąpienia od­powiedzi na leczenie wynosiła 38 dni. Mediana czasu trwa­nia odpowiedzi na bortezomib wyniosła 12 miesięcy [15].

Podjęto również próby terapii skojarzonej. We wstępnych do­niesieniach dotyczących połączenia bortezomibu z melfalanem w MM obserwowano synergizm działania obu leków przy jed­noczesnym korzystnym zmniejszeniu dawki każdego z nich.

Wstępne wyniki sugerują, że połączenie bortezomibu z pegylowaną doksorubicyną również zasługuje na dal­sze badania ze względu na obserwowane współdziałanie obu związków [24].

Obecnie trwają badania kliniczne fazy II bortezomibu w połączeniu, m.in. z gemcytabiną, docetakselem i iry­notekanem [24]. Subhankar Paul [40] wykazał, że połą­czenie bortezomibu z epoksomycyną wpłynęło na nasile­nie apoptozy w komórkach białaczkowych AML (acute myeloid leukemia).

Osiągnięcia w zwalczaniu szpiczaka mnogiego za po­mocą bortezomibu są niewątpliwie punktem odniesienia do opracowania nowych terapii przeciwnowotworowych. Kilkuletnie badania naukowe pozwoliły wyselekcjonować związek, który wykazał skuteczność. Współczesne po­szukiwania synergizmu działania trwają i są skierowane w stronę innowacji, które pozwoliłyby stworzyć bardziej swoisty i bezpieczny lek. To, że mechanizm inhibicji pro­teasomalnej jest rzetelnie opisany, pomaga w sposób przej­rzysty obserwować rozwój badań naukowych. Bortezomib daje dużą nadzieję na pokonanie lekooporności, występu­jącej przy stosowaniu konwencjonalnej chemioterapii i za­pewne może stanowić punkt wyjścia do rozwoju bardziej skutecznych strategii terapeutycznych.

Chociaż sukces kliniczny bortezomibu sprzyja stosowaniu go w praktyce, jednak towarzysząca mu toksyczność (bo­lesna neuropatia obwodowa, trombocytopenia) skłania do dalszych poszukiwań.

Jak dotąd, doniesienia naukowe sugerowały, że pierwszo­rzędną rolę w przebiegu degradacji białka odgrywa aktyw­ność chymotrypsynopodobna proteasomu 26S. Kisselev i wsp. [25] zdecydowali się przebadać wszystkie trzy ak­tywności proteasomu 26S, mianowicie chymotrypsynopo­dobną (Ch), kaspazopodobną (K) i trypsynopodobną (T). W eksperymencie zastosowano kilka inhibitorów: borte­zomib, epoksomycynę, β-lakton klasto-laktacystyny oraz związki NLVS i MG-262. Jako substratu użyto długo ży­jących białek, których hydroliza przebiega liniowo, tj.: ka­zeiny, owoalbuminy, histonów, kalmoduliny.

Okazało się, że inaktywacja Ch aktywności hamuje de­gradację protein o 11-50%, inaktywacja K aktywności o 12-22%, a inaktywacja T aktywności o 3-35%.

Na podstawie wyników badacze stwierdzili, że wszyst­kie trzy aktywności biorą udział w degradacji białka. Eksperyment pozwolił też określić swoistość oddziały­wania inhibitorów.

Stosowany już bortezomib w 70% hamuje Ch, w 20% ak­tywność K i w 10% hamuje T aktywność. Interesujące wy­niki uzyskano w przypadku epoksomycyny, która reduko­wała o 85% Ch aktywność i o 28% hamowała T aktywność. Opracowany modyfikowany peptyd epoksomycyny ozna­czony pierwotnie symbolem PR-171, a następnie określony jako karfilzomib stanowił przedmiot dalszych badań [10,29].

Skomplikowany mechanizm działania PR-171 opisali Demo i wsp. [10]. Inhibitor w swojej budowie zawiera epoksydo­wy keton, który stereoselektywnie reaguje z katalityczną resztą treoniny, obecną w cząsteczce proteasomu i nieod­wracalnie go blokuje. Badania krystalograficzne pokazu­ją, że epoksomycyna tworzy podwójne kowalencyjne wią­zanie między adduktem morfolinowym a proteasomem, co wymaga zbliżenia grup hydroksylowej i α-aminowej reszty treoniny. Ten unikatowy mechanizm zapewnia dużą swo­istość inhibitora.

PR-171 aktualnie znajduje się w I fazie badań klinicznych jako potencjalny lek stosowany w terapii szpiczaka mnogiego (multiple myeloma, MM) i NHL (non-Hodgkin lymphoma).

Jak wykazały badania, po 2-5 dniach podawania karfil­zomibu następowało obniżenie aktywności proteasomu o ponad 80%. Nie zanotowano, jak dotąd efektów wska­zujących na toksyczność ostrą. Takie cechy, jak tolerancja, skuteczność i elastyczność dawki zdecydowały o skiero­waniu tego inhibitora do badań klinicznych.

Autorzy przebadali proapoptotyczny wpływ karfilzomibu, sto­sując różne stężenia inhibitora i badając efekt apoptogenny w ludzkich komórkach szpiczaka mnogiego ANBL-6. Okazało się, że następował wzrost enzymów finalnej fazy apoptozy kaspaz 8, 9 i 3. Obserwowano też obniżenie transmembra­nowego potencjału mitochondrialnego i uwolnienie proapop­totycznych białek, takich jak cytochrom c i Smac/DIABLO. Oprócz tego nastąpiła aktywacja kinazy JNK. Jak wynika z przeprowadzonych badań, karfilzomib wykazuje syner­giczny działanie z deksametazonem (dexamethasone, Dex).

Na uwagę zasługuje również inny inhibitor – salinosporamid A, zwany również marizomibem lub NPI-0052. Związek ten jest izolowany z bakterii Salinispora tropica i stano­wi modyfikowaną pochodną laktacystyny [6,10]. Inhibitor ten hamuje nieodwracalnie aktywność proteasomu w ludz­kich komórkach szpiczaka mnogiego (MM) in vitro i in vivo, jednak według innego mechanizmu niż bortezomib.

Fenomenem inhibitora jest to, że NPI-0052 indukuje apop­tozę w komórkach MM wrażliwych i opornych na bortezo­mib. Badania sugerują, że NPI-0052 efektywniej niż bor­tezomib hamuje NF-κB.

Mechanizm działania NPI-0052 jest związany z udziałem TNF w szlaku sygnałowym NF-κB [1,42]. Wiadomo, że NPI-0052 blokuje TNF-zależną IκB degradację, wstrzy­muje translokację p65 do jądra i tym samym hamuje eks­presję genów zależnych od NF-κB, w tym genów antyapop­totycznych. Zahamowanie aktywacji NF-κB za pomocą NPI-0052 prowadzi do nagromadzenia ufosforylowanej postaci IκB, jej ubikwitynacji i w konsekwencji do inhibi­cji aktywności proteasomu. Ostatnie badania sugerują, że aktywacja apoptozy za pośrednictwem NPI-0052 następu­je przede wszystkim przez uwolnienie FADD-kaspazy 8.

Wykazano, że NPI-0052 hamuje też ekspresję białek, takich jak: cyklina D1, COX-2,c-myc, MMP-9, ICAM-1,VEGF.

Według ostatnich doniesień NPI-0052 wykazuje synergiczny efekt z talidomidem (thalidomide) i bortezomibem, co może być obiecujące w przyszłości w terapii szpiczaka mnogiego.

Niewątpliwie badania nad inhibitorami proteasomu, pro­wadzone z coraz większym zaangażowaniem zaowocują nowymi odkryciami. Jest to płaszczyzna dla nowych wy­zwań stawianych naukowcom. Dotychczasowe wyniki do­brze rokują w walce z nowotworami. Modulacja aktyw­ności proteasomu stanowi cel strategiczny nowoczesnych terapii przeciwnowotworowych.

Choroba Huntingtona

Choroba Huntingtona (Huntington’s disease – HD) jest postępującą zwyrodnieniową chorobą OUN, której towa­rzyszą zaburzenia ruchowe, otępienie oraz zaburzenia psy­chiczne. Choroba jest rozpoznawana na podstawie testów genetycznych, badań neuroobrazowych oraz badań neu­ropsychiatrycznych.

Chorobę po raz pierwszy opisał w 1872 roku amerykański lekarz George Huntington. Jako cechę charakterystyczną wyróżnił występowanie ruchów pląsawiczych, które począt­kowo obejmują tylko ograniczone grupy mięśni, z czasem nasilają się i ogarniają wszystkie mięśnie szkieletowe. Chód staje się upośledzony, niezgrabny, mowa niewyraźna, poja­wiają się problemy z połykaniem. W wariancie młodzień­czym zaburzenia ruchowe występują w postaci sztywności z kinezą, a klasyczne ruchy pląsawicze są rzadkie. Szybko u tych pacjentów dochodzi do zespołu otępienia, występu­ją także drgawki. W zaawansowanych stadiach choroby do­chodzi do znacznego wyniszczenia organizmu, chory traci zdolność słownego komunikowania się z otoczeniem, nie rozpoznaje członków rodziny, jest zobojętniały, niezdolny do samodzielnego funkcjonowania [12,28]

HD dziedziczy się w sposób autosomalny dominujący, jest chorobą spowodowaną mutacją genu HTT umiejscowionego na krótkim ramieniu chromosomu 4 (4p. 16.3). Prawidłowy gen koduje białko huntingtynę (HTT). Defekt polega na pa­tologicznym zwiększeniu liczby trójek aminokwasów – CAG powyżej 36 reszt (polyQ). Zwiększenie powtórzeń trójek CAG, umiejscowionych w eksonie 1 genu zmienia konfor­mację huntingtyny przez wydłużenie poliglutaminowego segmentu blisko zakończenia NH₂. Zmutowane białko za­burza wiele procesów komórkowych na poziomie moleku­larnym i biochemicznym, szczególnie określonych obszarów OUN, następuje obumieranie komórek nerwowych i w ich następstwie upośledzenie przekazywania sygnałów do ko­mórek mięśniowych [27]. Częstość występowania HD w po­pulacji ogólnej szacuje się 2-10/100000 przypadków [35].

Badania obrazowe struktur mózgu w HD ujawniają u więk­szości pacjentów zmniejszoną wielkość jądra ogoniastego. Wzgórze oraz przyśrodkowe struktury skroniowe zmniej­szają się, dochodzi również do wyraźnego zwyrodnienia istoty białej. Badania z użyciem znakowanej glukozy me­todą PET wykazują zmniejszoną aktywność metaboliczną w jądrze ogoniastym. Zarówno korowy, jak i podkorowy spadek metabolizmu oraz zmniejszona perfuzja są uważa­ne za objaw postępującej choroby [28]. W HD występuje około 30% zmniejszenie masy mózgu [2].

Mimo postępów w rozumieniu etiopatogenezy choroby, jak dotąd nie opracowano skutecznego przyczynowego lecze­nia. Istnieje sporo danych na temat objawowego leczenia zaburzeń występujących w przebiegu HD. Diagnostyka tego schorzenia opiera się na analizie genetycznej DNA, tj. wykrywaniu mutacji w genie HTT, co w rodzinach chorych stwarza szansę na wczesną interwencję terapeu­tyczną. Mimo licznych wysiłków badaczy nie zanotowa­no jednak takich postępów w tej dziedzinie, które można by przełożyć na praktykę kliniczną [35].

Naukowcy, jak dotąd, opracowali dwie robocze hipotezy zdarzeń, powodujących neurodegenerację tkanki mózgo­wej w chorobie HD. Pierwsza hipoteza zakłada, że pato­logiczna huntingtyna w pewien sposób prowadzi do upo­śledzenia wytwarzania energii w niektórych komórkach, co powoduje ich większą podatność na toksyczne skutki chemicznych substancji przekaźnikowych w mózgu. Druga hipoteza zaś zakłada, że zmutowana HTT dostaje się do jądra komórkowego, co prowadzi do śmierci komórki ner­wowej [22]. Ostatnie doniesienia wskazują, że patogene­za HD jest związana z dysfunkcją transkrypcji i upośle­dzeniem metabolizmu energetycznego. Przypuszcza się, że przyczyną objawów choroby są zaburzenia procesów transkrypcyjnych, wynikające z oddziaływania na neurony podwyższonego w HD poziomu glutaminianu oraz utratą prawidłowych funkcji mózgu i agregacją HTT [9,13,14,33].

Białko huntingtyna

Rola prawidłowej, jak i zmutowanej huntingtyny, jak dotąd wciąż pozostają do końca niewyjaśnione. HTT jest dużym białkiem, złożonym z 3141 aminokwasów (350 kDa), roz­puszczalnym w cytoplazmie. Białko to jest związane z cy­toszkieletem komórki oraz pęcherzykami synaptycznymi, pełniąc ważną rolę w transporcie pęcherzykowym i akso­nalnym oraz transporcie cytoplazmatycznym. Za pomocą technik biochemicznych i fluorescencyjnych białko jest widoczne w retikulum endoplazmatycznym (ER), w ją­drze lub może się przemieszczać między cytoplazmą i ją­drem. W badaniach proteomicznych wykazano obecność HTT we frakcji membranowej mózgu. Badania z użyciem monoklonalnych przeciwciał wskazują, że większość HTT jest umiejscowiona w cytoplazmie i ER w strefie przyją­drowej [1]. HTT ma konserwatywny region – 18 amino­kwasów od N-końca, stanowiący amfipatyczną α-helisę z potencjalnymi miejscami włączenia się do interakcji membranowej. Wiadomo, że huntingtyna wiąże się z wie­loma białkami związanymi z transmisją sygnałów nerwo­wych i apoptozą, m.in. z HAP-1, HIP 1, GAPDH, kalmo­duliną. Przypuszcza się, że huntingtyna też pełni istotne funkcje w procesie embriogenezy [2].

Prawidłowe białko HTT nie jest toksyczne, dopiero po­przez mutacje nabywa toksycznej aktywności względem komórki. Uważa się, że toksyczny efekt zmutowanej hun­tingtyny może być spowodowany nasiloną aktywnością tego białka lub pojawieniem się jego nowych właściwo­ści, prowadzących do zmian konformacyjnych w cząstecz­ce huntingtyny oraz do zmian jej oddziaływania z inny­mi białkami. HTT staje się bardziej podatna na działanie enzymów proteolitycznych, m.in. kaspazy 3. Uwolniony proteolitycznie N-koniec HTT ulega translokacji do ją­dra komórkowego, stanowiąc rdzeń, wokół którego two­rzą się nierozpuszczalne kompleksy, powodujące degene­rację neuronów [19]. W wyniku zwiększenia liczby reszt poliglutaminowych dochodzi do hiperagregacji hunting­tyny i formowania nierozpuszczalnych wtrętów między- i śródkomórkowych (w tym – w obrębie jądra komórkowe­go), w wyniku czego następuje śmierć komórki. Agregaty zmutowanego białka mogą zakłócać procesy wewnątrzko­mórkowe, takie jak transkrypcja, translacja, transport cy­toplazmatyczny i aksonalny oraz wzajemne oddziaływa­nie białek komórkowych. [33,35].

Eksperymentalnie potwierdzono, że aktywność N-końca jest ważna tak w powstaniu agregatów polyQ, jak i w mo­dulacji toksyczności. W badaniach z użyciem zmutowane­go białka HTT obserwowano wzrost ilości HTT w jądrze wraz z bardzo zwiększoną toksycznością, chociaż bez po­wstawania agregatów. W eksperymencie tym dodatkowo wprowadzono punktową mutację na odcinku 1-18 amino­kwasowym. Stwierdzono, że obecność N-końca w białku, jest niezbędna do połączenia z ER [2,21].

Potwierdzeniem zachodzącego procesu agregacji w ko­mórce o różnych stopniach toksyczności są wyniki dostar­czone przez Bhutani i wsp. [4]. Agregaty powstałe z nie­wielkich fragmentów polyQ charakteryzują się większą toksycznością niż większe agregaty; potwierdzają to wy­niki badań próbek, pobranych z mózgów pacjentów z HD post mortem. Najprawdopodobniej krótkie polyQ, two­rząc toksyczne postaci HTT, mogą łatwiej się łączyć z in­nymi białkami, upośledzając funkcje komórki. Agregaty także upośledzają transport pęcherzykowy wzdłuż akso­nu komórki nerwowej, co prowadzi do zaburzeń neuro­przekaźnictwa [4].

Degradacje białka a choroba Huntingtona

Hipoteza o udziale szlaku UPS w patologii chorób neu­rodegeneracyjnych powstała w 1989 r., kiedy zajmowa­no się badaniami immunohistochemicznymi ubikwity­ny [18,19,23,26,27]. Dowody na udział UPS w chorobach neurodegeneracyjnych pojawiły się dopiero w ostatnich latach. Uważa się, że dysfunkcja ubikwityny jest jedną z przyczyn patogenezy choroby HD. Wykazano, że aktyw­ność układu UPS w chorobie Huntingtona jest osłabiona [3,12,22,43,45]. Bennett i wsp. [3] zastosowali spektrosko­pię masową w celu określenia ilościowego i jakościowego składu łańcuchów poliglutaminowych u pacjentów z HD i na modelach zwierzęcych. Najważniejszym okazało się stwierdzenie, że w chorobie Huntingtona następuje atypo­we łączenie ubikwityny do proteasomu. W doświadcze­niach przeprowadzonych zarówno na transgenicznych my­szach R6/2 z mutacją w genie IT15, kodującym HTT, jak i z udziałem pacjentów z HD ustalono, że dysfunkcja UPS, to wspólna cecha w chorobie Huntingtona. W lizatach ko­mórkowych za pomocą białka fluoroscencyjnego GFP, mie­rzono ilość HTT zawierającej 16 reszt glutaminowych (typ zdrowy: HTTQ16GFP) lub 150 reszt glutaminowych (typ pa­tologiczny: HTTQ150GFP), jak również ilość izopeptydów U-Lys11 i U-Lys63 oraz U-Lys48, traktowanych inhibitorem MG132. Zaobserwowano, że w patologicznych modelach HTTQ150GFP wzrasta liczba atypowych wiązań w prote­asomie – U-Lys11 i U-Lys63, w stosunku do powszechnie występującego wiązania białka przez U-Lys48 [3].

Gil i wsp. [13] stosując, spektroskopię masową dostar­czyli dowodów, zarówno na modelach mysich, jak i u pa­cjentów HD post mortem, że we wczesnym okresie choro­by występuje akumulacja łańcuchów poliubikwitynowych tworzonych z udziałem Lys48. Autorzy wysunęli sugestię, że w początkowym stadium choroby szlak UPS jeszcze funkcjonuje, a później zwiększone agregaty zmutowane­go białka blokują tę drogę degradacji.

Dysfunkcja UPS i jej następstwa dla homeostazy komórki są krótkotrwałe, uruchamiają kaskadę zdarzeń, prowadzą­cych do dysfunkcji neuronalnej, co jest charakterystyczne dla obrazu choroby HD. Właściwe funkcjonowanie tego układu jest istotne z powodu pojawiających się w komór­ce, w stanach patologicznych, białek o krótkim okresie półtrwania, nieprawidłowo pofałdowanych i zmutowanych. Mimo iż deregulacja szlaku UPS jest tylko jednym z wie­lu czynników w etiopatogenezie HD, jednak ze względu na rolę, jaką odgrywa w komórce, UPS staje się ważnym celem terapeutycznym [44].

Seo i wsp. [4,20,44,49] stworzyli mysi model HD z 105 CAG, w którym obserwowano zmniejszoną aktywność pro­teasomalną. Badania prowadzono porównując typ prawidło­wy 26 CAG. Wykazano, że aktywator proteasomu PA28g, stosowany w badaniach, zwiększał aktywność proteasomu i przeżywalność komórek. Autorzy sugerują, że zmutowa­ne białko w cytosolu jest toksyczne i powinno być usunię­te poprzez UPS lub lizosomy, w przeciwnym razie, kiedy liczba mutanta osiągnie pewien graniczny poziom, zaczy­nają się tworzyć jądrowe agregaty.

Imarisio i wsp. [21] donoszą, że w modulacji aktywno­ści proteasomu zastosowali chemiczne związki: trehalo­zę i czerwień Kongo, które w efekcie spowodowały więk­szą dostępność proteasomu dla zmutowanej huntingtyny.

W regulacji lizosomalnej degradacji białka Bhutani i wsp. [4] zwracają uwagę na szlak lizosomalnej autofagii agre­gatów polyQ. Doświadczenia wskazują, że o ile UPS de­graduje prawidłowe białko huntingtynę, to agregaty polyQ są kierowane na szlak lizosomalny. Wykazano, że zmniej­szenie procesu autofagii w OUN powoduje akumulację agregatów białkowych i zjawisko neurodegeneracji u my­szy. Proteasomy Eukaryota trawią w najlepszym razie po­lyQ powoli lub wcale, uwalniając fragmenty do dalszej de­gradacji przez inne peptydazy. Sugeruje się, że fragmenty ulegającego rozpadowi białka mogą powodować uszkodze­nie funkcji proteasomu. Potwierdzeniem tego są badania Gila i wsp. [13], które wykazały obecność w agregatach białkowych resztek podjednostek proteasomu zarówno in vitro, jak i in vivo.

Jak wiadomo, peptydy uwolnione przez proteasom są tra­wione przez komórkowe endopeptydazy, oligopeptyda­zy i aminopeptydazy do aminokwasów. Wskazanie, które peptydazy biorą udział w trawieniu sekwencji polyQ stało się bardzo ważne. Podjęto próbę identyfikacji peptydaz in vitro. W początkowym etapie produkty proteasomalne są degradowane przez dwie główne endopeptydazy – TPPII i TOP. TPPII – proteolityczny kompleks 5-9 MDa, odgry­wa in vivo istotną rolę w proteolizie peptydów większych niż 15 reszt, zaś TOP peptydów o długości 9-15 reszt ami­nokwasowych (około 25% produktów proteasomalnych). Wymienione wyżej i inne endopetydazy – IDE, ACE, POP – nie mają większego znaczenia dla produktów proteaso­malnych. Za końcowy etap trawienia odpowiadają amino­peptydazy. Przebadano główne 3 aminopeptydazy: BH, LAP, PSA. Przedstawione biochemiczne badania ujawni­ły unikalną zdolność PSA do trawienia fragmentów polyQ, co może odgrywać ogromną rolę w protekcji neuronów w schorzeniach poliglutaminowych również in vivo. PSA jest enzymem wszechobecnym śródkomórkowo, znajdu­je się w cytosolu, jądrze, jest związany z membranami, a podczas mitozy występuje też w mikrotubulach. Jest to metalopeptydaza związana z jonami Zn²⁺ – białko o masie 100 kDa, obecne w dużym stężeniu w mózgu ssaków [4].

Imarisio i wsp. donoszą, że do modulacji lizosomalnej de­gradacji zmutowanej huntingtyny zastosowali również ta­kie związki jak rapamycynę, karbamazepinę, walpronian sodu. W eksperymentach z użyciem mysich modeli HD za­obserwowano nasilenie zjawiska autofagii [21].

Interesujące są wyniki uzyskane w badaniach z użyciem modeli zwierzęcych i hodowli komórkowych, w których wykazano, że nadekspresja chaperonów HSP 70,40,104 oraz TRiC (tail-less complex polypeptide 1 ring complex) zmniejsza agregację i śmierć neuronów w HD [21].

Etiopatogeneza choroby Huntingtona stanowi bardzo zło­żony problem. Jednak coraz to nowocześniejsze techniki identyfikacji genów oraz stosunkowo łatwy dostęp do zsekwencjonowanego genomu ludzkiego, być może już w niedalekiej przyszłości pozwolą na uzyskanie pełniej­szej informacji o etiologii tej choroby układu nerwowego, możliwych terapiach i neuroprotekcji.

Podsumowanie

W świetle doniesień literaturowych, przedstawionych w niniejszym artykule, UPS okazuje się jednym z punk­tów docelowych w poszukiwaniu celów terapeutycznych. Prawidłowe funkcjonowanie szlaku UPS umożliwia za­chowanie homeostazy procesów wewnątrzkomórkowych i usunięcie uszkodzonych białek. Przyroda wyposażyła komórkę w wyspecjalizowane systemy przeznaczone do konkretnych celów, w związku z tym szlak UPS nie może być zamieniony, lecz jedynie naprawiony. Stworzenie inno­wacyjnego projektu mającego na celu opracowanie strate­gii naprawczych funkcji UPS będzie wyzwaniem dla wielu naukowców przez najbliższe lata. Dotychczasowe wyniki badań dowodzą, że proteasom jest potencjalnym kluczem do opracowania skutecznych terapii.

PIŚMIENNICTWO

[1] Ahn K.S., Sethi G., Chao T.H., Neuteboom S.T., Chaturvedi M.M., Palladino M.A., Younes A., Aggarwal B.B.: Salinosporamide A (NPI-0052) potentiates apoptosis, suppresses osteoclastogenesis, and inhibits invasion through down-modulation of NF-κB-regulated gene products. Blood, 2007; 110: 2286-2295
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[2] Atwal R.S., Xia J., Pinchev D., Taylor J., Epand R.M., Truant R.: Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Hum. Mol. Genet., 2007; 16: 2600-2615
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Bennett E.J., Shaler T.A., Woodman B., Ryu K.Y., Zaitseva T.S., Becker C.H., Bates G.P., Schulman H., Kopito R.R.: Global changes to the ubiquitin system in Huntington’s disease. Nature, 2007; 448: 704-708
[PubMed]  

[4] Bhutani N., Venkatraman P., Goldberg A.L.: Puromycin-sensitive aminopeptidase is the major peptidase responsible for digesting polyglutamine sequences released by proteasomes during protein degradation. EMBO J., 2007; 26: 1385-1396
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[5] Bury M., Niemierko A.: Proteasomalna degradacja białek komórkowych. Postepy Biol. Kom., 2005; 32: 435-448

[6] Chauhan D., Hideshima T., Anderson K.C.: A novel proteasome inhibitor NPI-0052 as an anticancer therapy. Br. J. Cancer, 2006; 95: 961-965
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[7] Ciechanover A.: Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Hematology, 2006; 1-12: 505-506
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[8] Ciechanover A.: The ubiquitin proteolytic system: from an idea to the patient bed. Proc. Am. Thorac. Soc., 2006; 3: 21-31
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[9] Cui L., Jeong H., Borovecki F., Parkhurst CN., Tanese N., Krainc D.: Transcriptional repression of PGC-1α by mutant huntingtin leads to mitochondrial dysfunction and neurodegeneration. Cell, 2006; 127: 59-69
[PubMed]  

[10] Demo S.D., Kirk C.J., Aujay M.A., Buchholz T.J., Dajee M., Ho M.N., Jiang J., Laidig G.J., Lewis E.R., Parlati F., Shenk K.D., Smyth M.S., Sun C.M., Vallone M.K., Woo T.M., Molineaux C.J., Bennett M.K.: Antitumor activity of PR-171, a novel irreversible inhibitor of the proteasome. Cancer Res., 2007; 67: 6383-6391
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[11] Dziewulska D., Rafałowska J.: Rola zaburzeń przestrzennej budowy białek w patomechanizmie chorób układu pozapiramidowego. Neurol. Neurochir. Pol., 2005; 39: 397-404
[PubMed]  

[12] Finkbeiner S., Mitra S.: The ubiquitin-proteasome pathway in Huntington’s disease. Sci. World J., 2008; 8: 421-433
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[13] Gil J.M., Rego A.C.: Mechanisms of neurodegeneration on Huntington’s disease. Eur. J. Neurosci., 2008; 27: 2803-2820
[PubMed]  

[14] Gil J.M., Rego A.C.: The R6 lines of transgenic mice: a model for screening new therapies for Huntington’s disease. Brain Res. Rev., 2009; 59: 410-431
[PubMed]  

[15] Goh A.M., Walters K.J., Elsasser S., Verma R., Deshaies R.J., Finley D., Howley P.M.: Components of the ubiquitin-proteasome pathway compete for surfaces on Rad23 family proteins. BMC Biochem., 2008; 9: 4
[Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[16] Gruber B.M.: Udział czynnika transkrypcyjnego NF-κB w zjawisku oporności wielolekowej w wybranych komórkach ludzkich nowotworów wrażliwych i opornych na działanie cytostatyków. Rozprawa habilitacyjna 2008; WUM, Warszawa

[17] Grzelakowska-Sztabert B.: Nagroda Nobla z chemii za 2004 rok – docenienie kontrolowanej, zależnej od ubikwityny, proteolitycznej degradacji białek. Postepy Biol. Kom., 2005; 32: 3-12

[18] Hol E.M., Fischer D.F., Ovaa H., Scheper W.: Ubiquitin proteasome system as a pharmacological target in neurodegeneration. Expert Rev. Neurother., 2006; 6: 1337-1347
[PubMed]  

[19] Huang D.T., Hunt H.W., Zhuang M., Ohi M.D., Holton J.M., Schulman B.A.: Basis for a ubiquitin-like protein thioester switch toggling E1-E2 affinity. Nature, 2007; 445: 394-398
[PubMed]  

[20] Huang L., Chen C.H.: Proteasome regulators: activators and inhibitors. Curr. Med. Chem., 2009; 16: 931-939
[PubMed]  

[21] Imarisio S., Carmichael J., Korolchuk V., Chen C.W., Saiki S., Rose C., Krishna G., Davies J.E., Ttofi E., Underwood B.R., Rubinsztein D.C.: Huntington’s disease: from pathology and genetics to potential therapies. Biochem. J., 2008; 412: 191-209
[PubMed]  

[22] Jana N.R., Zemskov E.A., Wang G., Nukina N.: Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Hum. Mol. Genet., 2001; 10: 1049-1059
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[23] Jung J., Bonini N.: CREB-binding protein modulates repeat instability in a Drosophila model for polyQ disease. Science, 2007; 315: 1857-1859
[PubMed]  

[24] Jurczyszyn A., Skotnicki A.B.: Proteasome inhibition as a novel therapeutic target in neoplasmatic diseases. Adv. Clin. Exp. Med., 2006; 15: 309-320
[Abstract]  [Full Text PDF]  

[25] Kisselev A.F., Callard A., Goldberg A.L.: Importance of the different proteolytic sites of the proteasome and the efficacy of inhibitors varies with the protein substrate. J. Biol. Chem., 2006; 281: 8582-8590
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[26] Kolas N.K., Chapman J.R., Nakada S., Ylanko J., Chahwan R., Sweeney F.D., Panier S., Mendez M., Wildenhain J., Thomson T.M., Pelletier L., Jackson S.P., Durocher D.: Orchestration of the DNA-damage response by the RNF8 ubiquitin ligase. Science, 2007; 318: 1637-1640
[PubMed]  

[27] Kovtun I.V., Liu Y., Bjoras M., Klungland A., Wilson S.H., McMurray C.T.: OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature, 2007; 447: 447-452
[PubMed]  

[28] Krzemieniecki K.: Bortezomib – w świetle Nagrody Nobla 2004. Nowe perspektywy leczenia szpiczaka mnogiego. Współcz. Onkologia, 2005; 9: 54-60
[Abstract]  

[29] Kuhn D.J., Chen Q., Voorhees P.M., Strader J.S., Shenk K.D., Sun C.M., Demo S.D., Bennett M.K., van Leeuwen F.W., Chanan-Khan A.A., Orlowski R.Z.: Potent activity of carfilzomib, a novel, irreversible inhibitor of the ubiquitin-proteasome pathway, against preclinical models of multiple myeloma. Blood, 2007; 110: 3281-3290
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[30] Li W., Tu D., Brunger A.T., Ye Y.: A ubiquitin ligase transfers preformed polyubiquitin chains from a conjugating enzyme to a substrate. Nature, 2007; 446: 333-337
[PubMed]  

[31] Lukashchuk N., Vousden K.H.: Ubiquitination and degradation of mutant p53. Mol. Cell. Biol., 2007; 27: 8284-8295
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[32] Mazzucotelli E., Belloni S., Marone D., De Leonardis A., Guerra D., Di Fonzo N., Cattivelli L., Mastrangelo A.: The E3 ubiquitin ligase gene family in plants: regulation by degradation. Curr. Genomics, 2006; 7: 509-522
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[33] Mochel F., Charles P., Seguin F., Barritault J., Coussieu C., Perin L., Le Bouc Y., Gervais C., Carcelain G., Vassault A., Feingold J., Rabier D., Durr A.: Early energy deficit in Huntington disease: identification of a plasma biomarker traceable during disease progression. PLoS One, 2007; 2: e647
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[34] Mukhopadhyay D., Riezman H.: Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling. Science, 2007; 315: 201-205
[PubMed]  

[35] Nicewicz B., Pełka-Wysiecka J.: Neuropsychiatryczne aspekty choroby Huntingtona – opis przypadku. Postepy Psych. Neurol., 2008; 17: 89-92

[36] Niedźwiedzka-Rystwej P., Deptuła W.: Autofagia – ważne zjawisko odpornościowe. Postepy Biol. Kom., 2009; 36: 455-464

[37] Nukina N.: Pathomechanism of polyglutamine diseases and strategic design for their therapies. Rinsho Shinkeigaku, 2008; 48: 913-914
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[38] Ohtake F., Baba A., Takada I., Okada M., Iwasaki K., Miki H., Takahashi S., Kouzmenko A., Nohara K., Chiba T., Fujii-Kuriyama Y., Kato S.: Dioxin receptor is a ligand-dependent E3 ubiquitin ligase. Nature, 2007; 446: 562-566
[PubMed]  

[39] Pandey U.B., Nie Z., Batlevi Y., McCray B.A., Ritson G.P., Nedelsky N.B., Schwartz S.L., DiProspero N.A., Knight M.A., Schuldiner O., Padmanabhan R., Hild M., Berry D.L., Garza D., Hubbert C.C., Yao T.P., Baehrecke E.H., Taylor J.P.: HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature, 2007; 447: 859-863
[PubMed]  

[40] Paul S.: Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. Bioessays, 2008; 30: 1172-1184
[PubMed]  

[41] Piotrowska A., Iżykowska I., Podhorska-Okołów M., Zabel M., Dzięgiel P.: Budowa białek z rodziny NF-κB i ich rola w procesie apoptozy. Postepy Hig. Med. Dosw., 2008; 62: 64-74
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[42] Potts B.C., Lam K.S.: Generating a generation of proteasome inhibitors: from microbial fermentation to total synthesis of salinosporamide A (Marizomib) and other salinosporamides. Mar. Drugs, 2010; 8: 835-880
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[43] Qin Z.H., Wang Y., Sapp E., Cuiffo B., Wanker E., Hayden M.R., Kegel K.B., Aronin N., DiFiglia M.: Huntingtin bodies sequester vesicle-associated proteins by a polyproline-dependent interaction. J. Neurosci., 2004; 24: 269-281
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[44] Seo H., Sonntag K.C., Kim W., Cattaneo E., Isacson O.: Proteasome activator enhances survival of Huntington’s disease neuronal model cells. PLoS One, 2007; 2: e238
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[45] Sobów T., Sławek J.: Farmakoterapia zaburzeń ruchowych i objawów neuropsychiatrycznych w chorobie Huntingtona: systematyczny przegląd piśmiennictwa. Aktualn. Neurol., 2007; 7: 10-18

[46] Sprangers R., Kay L.E.: Quantitative dynamics and binding studies of the 20S proteasome by NMR. Nature, 2007; 445: 618-622
[PubMed]  

[47] Wilkinson K.D.: The discovery of ubiquitin-dependent proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005; 102: 15280-15282
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[48] Williams A., Jahreiss L., Sarkar S., Saiki S., Menzies F.M., Ravikumar B., Rubinsztein D.C.: Aggregate-prone proteins are cleared from the cytozol by autophagy: therapeutic implications. Curr. Top. Dev. Biol., 2006; 76: 89-101
[PubMed]  

[49] Zhang Z., Zhang R.: Proteasome activator PA28γ regulates p53 by enhancing its MDM2-mediated degradation. EMBO J., 2008; 27: 852-864
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

Autorki deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu