Streszczenie

Proces dojrzewania prekursorów limfocytów T w grasicy (tymocytów) składa się z kolejnych etapów różnicowania, selekcji i ekspansji tymocytów. W procesie dojrzewania tymocytów można wyróżnić dwa punkty kontrolne, w których wiele białek sygnałowych i czynników transkrypcyjnych pełni ważną rolę w szlakach sygnałowych receptorów antygenowych (pre-TCR i TCR), które pobudzają procesy różnicowania i selekcji. Sieroce receptory jądrowe RORγ i Nur77 biorą udział w procesach różnicowania i selekcji, które zależą od aktywacji pre-TCR i TCR. Białka RORγ i Nur77 mają przeciwstawny wpływ na żywotność komórek. Receptor jądrowy RORγ aktywuje gen kodujący antyapoptotyczne białko Bcl-X_L i jest niezbędny do przeżycia tymocytów CD4⁺CD8⁺, podczas gdy receptor jądrowy Nur77 indukuje apoptozę tych tymocytów CD4⁺CD8⁺, które zawierają TCR wykazujący zbyt wysokie powinowactwo do prezentowanych w grasicy własnych antygenów.

Słowa kluczowe:rozwój limfocytów T • tymocyty • sieroce receptory jądrowe • selekcja negatywna • apoptoza

Summary

T-lymphocyte development in the thymus proceeds through successive steps of differentiation, selection and expansion of thymocytes. Multiple signaling proteins and transcription factors play important roles in mediating the response to signals delivered through the pre-T-cell receptor (pre -TCR) and T-cell receptor (TCR) at two checkpoints during T-cell development. The orphan nuclear receptors RORγ and Nur77 are involved in the differentiation and selection processes that are induced following activation of the pre-TCR and TCR, respectively, and they exert opposite effects on the survival of thymocytes. RORγ activates the gene encoding the antiapoptotic protein Bcl-X_L and is required for the survival of CD4⁺CD8⁺ thymocytes, while Nur77 is involved in the apoptosis of CD4⁺CD8⁺ thymocytes bearing TCRs with a high affinity for self antigens presented in the thymus.

Key words:T-lymphocyte development • thymocytes • orphan nuclear receptors • negative selection • apoptosis

* Praca jest zmienioną i uzupełnioną częścią rozprawy habilitacyjnej pt. „Mechanizmy regulacji ekspresji i funkcji receptora jądrowego Nur77”.

Wykaz skrótów:

APC – komórka prezentująca antygeny (antigen-presenting cell); BH3 – proapoptotyczna sekwencja aminokwasów Leu-X-X-X-Gly-Asp, która przyjmuje strukturę amfipatycznej helisy α; DAG – diacyloglicerol; DN – tymocyty podwójnie negatywne, tzn. CD4^–CD8^– (double negative); DP – tymocyty podwójnie pozytywne, tzn. CD4⁺CD8⁺ (double positive); ERK1/2 – kinazy białkowe ERK1 i ERK2 serynowo-treoninowe z rodziny MAPK (extracellular signal-regulated kinases); GADS – białko adaptorowe podobne do GRB2; GDP – guanozynodifosforan; GRB2 – białko adaptorowe (growth factor receptor-bound protein 2); GTP – guanozynotrifosforan; HY – antygen HY występujący tylko u samców; IP3 – trifosforan inozytolu; ISP – niedojrzałe tymocyty pojedynczo pozytywne, tzn. CD4niskiCD8– lub CD4–CD8niski (immature single-positive); ITK – cytoplazmatyczna kinaza tyrozynowa z rodziny Tec (IL-2-inducible T cell kinase); JNK – kinazy białkowe JNK1, JNK2 i JNK3 serynowotreoninowe z rodziny MAPK (c-Jun N-terminal kinases); LAT – białko adaptorowe (linker for activation of T cells); LCK – cytoplazmatyczna kinaza tyrozynowa z rodziny Src (leukocyte-specific protein tyrosine kinase); MHC – główny kompleks zgodności tkankowej (major histocompatibility complex); MINK – kinaza białkowa serynowo-treoninowa (misshapen-NCK-interacting kinase-related kinase); NCK – białko adaptorowe (non-catalytic region of tyrosine kinase); NFAT – czynnik transkrypcyjny (nuclear factor of activated T cells); p38 – kinazy białkowe p38α, p38β, p38γ i p38δ serynowotreoninowe z rodziny MAPK; PLCγ1 – fosfolipaza Cγ1; pre-TCR – heterodimer złożony z TCRβ i pTα; RasGAP – GTP-aza Ras (Ras GTPase-activating protein); RasGRP1 – wymieniacz nukleotydu GDP/GTP w białku Ras (Ras guanine nucleotide releasing protein 1); SLP76 – białko adaptorowe (SH2-domain-containing leukocyte protein of 76 kDa); SOS – wymieniacz nukleotydów GDP/GTP w białku Ras (son of sevenless); SP – tymocyty pojedynczo pozytywne, tzn. CD4⁺CD8^– lub CD4^–CD8⁺ (single positive); TCR – receptor antygenowy na komórkach T (T cell receptor); TCRαβ anty-HY/Db – receptor swoisty wobec samczego antygenu HY, prezentowanego przez białko MHC klasy I kodowane przez gen regionu D haplotypu H-2^b; VAV – wymieniacz nukleotydu GDP/GTP w białkach RAC/CDC42; ZAP70 – cytoplazmatyczna kinaza tyrozynowa z rodziny Syk (ς-chain-associated protein kinase of 70 kDa).

1. WPROWADZENIE

Receptory jądrowe są to czynniki transkrypcyjne aktywowane przez ligandy, którymi są rozpuszczalne w tłuszczach hormony steroidowe (np. kortyzol i estradiol), tyroksyna, pochodne witamin A i D, metabolity cholesterolu i kwasów tłuszczowych oraz ksenobiotyki [19]. Sierocymi receptorami jądrowymi są natomiast białka, których ligandy nie zostały poznane lub nawet białka te nie są regulowane przez naturalne ligandy, lecz zostały one zaklasyfikowane do nadrodziny receptorów jądrowych na podstawie analizy porównawczej sekwencji aminokwasowej wskazującej na obecność w białku domen typowych dla klasycznych receptorów jądrowych:
(1) zawierającej dwa tzw. palce cynkowe domeny wiążącej DNA;
(2) regionu homologicznego z domeną wiążącą ligand w klasycznych receptorach jądrowych.

Funkcja sierocych receptorów jądrowych jest regulowana na poziomie transkrypcji genów kodujących receptory jądrowe i fosforylacji receptorów jądrowych lub współdziałających z nimi kofaktorów. Zatem sieroce receptory jądrowe mogą pełnić rolę w aktywacji genów regulowanych przez wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe. Ekspresję sierocych receptorów jądrowych RORγ i Nur77 wykazano tylko w niektórych stadiach rozwojowych prekursorów limfocytów T w grasicy (tymocytów), co może świadczyć o ich udziale w regulacji różnicowania tymocytów [26,72]. W procesie różnicowania tymocytów dochodzi do rearanżacji genów kodujących receptor dla antygenu limfocytu T (TCR). Celem pracy jest przedstawienie roli receptorów jądrowych RORγ i Nur77 w różnicowaniu i selekcji komórek, które mogą być użyteczne w rozpoznaniu obcego antygenu.

2. LIMFOCYTY T I TYMOCYTY

Limfocytami T nazywamy komórki układu odpornościowego, które na powierzchni mają receptor antygenowy (TCR). Nazwa limfocytów T wywodzi się od nazwy grasicy (łac. thymus), w której dojrzewają komórki prekursorowe limfocytów T nazywane tymocytami. Ze względu na zawarty receptor antygenowy limfocyty T dzieli się na komórki linii αβ (mają TCRαβ) i komórki linii γδ (mają TCRγδ). Na podstawie występowania białek markerowych, takich jak CD4, CD8 (heterodimer CD8αβ) i CD25 wyróżnia się wśród limfocytów T linii αβ subpopulacje komórek CD4⁺CD8^–CD25^–, CD4⁺CD8^–CD25⁺ i CD4^–CD8⁺CD25^– [51]. Należy jednak podkreślić, że komórki zasiedlające grasicę różnicują się nie tylko w kierunku limfocytów T, ale również w kierunku komórek NKT, NK i komórek dendrytycznych pochodzenia limfoidalnego. Komórki w grasicy nie mają natomiast w warunkach fizjologicznych zdolności do różnicowania się w kierunku limfocytów B oraz komórek linii mieloidalnej i erytroidalnej [2]. Receptor TCRαβ limfocytów T CD8⁺ może rozpoznawać antygen (peptyd) prezentowany przez białka MHC klasy I, czyli cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej, które występują na większości komórek organizmu [47]. Receptor TCRαβ limfocytów T CD4⁺ może natomiast rozpoznawać antygen (peptyd) prezentowany przez białka MHC klasy II, które występują na profesjonalnych komórkach prezentujących antygeny (APC), takich jak makrofagi, limfocyty B, komórki dendrytyczne oraz komórki epitelialne kory i rdzenia grasicy [4,37,47]. Białka markerowe CD4 i CD8 są nazywane koreceptorami, gdyż wiążą się z niepolimorficzną częścią MHC i współdziałają z receptorem TCRαβ w rozpoznawaniu MHC. Koreceptor CD8 rozpoznaje MHC klasy I, podczas gdy koreceptor CD4 rozpoznaje MHC klasy II. Większość dojrzałych komórek T CD8⁺ pełni funkcje cytotoksyczne, podczas gdy większość konwencjonalnych komórek T CD4⁺CD25^– pełni funkcje pomocnicze. Komórki T CD4⁺CD25⁺ są limfocytami T regulatorowymi i pełnią funkcje supresorowe.

Cząsteczki MHC klasy I prezentują peptydy będące produktem rozkładu przez proteasom białek endogennych (zarówno prawidłowych białek własnych, jak i białek obcych lub nieprawidłowych białek własnych) – w konsekwencji limfocyt T CD8⁺ może powodować lizę komórki zakażonej przez mikroorganizmy (wirusy, bakterie wewnątrzkomórkowe) lub transformowanej nowotworowo [47]. Cząsteczki MHC klasy II prezentują głównie peptydy egzogenne, wywodzące się z trawionych białek zewnątrzkomórkowych, które dostają się do komórki drogą fagocytozy lub pinocytozy. Cząsteczki MHC klasy II mogą również prezentować peptydy endogenne będące produktem autofagocytozy (autofagii) własnych elementów struktury komórki [24,114]. Komórki dendrytyczne mogą prezentować limfocytom T egzogenne antygeny zarówno w kontekście MHC klasy II, jak i krzyżowo w kontekście MHC klasy I [44].

3. STADIA RÓŻNICOWANIA TYMOCYTÓW

Tymocyty różnicują się z zasiedlających grasicę komórek progenitorowych, które wywodzą się ze szpiku kostnego [14,49,115]. Komórki te mają receptor kwasu hialuronowego (marker CD44) i receptor czynnika wzrostowego komórek macierzystych (białko cKit, marker CD117). Na komórkach zasiedlających grasicę dochodzi do krótkotrwałej ekspresji markera CD4 (komórki CD117⁺CD44⁺CD4^niski). W następnych stadiach różnicowania tymocyty, które jeszcze nie mają koreceptorów CD4 i CD8 (CD4^–CD8^–), są określane jako tymocyty podwójnie negatywne (DN). Na podstawie ekspresji markerów CD44 i CD25 (podjednostka α receptora interleukiny 2) wyróżniono kolejne stadia różnicowania tymocytów DN: CD117⁺CD44⁺CD25^– (DN1), CD117⁺CD44⁺CD25⁺ (DN2), CD117^niskiCD44^–CD25⁺ (DN3), CD117^–CD44^–CD25^– (DN4) [32,84] (ryc. 1).

Ryc. 1. Różnicowanie komórek T linii αβ w grasicy. Przedstawiono kolejne stadia rozwojowe tymocytów podwójnie negatywnych (DN1, DN2, DN3a, DN3b, DN4), niedojrzałych tymocytow pojedynczo pozytywnych (ISP), tymocytow podwojnie pozytywnych (DP) i dojrzałych tymocytów pojedynczo pozytywnych (SP). Oznaczenia: Tγδ – komórki T linii γδ; Treg – naturalne limfocyty T regulatorowe. Wyjaśnienie pozostałych oznaczeń jest w wykazie skrótów i tekście

Tymocyty DN1 intensywnie proliferują i stanowią bardzo heterogenną populację komórek, wśród których są najwcześniejsze komórki prekursorowe różnicujące się do limfocytów T [60,84]. Rozwój tymocytów DN1 w kierunku limfocytów B jest hamowany przez aktywację receptorów Notch. Receptorowe białka Notch występują na powierzchni tymocytów i mogą oddziaływać z ligandami, takimi jak białka rodzin Delta (Delta-like) i Jagged, które są prezentowane przez komórki zrębu grasicy [101]. Aktywacja Notch powoduje proteolityczne odszczepienie wewnątrzkomórkowego fragmentu Notch (Notch-ICD, Notch intracellular domain), który ulega translokacji do jądra komórki. W jądrze Notch-ICD łączy się z czynnikiem transkrypcyjnym RBPJ (recombination site binding protein J). Białko RBPJ jest związane z odpowiednim elementem odpowiedzi w DNA i bez połączenia z Notch-ICD jest represorem genu. W kompleksie z Notch-ICD białko RBPJ staje się natomiast aktywatorem transkrypcji genów biorących udział w różnicowaniu tymocytów [84,102].

Tymocyty DN1 różnicują się do tymocytów DN2, które migrują w korze grasicy z przestrzeni okołonaczyniowej w kierunku warstwy komórek epitelium pod torebką grasicy [84]. W czasie migracji następuje wzrost ekspresji markera CD25 na powierzchni tymocyta (w stadium DN2) i stopniowo obniżenie ekspresji markerów CD117 (w stadiach DN2 i DN3) oraz CD44 (w stadium DN3) [4,84,96]. Tymocyty DN1 i DN2 mogą różnicować się w kierunku komórek T linii αβ i γδ, ale mogą jeszcze różnicować się do komórek NK, komórek dendrytycznych i nawet do makrofagów [25,49,101,115]. Przeżycie tymocytów we wczesnych stadiach różnicowania DN1 i DN2 zależy od odpowiedniej stymulacji czynnikami wzrostowymi, takimi jak SCF (czynnik wzrostowy komórek macierzystych) i interleukina 7, które działają za pośrednictwem receptora SCF (białko cKit) i receptora interleukiny 7. Interleukina 7 jest niezbędna w indukcji proliferacji tymocytów stadium DN2 i ekspresji genu Mcl-1 (myeloid cell leukemia sequence 1), który koduje białko antyapoptotyczne z rodziny Bcl- 2 [2,122]. Białko Mcl-1 chroni przed apoptozą tymocyty, w których rozpoczynają się rearanżacje genów kodujących receptory antygenowe. Dalszy rozwój tymocytów do komórek T linii αβ nie wymaga stymulacji przez interleukinę 7. Za to interleukina 7 jest niezbędna w różnicowaniu komórek T linii γδ [88]. Szlaki sygnałowe inicjowane przez receptor interleukiny 7 pobudzają rearanżację locus TCRγ i przypuszczalnie dlatego komórki z dużą liczbą receptorów tej interleukiny mają większy potencjał rozwojowy w kierunku komórek T linii γδ, niż tymocyty z niską liczbą receptorów interleukiny 7, które różnicują się preferencyjnie do komórek T linii αβ [79]. Dalsze różnicowanie tymocytów zależy od wyniku rearanżacji genów kodujących receptory antygenowe.

4. REARANŻACJE GENÓW KODUJĄCYCH RECEPTORY ANTYGENOWE

Rearanżacją locus TCR (α, β, γ, δ) jest nazywany proces rekombinacji somatycznej genów kodujących TCR, który polega na charakteryzującym się zmiennością przemieszczaniem i delecją sekwencji DNA (minigenów) w obrębie określonych segmentów V/D/J (variable/diversity/joining segments), co powoduje nieodwracalne utworzenie sekwencji genów kodujących receptory TCRγδ lub TCRαβ o unikatowej swoistości rozpoznawanego antygenu. Najbardziej zmienny region w łańcuchach polipeptydowych podjednostek TCRα (V_αJ_α/C_α) i TCRβ (V_βD_βJ_β/C_β) receptora antygenowego jest kodowany przez region DNA będący miejscem łączenia segmentów V(D)J w procesie odznaczającym się dużą zmiennością [55]. Rearanżacja genów kodujących podjednostki TCRγ (VγJγ/Cγ) i TCRδ (VδDδJδ/Cδ) rozpoczyna się w stadium różnicowania DN2. Tymocyty, w których rearanżacje genów TCRγ i TCRδ nie doprowadziły do powstania funkcjonalnego receptora TCRγδ, wciąż mają szanse na rozwój w kierunku komórek T linii αβ. Rearanżacja genu TCRβ zachodzi najczęściej w stadiach DN2 i DN3. W przypadku nieproduktywnego wyniku rearanżacji jednego allelu locus TCRβ jest podejmowana próba rearanżacji drugiego allelu [62,110].

Łańcuch polipeptydowy TCRβ w wyniku połączenia mostkiem dwusiarczkowym z niezmiennym łańcuchem polipeptydowym pTα tworzy stabilny heterodimer pre- TCR [36,55]. Produktywne rearanżacje loci TCR skutkują ekspresją genów kodujących receptory TCRγδ lub pre-TCR. Komórki w stadium DN3 stanowią heterogenną populację komórek, gdyż część komórek należy do subpopulacji małych komórek bez receptora TCRγδ lub pre-TCR (stadium DN3a), a część komórek należy do subpopulacji większych komórek (stadium DN3b), które już mają na powierzchni receptor TCRγδ lub pre-TCR i mogą aktywować wewnątrzkomórkowe białka sygnałowe (ryc. 1). TCRγδ lub pre-TCR są eksponowane na powierzchni komórki w kompleksie z białkami CD3, które występują w postaci dimerów CD3γε, CD3εδ i ζζ [121]. Zewnątrzkomórkowe domeny białek CD3γε i CD3εδ oddziałują z TCR, podczas gdy części cytoplazmatyczne białek CD3 zawierają motywy ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif). Łańcuchy ς zawierają trzy motywy ITAM, a po jednym motywie ITAM mają pozostałe białka kompleksu CD3. Motywy ITAM zawierają reszty dwóch tyrozyn, które są fosforylowane przez białkową kinazę tyrozynową w wyniku aktywacji kompleksu TCR/CD3. Sekwencje ITAM z fosforylowanymi resztami tyrozyn stanowią miejsca zakotwiczenia białek sygnałowych, które dokonują tłumaczenia informacji o aktywacji TCR/CD3 przez ligand (peptyd/MHC) na sekwencje zmian biochemicznych, takich jak fosforylacje białek, wytwarzanie wtórnych przekaźników sygnału i aktywacje genów.

Indukcja różnicowania tymocytów linii αβ ze stadium DN3 do DN4 wymaga współdziałania aktywacji Notch i pre-TCR [38,103,107]. W stadium DN4 tymocyty intensywnie proliferują i następnie różnicują się do komórek CD4⁺CD8⁺, które są nazywane tymocytami podwójnie pozytywnymi (DP). W wyniku rearanżacji locus TCRα receptor pre-TCR jest w tymocytach stadium DP zastępowany przez receptor TCRαβ.

Rearanżacja locus TCRα może zachodzić jednocześnie na obu chromosomach i jest procesem mniej złożonym od rearanżacji locus TCRβ, gdyż są łączone segmenty V_a i J_a. Rearanżacje locus TCRα zachodzą w tymocytach DP, chociaż czasami mogą zachodzić już w końcowym stadium DN4 [96]. W wyniku rearanżacji locus TCRα ekspresja genów kodujących receptor TCRγδ jest już niemożliwa z dwóch powodów:
(1) rearanżacja V_aJ_a powoduje delecję locus TCRδ, który jest umiejscowiony między segmentami Vα i Jα;
(2) transkrypcja genu VγJγ/Cγ zostaje wyciszona w komórkach T linii αβ [28,42].

5. PUNKTY KONTROLNE RÓŻNICOWANIA TYMOCYTÓW

W procesie różnicowania tymocytów w kierunku limfocytów T linii αβ można wyróżnić przynajmniej dwa punkty kontrolne: selekcję β w stadium DN3 oraz selekcję pozytywną i selekcję negatywną w stadium DP [52,54,81,104,108]. W pierwszym punkcie kontrolnym, który decyduje o dalszym rozwoju komórek T linii γδ lub αβ, aktywacja szlaków sygnałowych receptora TCRγδ lub pre-TCR dostarcza sygnałów ratujących tymocyty DN3 przed apoptozą (ryc. 1). Z kolei w drugim punkcie kontrolnym tymocyty DP są ratowane przed apoptozą przez sygnały selekcji pozytywnej, które zależą od aktywacji TCRαβ. Selekcja pozytywna do dalszego różnicowania dopuszcza tymocyty z TCRαβ użytecznym, tzn. zdolnym do rozpoznania obcego antygenu w kontekście MHC i aktywacji wewnątrzkomórkowych białek sygnałowych. Skutkiem selekcji pozytywnej jest rozwój tymocytów DP w kierunku dojrzałych komórek T, które mają tylko jeden koreceptor (CD4 lub CD8) i dlatego są określane jako tymocyty pojedynczo pozytywne (SP) (ryc. 1). W drugim punkcie kontrolnym są również w procesie selekcji negatywnej eliminowane potencjalnie autoreaktywne limfocyty T, głównie za pośrednictwem apoptozy w następstwie zbyt silnej aktywacji TCRαβ. Część negatywnie selekcjonowanych tymocytów nie ulega jednak apoptozie, ale kontynuuje rearanżację locus TCRα, która prowadzi do zmiany swoistości receptora TCRαβ lub opuszczające grasicę komórki T są w stanie anergii [34,74].

6. PIERWSZY PUNKT KONTROLNY RÓŻNICOWANIA TYMOCYTÓW: WYBÓR LINII γδ LUB αβ (SELEKCJA β)

W pierwszym punkcie kontrolnym jest podejmowana decyzja o dalszym różnicowaniu tymocytu albo w kierunku limfocytu T linii γδ, albo w kierunku limfocytu T linii αβ. Do dalszego rozwoju w kierunku komórek T linii αβ są selekcjonowane tylko te tymocyty, w których produktem zrearanżowanego genu TCRβ jest łańcuch polipeptydowy zdolny do utworzenia heterodimeru z podjednostką pTα (stąd nazwa: selekcja β). Przypuszczalnie silny sygnał aktywacji receptora antygenowego (TCRγδ lub przedwczesnego TCRαβ) determinuje rozwój tymocytów w kierunku limfocytów T linii γδ [60]. Przeciwnie zaś, słabsza aktywacja białek sygnałowych przez pre-TCR, we współdziałaniu ze szlakiem sygnałowym Notch, pobudza różnicowanie tymocytów myszy w kierunku limfocytów T linii αβ [42,62]. W wyniku selekcji β w tymocytach dochodzi do wyciszenia transkrypcji genu kodującego TCRγ [28]. Jednak tymocyty, które otrzymały sygnał od pre-TCR do różnicowania w kierunku komórek T linii αβ mogą w wyniku silnej aktywacji kompleksu TCR/CD3 in vitro jeszcze ulec konwersji do komórek T linii γδ [60]. Także przedwczesna ekspresja transgenów TCRα^Tβ^T w tymocytach DN może pobudzać różnicowanie takich tymocytów w kierunku komórek T linii γδ, które wówczas nie rozpoczynają rearanżacji locus TCRα i opuszczają grasicę jako funkcjonalne komórki „γδ”, ale z receptorem TCRα^Tβ^T [15,111]. Natomiast u myszy nietransgenicznej rearanżacja locus TCRα prowadzi do usunięcia locus TCRγ, co uniemożliwia konwersję komórek T linii αβ do linii γδ.

6.1. Szlaki sygnałowe pre-TCR

Kompleks białek pre-TCR/CD3 jest połączony z kinazą białkową LCK [55]. Pre-TCR na powierzchni komórki ulega oligomeryzacji, co powoduje aktywację szlaków sygnałowych w komórce [120]. Aktywacja kompleksu pre-TCR/CD3 powoduje aktywację kinaz tyrozynowych LCK i ZAP70 oraz fosforylację ważnych białek adaptorowych: zakotwiczonego w błonie komórkowej białka LAT oraz cytosolowego białka SLP76 [109,110]. Pre-TCR ulega następnie szybkiej internalizacji i degradacji [3,109].

U myszy z nokautem Slp76^–/– obserwowano całkowite zahamowanie różnicowania tymocytów w stadium DN3 oraz złamanie zasady wyłączenia allelicznego [59]. Terminem „wyłączenie alleliczne” (allelic exclusion) w tym wypadku określa się zahamowanie rearanżacji drugiego allelu locus TCRβ, a ściślej odstąpienie od połączenia segmentu V_β ze zrearanżowanym regionem D_βJ_β [55]. Fenotyp myszy Slp76^–/– wskazuje zatem na rolę białek sygnałowych (rekrutowanych do kompleksu pre-TCR/CD3 za pośrednictwem białka SLP76) w przekazaniu informacji o powstaniu produktywnej rearanżacji locus TCRβ w postaci sygnału do wyłączenia rearanżacji drugiego allelu locus TCRβ i do ekspansji (głównie w stadium DN4) tylko tych klonów tymocytów, w których proces rearanżacji locus TCRβ doprowadził do utworzenia funkcjonalnego TCRβ [59]. Istotną rolę w przeżyciu tymocytów stadium DN4 pełni białko antyapoptotyczne Bcl-2A1 (Bcl-2-related protein A1) w błonie mitochondrium [68,122]. Ekspresja genu Bcl-2A1 jest indukowana przez zależną od pre-TCR aktywację czynnika transkrypcyjnego NF-κB [68]. Tymocyty w stadium różnicowania DN4 rozpoczynają migrację z części podtorebkowej grasicy przez korę w kierunku rdzenia grasicy [4,96]. Różnicowanie tymocytów DN4 postępuje poprzez przejściowe stadium ISP (CD4^niskiCD8^– lub CD4^–CD8^niski) do stadium komórek DP [81] (ryc. 1). Podsumowując, występowanie pre-TCR na powierzchni komórki wskazuje na produktywną rearanżację locus TCRβ i w konsekwencji powoduje wyłączenie rearanżacji drugiego allelu locus TCRβ, ponadto ratuje tymocyty przed apoptozą oraz indukuje ekspansję klonalną i prowadzi do ekspresji koreceptorów CD4/CD8 w następnym stadium różnicowania komórek T linii αβ.

6.2. Rola sierocego receptora jądrowego RORγt w rozpoczęciu rearanżacji locus TCRα oraz w przeżyciu tymocytów wczesnego stadium CD4⁺CD8⁺

Konsekwencją selekcji β jest faza ekspansji tymocytów z produktywną rearanżacją locus TCRβ. Tymocyty intensywnie proliferują w stadiach rozwojowych DN4 i ISP (ryc. 1). Jednak w następnym stadium różnicowania, czyli w tymocytach DP, zachodzą procesy rearanżacji locus TCRα. Zatrzymanie proliferacji tymocytów jest warunkiem niezbędnym do rozpoczęcia rearanżacji genu. W jaki sposób na poziomie molekularnym jest koordynowane wyhamowanie proliferacji komórki i rozpoczęcie rearanżacji locus TCRα? Aby odpowiedzieć na to pytanie, należy wyjaśnić relacje między trzema czynnikami transkrypcyjnymi: Egr3, Id3 i RORγt. Aktywacja pre-TCR prowadzi do zwiększenia stężenia czynników transkrypcyjnych rodziny Egr (early growth response), które następnie indukują ekspresję genu kodującego białko represorowe Id3 (inhibitor of DNA binding 3) [119]. Z kolei białko Id3 jest represorem genu kodującego receptor jądrowy RORγt [117,119]. Białko RORγt jest występującą w tymocytach izoformą czynnika transkrypcyjnego RORγ (retinoic acid receptor-related orphan receptor γ), który jest sierocym receptorem jądrowym (tzn. nie zidentyfikowano liganda receptora). Na znaczenie RORγt w różnicowaniu tymocytów wskazuje obserwowane u myszy z nokautem RORγ^–/– zahamowanie różnicowania tymocytów stadium ISP do tymocytów DP oraz obniżenie żywotności tymocytów DP [39]. Białko Egr3 może tworzyć kompleksy z białkiem RORγt hamując ekspresję genów aktywowanych przez RORγt [119]. Podsumowując, szlaki sygnałowe pre-TCR, za pośrednictwem czynników transkrypcyjnych Egr3 i Id3, powodują wyciszenie ekspresji i funkcji receptora jądrowego RORγt.

Jednak wraz z kolejnymi podziałami tymocytów stadium DN4 stężenie białka Egr3 w komórce obniża się poniżej stężenia niezbędnego do podtrzymania ekspresji genu kodującego represor Id3. Wyciszenie ekspresji Id3 prowadzi natomiast do wzrostu stężenia białka RORgt. Białko RORγt jest w tymocytach aktywatorem transkrypcji m.in. genów kodujących białko Cpeb4 (cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4), rekombinazę Rag2 (recombination activating gene 2) oraz antyapoptotyczne białko Bcl- X_L [119]. Aktywność białka Cpeb4 powoduje zatrzymanie proliferacji tymocytów i wówczas rekombinaza Rag2 może rozpocząć rearanżacje locus TCRα.

W tymocytach myszy z nokautem genu RORγ^–/– odnotowano jedynie śladową ilość białka Bcl-X_L, co wskazuje na ważną rolę białek RORγ w indukcji ekspresji genu bcl-x kodującego Bcl-X_L [117]. Białko Bcl-X_L przypuszczalnie chroni przed apoptozą tymocyty wczesnego stadium DP, w których jeszcze może dojść do produktywnej rearanżacji locus TCRα i do ratującej przed apoptozą aktywacji receptora TCRαβ przez ligandy selekcjonujące pozytywnie [18].

7. DRUGI PUNKT KONTROLNY: SELEKCJA POZYTYWNA I NEGATYWNA TYMOCYTÓW Z TCRαβ

Wytworzone receptory TCRαβ o unikalnej swoistości wobec antygenów prezentowanych w kontekście MHC mogą być dla organizmu użyteczne, bezużyteczne lub nawet szkodliwe [112,113]. Limfocyty T są dla organizmu użyteczne, jeżeli za pomocą TCRαβ mogą rozpoznawać obce antygeny, prezentowane w kontekście cząsteczek MHC przez inne komórki organizmu. Użyteczny TCRαβ musi rozpoznawać MHC klasy I lub II (gdyż w przeciwnym wypadku byłby receptorem bezużytecznym), ale nie może rozpoznawać własnych antygenów organizmu w kontekście MHC (gdyż w przeciwnym wypadku wyposażone w taki receptor limfocyty T mogłyby być szkodliwe dla organizmu). W drugim punkcie kontrolnym są pobudzane do dalszego rozwoju tymocyty, których TCRαβ jest receptorem użytecznym i proces ten jest nazywany selekcją pozytywną. Natomiast tymocyty z potencjalnie szkodliwym TCRαβ są eliminowane w procesie selekcji negatywnej. Przykładowo, receptor TCRαβ anty-HY/D^b rozpoznaje samczy antygen HY w kontekście H-2D^b. Antygen HY nie występuje u samic. Tymocyty z receptorem TCRαβ anty-HY/D^b u myszy z haplotypem H-2^b są więc selekcjonowane pozytywnie u samic i negatywnie u samców (ryc. 2).

Ryc. 2. Selekcja tymocytów z TCRαβ anty-HY/D^b. Receptor antygenowy komórek T może być dla organizmu bezużyteczny (A), użyteczny (B) lub szkodliwy (C). Oznaczenia: H-2D^b i H-2D^d – cząsteczki MHC klasy I kodowane przez gen w regionie D (tutaj haplotypy b i d), które prezentują peptydy receptorom antygenowym (TCRαβ) na limfocytach T CD8⁺. Wyjaśnienie pozostałych oznaczeń jest w wykazie skrótów

7.1. Rola białek Bax i Bak w apoptozie tymocytów

W procesie różnicowania tymocyty DP są zaprogramowane do apoptozy, jeżeli w określonym czasie nie otrzymają sygnału antyapoptotycznego, który ratuje tymocyty przed śmiercią „przez zaniedbanie” [55,95] (ryc. 2). Brak białka antyapoptotycznego może być wystarczający do indukcji apoptozy tymocytów z bezużytecznym TCRαβ w wyniku spontanicznej aktywacji białek Bax (Bcl-2-associated X protein) i Bak (Bcl-2-antagonist/killer), które są białkami proapoptotycznymi z rodziny Bcl-2 [122]. Do rodziny Bcl- 2 są klasyfikowane białka, które mają przynajmniej jedną z czterech konserwowanych domen BH1-BH4 (Bcl-2 homology domains). Białka rodziny Bcl-2 można podzielić na proapoptotyczne (m.in. Bax, Bak, Bim) i antyapoptotyczne (Bcl-2, Bcl-X_L, Mcl-1, Bcl-2A1) [1,122]. Białka proapoptotyczne eksponują na zewnątrz proapoptotyczną sekwencję BH3. W strukturze białek antyapoptotycznych jest natomiast formowana szczelina hydrofobowa (utworzona przez helisy α domen BH1, BH2 i BH3), która może pomieścić helisę amfipatyczną BH3 inaktywowanego białka proapoptotycznego [1]. Rola antyapoptotyczna białek Bcl-2 i Bcl-X_L polega właśnie na wiązaniu i tym samym neutralizacji wolnych sekwencji proapoptotycznych BH3. Tymocyty wczesnego stadium DP są chronione przed apoptozą przez białko Bcl-X_L, które w następstwie selekcji pozytywnej jest zastępowane przez białko Bcl-2.

Białka Bax i Bak działają redundantnie jako induktory apoptozy [83]. Bax i Bak występują w komórce w postaci nieaktywnej: Bax występuje w cytosolu w postaci monomerycznej, podczas gdy Bak jest umiejscowiony w błonie mitochondrialnej, ale nie jest aktywny, gdyż tworzy kompleks z białkami antyapoptotycznymi Bcl-X_L lub Mcl-1 [122]. Brak sygnału ratującego komórkę przed apoptozą sprzyja spontanicznej aktywacji Bax i Bak. W wyniku aktywacji białko Bax ulega translokacji z cytosolu do zewnętrznej błony mitochondrium. Następnie aktywne białka Bax i Bak oligomeryzują w błonie mitochondrium i tworzą kompleks przepuszczalny dla niektórych białek mitochondrialnych (w tym dla cytochromu c), które po przedostaniu się do cytosolu aktywują szlaki apoptozy zależnej od mitochondrium, w tym sekwencyjne aktywacje proteaz nazywanych kaspazami [122]. Cytochrom c po uwolnieniu z mitochondrium tworzy w cytosolu kompleks z białkami APAF-1 (apoptotic protease-activating factor-1) i prokaspazą 9, który jest nazywany apoptosomem. W apoptosomie zachodzi aktywacja kaspazy 9. Aktywna kaspaza 9 z kolei inicjuje aktywację kaspazy 3, która następnie trawi białka komórki w fazie egzekucyjnej apoptozy [98].

Podsumowując, tymocyty DP są zaprogramowane do apoptozy „przez zaniedbanie”, jeżeli w określonym czasie nie otrzymają ratującego przed apoptozą sygnału selekcji pozytywnej. Apoptoza jest indukowana w wyniku aktywacji białek Bax i Bak, do której może dochodzić spontanicznie, tzn. bez specjalnego induktora apoptozy. Podejrzewa się także udział glikokortykoidów lub adenozyny w indukcji apoptozy tych tymocytów DP, które nie otrzymały sygnałów selekcji pozytywnej [6,56]. Glikokortykoidy i adenozyna mogłyby przyspieszać aktywację białek Bax/Bak. Głównym źródłem glikokortykoidów w organizmie są nadnercza, lecz także komórki epitelialne grasicy mogą wytwarzać glikokortykoidy [6,48]. Po wniknięciu do komórki glikokortykoidy łączą się w cytoplazmie z receptorem glikokortykoidów, który po translokacji do jądra reguluje transkrypcję wielu genów. Natomiast adenozyna jest w grasicy wytwarzana przez makrofagi fagocytujące apoptotyczne tymocyty [56]. Receptory A_2A adenozyny znajdują się na powierzchni tymocytów i ich aktywacja prowadzi do syntezy cyklicznego adenozynomonofosforanu (cAMP) [91]. Z kolei aktywacja kinazy białkowej A przez cAMP prowadzi do apoptozy tymocytów [71]. Szlaki biochemiczne aktywowane przez glikokortykoidy i receptor A_2A adenozyny mogą współdziałać w indukcji apoptozy z udziałem białek Bim (Bcl-2-interacting mediator of cell death) [123].

7.2. Sygnały ratujące tymocyty przed programowaną śmiercią

Tymocyty wczesnego stadium DP są chronione przed apoptozą przez białko Bcl-X_L, którego poziom zależy od ekspresji genu aktywowanego przez receptor jądrowy RORγt, a następnie stężenia białek RORγt i Bcl-X_L ulegają obniżeniu [43,96]. Z kolei tymocyty późnego stadium DP przed apoptozą ratuje dopiero indukcja ekspresji genu bcl- 2 przez sygnały selekcji pozytywnej tych tymocytów, których TCRαβ wiąże kompleksy peptyd/MHC na komórkach epitelialnych kory grasicy z powinowactwem wystarczającym do wywołania zmian konformacyjnych kompleksu TCRαβ/CD3 i aktywacji wewnątrzkomórkowych białek sygnałowych [18,80].

Tymocyty, które otrzymały sygnał selekcji pozytywnej wyróżniają się ekspresją CD69 (wczesny marker aktywacji limfocytów T) i zwiększeniem liczby receptorów TCRαβ na powierzchni komórki. Sygnał selekcji pozytywnej powoduje również wyciszenie ekspresji genu kodującego pTα i genów Rag1/Rag2 [109]. Tymocyty późnego stadium DP/CD69⁺ różnicują się w kierunku tymocytów stadium SP (CD4⁺CD8^– lub CD4^–CD8⁺) w zależności od koreceptora (CD4 lub CD8) współdziałającego z TCRαβ w oddziaływaniu z kompleksem peptyd/MHC [54,104].

Tymocyty DP/TCRαβ^niski z receptorem TCRαβ anty-HY/D^b, które jeszcze nie otrzymały sygnału selekcji pozytywnej (gdyż były izolowane z myszy H-2^d), po wszczepieniu do grasicy samicy H-2^b (MHC selekcjonujące pozytywnie) różnicowały się do komórek CD4^–CD8⁺TCRαβ^wysoki, co stanowi bezpośredni dowód na różnicowanie tymocytów DP do tymocytów stadium SP w obecności pozytywnie selekcjonujących kompleksów peptyd/MHC [100]. Proces selekcji pozytywnej tymocytów, ratujący przed zaprogramowaną śmiercią i dostarczający impulsów do dalszego różnicowania w kierunku komórek SP, wymaga wielokrotnych oddziaływań TCRαβ/CD3 z kompleksami peptyd/MHC na komórkach epitelialnych w korze grasicy [53].

7.3. Indukcja apoptozy zależnej od aktywacji TCRαβ/CD3

Tymocyty po selekcji pozytywnej migrują z kory do rdzenia grasicy, czyli do miejsca końcowego dojrzewania komórek T przed opuszczeniem grasicy. Jeżeli jednak TCRαβ tymocytów ma zbyt duże powinowactwo do kompleksu peptyd/MHC na komórkach epitelialnych rdzenia grasicy i na komórkach dendrytycznych, to wówczas takie tymocyty są eliminowane w procesie selekcji negatywnej. Głównym mechanizmem selekcji negatywnej w grasicy jest indukcja apoptozy zależnej od aktywacji TCRαβ/CD3 [93]. Negatywnie selekcjonowane tymocyty oprócz aktywacji TCRαβ/CD3 otrzymują również dodatkowy sygnał nazywany kostymulacją, który może być skutkiem aktywacji CD28 na tymocytach przez ligandy CD80/CD86, występujące na komórkach prezentujących antygeny w rdzeniu grasicy, a więc zarówno na komórkach dendrytycznych, jak i na komórkach epitelialnych [74,95]. Delecję tymocytów DP/TCRαβ^niski w procesie apoptozy indukowanej w wyniku aktywacji autoreaktywnego TCRαβ anty-HY/D^b u samców myszy H-2^b obserwowano jednak na wcześniejszym etapie różnicowania tymocytów jeszcze w korze grasicy [52,99] (ryc. 2). Zatem delecja autoreaktywnych tymocytów może zachodzić zarówno w stadium różnicowania tymocytów DP/TCRαβ^niski w korze grasicy, jak i w późniejszych stadiach dojrzewania tymocytów SP/CD24^wysoki w rdzeniu grasicy [45,50,95,111]. Należy jednak uczynić zastrzeżenie, że istotne rozbieżności między modelami badawczymi w ustaleniu stadium różnicowania tymocytów, które in vivo podlegają procesom selekcji negatywnej, mogą być spowodowane zarówno przedwczesną ekspresją transgenów kodujących TCRαβ, jak też potencjalnymi różnicami w prezentacji selekcjonującego antygenu. Prekursory autoreaktywnych komórek T CD8+ rozpoznających autoantygeny wszędobylskie mogłyby być eliminowane głównie w korze grasicy z udziałem komórek epitelialnych kory grasicy, podczas gdy tymocyty rozpoznające autoantygeny tkankowoswoiste, a zwłaszcza autoreaktywne komórki T CD4⁺ byłyby eliminowane w rdzeniu grasicy przy współudziale komórek dendrytycznych i epitelialnych [74,111]. Należy również podnieść istotne zastrzeżenie do modeli selekcji negatywnej tymocytów in vivo, w których myszom wstrzykuje się przeciwciała anty-TCRαβ/CD3 lub antygeny rozpoznawane przez TCRαβ, gdyż wówczas delecja niedojrzałych tymocytów w grasicy może być indukowana zarówno przez aktywację TCRαβ/CD3 na tymocytach, jak również przez kortykosteron (glikokortykoid) i czynnik martwicy nowotworu (TNF-α), które są uwalniane do krążenia w wyniku aktywacji TCRαβ/CD3 na obwodowych limfocytach T [13,95].

Aby proces selekcji negatywnej był skuteczny w eliminacji autoreaktywnych tymocytów, muszą istnieć mechanizmy prezentacji w grasicy nie tylko antygenów występujących powszechnie na wszystkich komórkach organizmu, ale również mechanizmy ekspresji antygenów tkankowoswoistych. Czynnik transkrypcyjny AIRE (autoimmune regulator) reguluje ekspresję przynajmniej części tkankowoswoistych antygenów w komórkach epitelialnych rdzenia grasicy [4,5]. Antygeny tkankowoswoiste prezentowane przez komórki dendrytyczne pochodzenia szpikowego mogą natomiast pochodzić z fagocytowanych apoptotycznych komórek epitelialnych rdzenia grasicy [27,45,87]. Warto odnotować, że u myszy z nokautem AIRE^–/– wykazano zahamowanie selekcji negatywnej autoreaktywnych tymocytów w stadiach różnicowania DP i SP, co może pośrednio wskazywać na prezentację tkankowoswoistych antygenów również w korze grasicy [66].

Selekcja negatywna tymocytów w grasicy, nazywana centralnym mechanizmem tolerancji immunologicznej, nie jest oczywiście jedynym mechanizmem tolerancji wobec własnych antygenów, tym bardziej że część potencjalnie autoreaktywnych komórek T nie ulega apoptozie i przedostaje się z grasicy do obwodowych narządów limfatycznych [45]. Autoreaktywne obwodowe limfocyty T na skutek ciągłej stymulacji TCRαβ przez autoantygen są eliminowane w procesie apoptozy zależnej od aktywacji receptora Fas przez ligand Fas [98]. Znaczącą rolę w aktywnym utrzymywaniu tolerancji wobec własnych antygenów pełnią komórki T regulatorowe (CD4⁺CD25⁺), których rozwój i aktywność supresorowa zależą od ekspresji i funkcji czynnika transkrypcyjnego Foxp3 [30,46]. Jednak na znaczenie centralnego mechanizmu tolerancji immunologicznej w usuwaniu autoreaktywnych komórek T wskazuje dramatyczne przyspieszenie rozwoju chorób autoimmunizacyjnych i skrócenie czasu życia myszy z podwójnym nokautem AIRE^–/–Foxp^3–/– w porównaniu ze zwierzętami z nokautem jedynie Foxp^3–/– [93].

8. SZLAKI SYGNAŁOWE TCRαβ

Oddziaływanie kompleksu TCRαβ/CD3 komórki T z kompleksem peptyd/MHC na komórce APC wywołuje zmiany konformacyjne wewnątrz kompleksu TCRαβ/CD3, które umożliwiają fosforylację reszt tyrozyny w motywach ITAM przez kinazę białkową LCK, która jest w kompleksie z koreceptorami [55]. W następstwie fosforylacji do miejsc ITAM jest rekrutowana kinaza białkowa ZAP70 oraz białko adaptorowe LAT. Kinaza białkowa ZAP70 fosforyluje reszty tyrozyny w białku LAT [94]. Fosforylowane białko LAT może wiązać fosfolipazę Cγ1 (PLCγ1) oraz białka adaptorowe GRB2 i GADS, które w cytosolu występują w kompleksach GRB2/SOS i GADS/SLP76 (ryc. 3). Oddziaływanie TCRαβ z peptydami selekcjonującymi negatywnie prowadziło do wyższego poziomu fosforylacji białka LAT (i w konsekwencji do rekrutacji kompleksu białek GRB2/SOS), niż w następstwie oddziaływania TCRαβ z peptydami selekcjonującymi pozytywnie [22,82]. Fosfolipaza Cγ1, która za pośrednictwem białek adaptorowych LAT i SLP76 jest rekrutowana do kompleksu białek sygnałowych połączonych z TCRαβ/CD3, wymaga jeszcze aktywacji przez kinazę białkową fosforylującą reszty tyrozyny. Rolę tę pełni kinaza białkowa ITK, która wiąże się z białkiem SLP76 w sąsiedztwie PLCγ1 i jest aktywowana przez kinazę białkową LCK [10] (ryc. 3). Fosfolipaza Cγ1 hydrolizuje fosfatydyloinozytol błony komórkowej do trifosforanu inozytolu (IP3) i diacyloglicerolu (DAG). IP3 jest rozpuszczalny w cytosolu i wiąże się ze swoistymi receptorami w siateczce śródplazmatycznej, co powoduje wzrost stężenia jonów Ca²⁺ w cytosolu, aktywację kalcyneuryny przez Ca²⁺ i zależną od kalcyneuryny translokację czynnika transkrypcyjnego NFAT do jądra komórki. Oddziaływanie TCRαβ z peptydami selekcjonującymi negatywnie prowadziło do większego wzrostu stężenia Ca²⁺ w cytosolu, niż w następstwie oddziaływania TCRαβ z peptydami selekcjonującymi pozytywnie [22]. W przeciwieństwie do IP3, DAG pozostaje w błonie komórkowej i może aktywować kinazy białkowe C i D oraz RasGRP1 (ryc. 3).

Ryc. 3. Kompleks TCRαβ/CD3 aktywuje białka sygnałowe pełniące rolę w selekcji pozytywnej (A) i negatywnej (B) tymocytów. Ciemne figury oznaczają białka niezbędne w selekcji pozytywnej (PLCγ1, RasGRP1, ERK1/2, NFAT) i negatywnej (PLCγ1, GRB2/SOS, MINK, JNK, p38); Ca – kalcyneuryna (fosfataza białkowa serynowo-treoninowa aktywowana przez kalmodulinę/Ca²⁺); CaM – kalmodulina (białko wiążące Ca²⁺); DGK – kinazy diacyloglicerolu; ER – siateczka środplazmatyczna; PIP2 – dwufosforan fosfatydyloinozytolu; PA – kwas fosfatydylowy; PKC – kinaza białkowa C; PKD – kinaza białkowa D. Wyjaśnienie pozostałych oznaczeń jest w wykazie skrótów

Białko RasGRP1 jest wymieniaczem nukleotydu guanozynowego w białkach Ras. Białka Ras w stanie nieaktywnym wiążą GDP. Białko RasGRP1 pobudza dysocjację GDP, co umożliwia zajęcie wolnego miejsca w Ras przez GTP, a to powoduje zmianę konformacji białka i aktywację Ras. Białko RasGRP1 jest niezbędne w selekcji pozytywnej, podczas gdy nie wykazano znaczącej roli tego białka w selekcji negatywnej tymocytów [97]. Białko RasGRP1 w wyniku aktywacji PLCγ1 może być – za pośrednictwem DAG – rekrutowane z cytosolu do błony zewnątrzkomórkowej oraz do błony aparatu Golgiego, gdzie jest aktywowane przez fosforylację przez kinazę białkową C [9,23] (ryc. 3A). Jednak aktywowana przez Ca²⁺ GTPaza Ras (RasGAP) powoduje szybkie wyciszenie aktywacji białka Ras związanego z zewnętrzną błoną komórkową, podczas gdy aktywność Ras związanego z błoną aparatu Golgiego jest długotrwała [9,76] (ryc. 3). Aktywacja Ras przez RasGRP1 prowadzi do aktywacji kinaz białkowych ERK1/ERK2, które pobudzają selekcję pozytywną tymocytów [96].

W wyniku aktywacji TCRαβ/CD3 do białka LAT – za pośrednictwem białka GADS – jest rekrutowane wspomniane biało adaptorowe SLP76. Kinaza białkowa ZAP70 fosforyluje reszty tyrozyny w białku SLP76, które wówczas stają się miejscem rekrutacji kolejnych białek. Do białka SLP76 jest m.in. rekrutowane białko VAV, biorące udział w aktywacji białek RAC/CDC42, które biorą udział w przebudowie szkieletu komórki T w regionie tzw. synapsy immunologicznej, utworzonej między komórką T i komórką APC [35,75,105]. Białka adaptorowe LAT i SLP76 stanowią rusztowanie dla białek, które w następstwie aktywacji TCRαβ/CD3 są w sposób skoordynowany rekrutowane do wieloskładnikowego kompleksu, stabilizowanego dzięki wzajemnym oddziaływaniom tworzących go składników [59]. Na przykład rekrutacja PLCγ1 wymaga związania tego enzymu zarówno z białkiem LAT, jak i z białkiem SLP76 (ryc. 3). Wspomniane białko VAV jest niezbędne zarówno w pozytywnej, jak i negatywnej selekcji tymocytów, gdyż VAV dzięki oddziaływaniu z innymi białkami stabilizuje strukturę wieloskladnikowego kompleksu białek połączonych z TCRαβ/ CD3 i w ten sposób przyczynia się nawet do aktywacji PLCγ1 [58,59,105].

Proponowany model aktywacji TCRαβ/CD3 zakłada zróżnicowaną rekrutację białek sygnałowych do kompleksu TCRαβ/CD3 w zależności od siły wiązania kompleksu peptyd/MHC przez TCRαβ i od czasu trwania aktywacji TCRαβ/CD3 [45,80,82,96]. Na przykład rekrutacja białka adaptorowego NCK do białka SLP76 wymaga odpowiednich zmian konformacyjnych w części cytoplazmatycznej CD3ε, zachodzących w wyniku oddziaływania TCRαβ/CD3 z kompleksem peptyd/MHC [31]. Do białka NCK może być rekrutowana kinaza białkowa serynowo- treoninowa MINK, która jest niezbędna w selekcji negatywnej tymocytów (ryc. 3B). Szlak sygnałowy zależny od aktywności kinazy białkowej MINK nie został wyjaśniony, chociaż udokumentowano udział MINK w szlakach sygnałowych prowadzących do aktywacji kinaz białkowych JNK i indukcji ekspresji proapoptotycznego genu bim w tymocytach [73].

Reasumując:
(1) struktura kompleksu białek rekrutowanych do TCRαβ/ CD3 jest zależna od powinowactwa TCRαβ do kompleksu peptyd/MHC;
(2) w zależności od składu kompleksu białek związanych z TCRαβ/CD3 mogą w nim przeważać białka, których aktywność prowadzi do selekcji pozytywnej lub negatywnej tymocytów. Na przykład RasGRP1 pełni istotną rolę w selekcji pozytywnej, podczas gdy kinaza białkowa MINK pełni istotną rolę w selekcji negatywnej tymocytów.

8.1. Rola aktywacji kinaz białkowych ERK1/ERK2 w selekcji pozytywnej oraz kinaz białkowych JNK w selekcji negatywnej tymocytów

W wyniku oddziaływania TCRαβ z ligandami selekcjonującymi pozytywnie dochodzi do aktywacji białka RasGRP1 przez diacyloglirerol (DAG) w błonie aparatu Golgiego i następnie do słabej, ale długotrwałej aktywacji kinaz białkowych ERK1/ERK2, których aktywność jest niezbędna do selekcji pozytywnej tymocytów [22,96] (ryc. 3A). Jednak zbyt duża aktywność kinaz białkowych ERK1/ERK2 może hamować różnicowanie tymocytów z późnego stadium DP/ CD69⁺ do stadium SP, co zostało wykazane u myszy z nokautem izoform kinazy diacyloglicerolu [40].

W wyniku oddziaływania TCRαβ z ligandami selekcjonującymi negatywnie dochodzi natomiast do aktywacji kinazy białkowej MINK oraz rekrutacji kompleksu białek GRB2/ SOS do LAT (ryc. 3B). Białko SOS jest wymieniaczem GDP/GTP w białku Ras, którego aktywność jest jeszcze wzmacniana przez aktywny Ras [23]. Rekrutacja kompleksu GRB2/SOS do LAT prowadzi więc do silnej aktywacji Ras oraz silnej, ale krótkotrwałej aktywacji ERK1/ERK2 [96]. Powyżej zaznaczono, że selekcja pozytywna wymaga słabej i długotrwałej aktywności ERK1/ERK2, podczas gdy krótkotrwała i silna aktywacja ERK1/ERK2 raczej powoduje apoptozę tymocytów. Aktywacja genów ściśle zależy od czasu trwania aktywacji kinaz białkowych. Na przykład krótkotrwała aktywacja ERK1/ERK2 jest wystarczająca do indukcji ekspresji c-fos, ale fosforylacja i stabilizacja białka c-Fos wymaga już dłuższego czasu aktywacji ERK1/ERK2 [7,78]. Od aktywności kinazy białkowej MINK i od białka GRB2 zależy aktywacja kinaz białkowych JNK i p38 w tymocytach selekcjonowanych negatywnie [33,73] (ryc. 3B). Dominujący negatywny mutant Ras nie powodował obniżenia zależnej od białka GRB2 aktywacji kinaz białkowych JNK, co wskazuje na niezależną od Ras aktywację kinaz białkowych JNK [33]. Tymocyty DP myszy z nokautami izoform JNK odznaczały się natomiast opornością na indukcję apoptozy przez przeciwciała anty-CD3 in vivo oraz in vitro, co wskazuje na zaangażowanie kinaz białkowych JNK w selekcji negatywnej tymocytów [85,86]. Reasumując, aktywacja kinaz białkowych ERK1/ERK2 jest niezbędna do selekcji pozytywnej tymocytów, podczas gdy kinazy białkowe MINK i JNK przekazują sygnały do selekcji negatywnej. Kinazy białkowe MINK i JNK indukują m.in. ekspresję genu proapoptotycznego bim [73].

8.2. Rola białka Bim w selekcji negatywnej tymocytów

Białko Bim należy do grupy białek zawierających tylko proapoptotyczną sekwencję BH3 (tzn. nie zawiera charakterystycznych dla białek rodziny Bcl-2 domen BH1, BH2 i BH4). Za pośrednictwem proapoptotycznej sekwencji BH3 białko Bim może się wiązać z białkami antyapoptotycznymi rodziny Bcl-2 i inaktywować ich funkcję antyapoptotyczną [122]. Alternatywne składanie eksonów prowadzi do powstawania kilku izoform Bim, wśród których są zawierające sekwencję BH3 izoformy Bim_AD, Bim_S, Bim_L oraz Bim_EL [69]. Izoformy Bim_AD i Bim_S mogą przez bezpośrednie oddziaływanie aktywować proapoptotyczne białko Bax [69].

U samców myszy z haplotypem H-2^b, które zawierają transgeny kodujące receptor TCRαβ rozpoznający samczy antygen HY w kontekście H-2D^b (TCRαβ anty-HY/D^b), delecji ulegają tymocyty DP rozpoznające autoantygen [52] (ryc. 2). Obserwowano natomiast całkowite zahamowanie delecji autoreaktywnych tymocytów z TCRαβ anty-HY/ D^b u samców (HY+H-2^b) myszy z nokautem bim^–/– [12]. Tymocyty DP izolowane z myszy bim^–/– były również oporne na indukcję apoptozy w wyniku poliklonalnej aktywacji TCRαβ/CD3 in vitro z użyciem przeciwciał anty-CD3ε/ CD28 lub traktowania jonoforem Ca²⁺ [11,12]. Obserwacje te wskazują na białko Bim, które w tymocytach jest niezbędne do apoptozy inicjowanej przez aktywację TCRαβ/ CD3 i wzrost stężenia jonów Ca²⁺ w cytosolu.

Sygnał selekcji negatywnej powoduje wzrost stężenia białka BimS, które ulega translokacji do mitochondrium [8,17]. Mechanizm indukcji ekspresji bim w tymocytach nie został jeszcze wyjaśniony. Postuluje się natomiast udział kinaz białkowych MINK i JNK w regulacji ekspresji bim [93]. Kinazy białkowe JNK fosforylują reszty seryny w białku c-Jun powodując aktywację czynnika transkrypcyjnego AP-1, który może uczestniczyć w aktywacji genu bim [90]. Sygnał selekcji negatywnej prowadzi także do syntezy białek Bim_L i Bim_EL [89]. Jednak izoformy Bim_L i Bim_EL mogą być sekwestrowane w cytosolu i ich translokacja do mitochondrium zależy od fosforylacji Bim przez kinazy białkowe JNK [64].

Białko Bim indukuje apoptozę zależną od aktywacji kaspazy 9 w apoptosomie z udziałem cytochromu c i białka APAF-1. Jednak w przeciwieństwie do całkowitego zahamowania delecji tymocytów z autoreaktywnym TCRαβ (TCRαβ anty-HY/D^b) u myszy z nokautem bim^–/–, stwierdzono jedynie częściowe zahamowanie apoptozy tymocytów z autoreaktywnym TCRαβ u myszy z nokautem APAF-1^–/– lub kaspazy 9^–/– [41,106]. Postuluje się, że oprócz apoptozy zależnej od apoptosomu (cytochrom c/APAF-1/ kaspaza 9), także inne mechanizmy apoptozy zależnej od mitochondrium mogą brać udział w eliminacji autoreaktywnych tymocytów [61,70,92].

8.3. Rola sierocego receptora jądrowego Nur77 w selekcji negatywnej tymocytów

Sygnał selekcji negatywnej tymocytów powoduje skoordynowaną zmianę ekspresji wielu genów kodujących zarówno czynniki transkrypcyjne, jak i białka przyczyniające się do zmniejszenia adhezji tymocytów do macierzy międzykomórkowej i zwiększenia adhezji do sąsiednich komórek oraz do indukcji apoptozy [89]. Kompleksowa analiza ekspresji genów w kilku modelach doświadczalnych selekcji negatywnej tymocytów wskazuje na wzrost ekspresji m.in. genu wczesnej odpowiedzi, który koduje czynnik transkrypcyjny Nur77 [8,89]. Nur77 i homologiczne białko Nor-1 należą do nadrodziny receptorów jądrowych, obejmującej także klasyczne receptory hormonów steroidowych. Jednak Nur77 i Nor-1 są receptorami sierocymi, gdyż nie jest znany ich ligand, a badania strukturalne wykazały, że Nur77 nie ma nawet kieszeni mogącej pomieścić ligand [29]. Ekspresję genów nur77 i nor-1 obserwowano w apoptotycznych tymocytach myszy, którym podawano dootrzewnowo przeciwciała anty-CD3 [20]. Także aktywacja in vitro kompleksu TCRαβ/CD3 w hybrydoma limfocytu T prowadziła do utrzymującej się kilkanaście godzin ekspresji nur77 i apoptozy komórek, podczas gdy traktowanie estrem forbolu powodowało jedynie krótkotrwałą indukcję ekspresji nur77, której nie towarzyszyła apoptoza komórek [67,118]. Masową apoptozę tymocytów DP obserwowano również w grasicach myszy z ekspresją transgenów nur77 lub nor-1, podczas gdy tymocyty DN charakteryzowały się opornością na indukcję apoptozy przez Nur77 i Nor-1 [16,20,116]. Analiza ekspresji Nur77 w subpopulacjach tymocytów izolowanych z prawidłowych myszy szczepu C57BL/6 wykazała ekspresję Nur77 w tymocytach DP/CD69⁺ kory grasicy oraz w niedojrzałych tymocytach SP/CD24^wysoki rdzenia grasicy, a więc w tymocytach wrażliwych na selekcję negatywną [21].

Wyciszenie ekspresji genu nur77 lub hamowanie funkcji białka Nur77 (przez dominujący negatywny mutant Nur77) prowadziły do hamowania apoptozy hybrydoma komórek T w odpowiedzi na aktywację TCRαβ/CD3 [67,118]. Dominujący negatywny mutant Nur77 hamował in vivo delecję autoreaktywnych tymocytów z TCRαβ anty- HY/D^b u samców (HY+H-2^b), co wskazuje na udział Nur77 w procesie selekcji negatywnej tymocytów [124]. Jednak u myszy z nokautem nur77^–/– nie stwierdzono zaburzenia procesu selekcji negatywnej tymocytów [63]. Przypuszczalnie białko Nor-1 może w tymocytach zastępować Nur77 w szlakach sygnałowych apoptozy zależnej od aktywacji TCRαβ/CD3 lub selekcja negatywna tymocytów może zachodzić bez udziału białek Nur77. Myszy z podwójnym nokautem nur77^–/–nor-1^–/– nie przeżywały miesiąca z powodu ostrych białaczek szpikowych, pozostawiając bez odpowiedzi pytania o wrażliwość tymocytów nur77^–/–nor-1^–/– na apoptozę w odpowiedzi na aktywację TCRαβ/CD3 [77].

Podsumowując, Nur77 powoduje apoptozę tymocytów w odpowiedzi na aktywację TCRαβ/CD3, ale w przeciwieństwie do Bim, selekcja negatywna tymocytów przypuszczalnie może zachodzić także bez udziału Nur77. Białko Nur77 pełni funkcję aktywatora transkrypcji w jądrze komórki i może również przekazywać sygnał do zmiany konformacji białka Bcl-2 w błonie mitochondrium [57]. Oddziaływanie białek Nur77 i Bcl-2 może prowadzić do wyciszenia antyapoptotycznej funkcji Bcl-2 i ekspozycji przez Bcl-2 proapoptotycznej sekwencji BH3, która z kolei może wyciszać antyapoptotyczną funkcję białka Bcl-X_L [57,65]. Przypuszczalnie białko Nur77, indukowane w tymocytach w następstwie aktywacji TCRαβ/CD3 przez kompleks peptyd/MHC selekcjonujący negatywnie, może wspomagać białko Bim w indukcji apoptozy tymocytów rozpoznających własne antygeny organizmu.

9. PODSUMOWANIE

Istotą różnicowania tymocytów są rearanżacje genów kodujących receptory antygenowe (TCRαβ i TCRγδ), w połączeniu z selekcją prekursorów limfocytów T zawierających receptory użyteczne w rozpoznaniu obcych antygenów. TCRαβ może być użyteczny w rozpoznaniu obcego antygenu, jeżeli rozpoznaje własne MHC, ale nie rozpoznaje prezentowanych w kontekście MHC własnych antygenów organizmu. Procesy selekcji i ekspansji tymocytów zawierających użyteczny produkt zrearanżowanych genów (TCRγδ, pre-TCR, TCRαβ) są regulowane przez wiele czynników transkrypcyjnych, w tym przez sieroce receptory jądrowe RORγt i Nur77. Sierocy receptor jądrowy RORγt jest niezbędny w różnicowaniu tymocytów stadium ISP (z pre- TCR) do tymocytów DP (z TCRαβ) oraz w przeżyciu tymocytów wczesnego stadium DP, gdyż RORγt reguluje poziom antyapoptotycznego białka Bcl-X_L. W kolejnych stadiach rozwojowych tymocytów aktywacja TCRαβ dostarcza zarówno sygnałów ratujących przed apoptozą tymocyty z TCRαβ użytecznym, jak i sygnałów indukujących apoptozę tymocytów z TCRαβ wykazującym zbyt duże powinowactwo do własnych antygenów w kontekście MHC. W wyniku oddziaływania TCRαβ z ligandami selekcjonującymi negatywnie jest indukowana ekspresja m.in. genów kodujących proapoptotyczne białko Bim i sierocy receptor jądrowy Nur77. Białko Bim, które jest niezbędne w selekcji negatywnej tymocytów, może bezpośrednio aktywować proapoptotyczne białko Bax prowadząc do aktywacji kaspaz i fazy egzekucyjnej apoptozy. Natomiast rola Nur77 w selekcji negatywnej tymocytów nie została w pełni wyjaśniona. Ekspresja genu nur77 prowadzi do apoptozy tymocytów, ale selekcja negatywna tymocytów może zachodzić także bez udziału Nur77. Białko Nur77 może pełnić funkcję zarówno aktywatora transkrypcji genów, jak i poprzez oddziaływanie z białkami na powierzchni mitochondrium może prowadzić do wyciszenia antyapoptotycznej funkcji białek Bcl-2 i Bcl-X_L. Przypuszczalnie białko Nur77 może wspomagać białko Bim w indukcji apoptozy tymocytów rozpoznających własne antygeny organizmu, co wymaga potwierdzenia w dalszych badaniach.

PODZIĘKOWANIA

Dziękuję Panu Profesorowi Piotrowi Kuśnierczykowi i Pani Doktor Dagmarze Kłopotowskiej za cenne uwagi merytoryczne i redakcyjne.

PIŚMIENNICTWO

[1] Adams J.M., Cory S.: The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science, 1998; 281: 1322-1326
[PubMed]  

[2] Aifantis I., Mandal M., Sawai K., Ferrando A., Vilimas T.: Regulation of T-cell progenitor survival and cell-cycle entry by the pre-T-cell receptor. Immunol. Rev., 2006; 209: 159-169
[PubMed]  

[3] Aifantis I., Raetz E., Buonamici S.: Molecular pathogenesis of T-cell leukaemia and lymphoma. Nat. Rev. Immunol., 2008; 8: 380-390
[PubMed]  

[4] Anderson G., Lane P.J., Jenkinson E.J.: Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol., 2007; 7: 954-963
[PubMed]  

[5] Anderson M.S., Venanzi E.S., Klein L., Chen Z., Berzins S.P., Turley S.J., von Boehmer H., Bronson R., Dierich A., Benoist C., Mathis D.: Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science, 2002; 298: 1395-1401
[PubMed]  

[6] Ashwell J.D., Lu F.W., Vacchio M.S.: Glucocorticoids in T cell development and function. Annu. Rev. Immunol., 2000; 18: 309-345
[PubMed]  

[7] Assoian R.K.: Common sense signalling. Nat. Cell Biol., 2002; 4: E187-E188
[PubMed]  

[8] Baldwin T.A., Hogquist K.A.: Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol., 2007; 179: 837-844
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[9] Bivona T.G., Perez De Castro I., Ahearn I.M., Grana T.M., Chiu V.K., Lockyer P.J., Cullen P.J., Pellicer A., Cox A.D., Philips M.R.: Phospholipase Cγ activates Ras on the Golgi apparatus by means of RasGRP1. Nature, 2003; 424: 694-698
[PubMed]  

[10] Bogin Y., Ainey C., Beach D., Yablonski D.: SLP-76 mediates and maintains activation of the Tec family kinase ITK via the T cell antigen receptor-induced association between SLP-76 and ITK. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007; 104: 6638-6643
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[11] Bouillet P., Metcalf D., Huang D.C., Tarlinton D.M., Kay T.W., Köntgen F., Adams J.M., Strasser A.: Proapoptotic Bcl-2 relative Bim required for certain apoptotic responses, leukocyte homeostasis, and to preclude autoimmunity. Science, 1999; 286: 1735-1738
[PubMed]  

[12] Bouillet P., Purton J.F., Godfrey D.I., Zhang L.C., Coultas L., Puthalakath H., Pellegrini M., Cory S., Adams J.M., Strasser A.: BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature, 2002; 415: 922-926
[PubMed]  

[13] Brewer J.A., Kanagawa O., Sleckman B.P., Muglia L.J.: Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol., 2002; 169: 1837-1843
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[14] Brown G., Hughes P.J., Michell R.H., Rolink A.G., Ceredig R.: The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol., 2007; 28: 442-448
[PubMed]  

[15] Bruno L., Fehling H.J., von Boehmer H.: The αβ T cell receptor can replace the γδ receptor in the development of γδ lineage cells. Immunity, 1996; 5: 343-352
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[16] Calnan B.J., Szychowski S., Chan F.K., Cado D., Winoto A.: A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity, 1995; 3: 273-282
[PubMed]  

[17] Cante-Barrett K., Gallo E.M., Winslow M.M., Crabtree G.R.: Thymocyte negative selection is mediated by protein kinase C- and Ca²⁺-dependent transcriptional induction of bim. J. Immunol., 2006; 176: 2299-2306
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[18] Chao D.T., Korsmeyer S.J.: BCL-2 family: regulators of cell death. Annu. Rev. Immunol., 1998; 16: 395-419
[PubMed]  

[19] Chawla A., Repa J.J., Evans R.M., Mangelsdorf D.J.: Nuclear receptors and lipid physiology: opening the X-files. Science, 2001; 294: 1866-1870
[PubMed]  

[20] Cheng L.E., Chan F.K., Cado D., Winoto A.: Functional redundancy of the Nur77 and Nor-1 orphan steroid receptors in T-cell apoptosis. EMBO J., 1997; 16: 1865-1875
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[21] Cho H.J., Edmondson S.G., Miller A.D., Sellars M., Alexander S.T., Somersan S., Punt J.A.: Cutting edge: identification of the targets of clonal deletion in an unmanipulated thymus. J. Immunol., 2003; 170: 10-13
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[22] Daniels M.A., Teixeiro E., Gill J., Hausmann B., Roubaty D., Holmberg K., Werlen G., Hollander G.A., Gascoigne N.R., Palmer E.: Thymic selection threshold defined by compartmentalization of Ras/MAPK signalling. Nature, 2006; 444: 724-729
[PubMed]  

[23] Das J., Ho M., Zikherman J., Govern C., Yang M., Weiss A., Chakraborty A.K., Roose J.P.: Digital signaling and hysteresis characterize ras activation in lymphoid cells. Cell, 2009; 136: 337-351
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[24] Dengjel J., Schoor O., Fischer R., Reich M., Kraus M., Müller M., Kreymborg K., Altenberend F., Brandenburg J., Kalbacher H., Brock R., Driessen C., Rammensee H.G., Stevanovic S.: Autophagy promotes MHC class II presentation of peptides from intracellular source proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005; 102: 7922-7927
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[25] Di Santo J.P.: Natural killer cell developmental pathways: a question of balance. Annu. Rev. Immunol., 2006; 24: 257-286
[PubMed]  

[26] Dzhagalov I., Zhang N., He Y.W.: The roles of orphan nuclear receptors in the development and function of the immune system. Cell. Mol. Immunol., 2004; 1: 401-407
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[27] Ferrero I., Mancini S.J., Grosjean F., Wilson A., Otten L., MacDonald H.R.: TCRγ silencing during αβ T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol., 2006; 177: 6038-6043
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[28] Ferguson B.J., Cooke A., Peterson P., Rich T.: Death in the AIRE. Trends Immunol., 2008; 29: 306-312
[PubMed]  

[29] Flaig R., Greschik H., Peluso-Iltis C., Moras D.: Structural basis for the cell-specific activities of the NGFI-B and the Nurr1 ligand-binding domain. J. Biol. Chem., 2005; 280: 19250-19258
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[30] Fontenot J.D., Rudensky A.Y.: A well adapted regulatory contrivance: regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3. Nat. Immunol., 2005; 6: 331-337
[PubMed]  

[31] Gil D., Schamel W.W., Montoya M., Sanchez-Madrid F., Alarcon B.: Recruitment of Nck by CD3 epsilon reveals a ligand-induced conformational change essential for T cell receptor signaling and synapse formation. Cell, 2002; 109: 901-912
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[32] Godfrey D.I., Kennedy J., Suda T., Zlotnik A.: A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3^–CD4^–CD8^– triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression. J. Immunol., 1993; 150: 4244-4252
[PubMed]  

[33] Gong Q., Cheng A.M., Akk A.M., Alberola-Ila J., Gong G., Pawson T., Chan A.C.: Disruption of T cell signaling networks and development by Grb2 haploid insufficiency. Nat. Immunol., 2001; 2: 29-36
[PubMed]  

[34] Goodnow C.C., Sprent J., Fazekas de St Groth B., Vinuesa C.G.: Cellular and genetic mechanisms of self tolerance and autoimmunity. Nature, 2005; 435: 590-597
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[35] Grakoui A., Bromley S.K., Sumen C., Davis M.M., Shaw A.S., Allen P.M., Dustin M.L.: The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science, 1999; 285: 221-227
[PubMed]  

[36] Groettrup M., Ungewiss K., Azogui O., Palacios R., Owen M.J., Hayday A.C., von Boehmer H.: A novel disulfide-linked heterodimer on pre-T cells consists of the T cell receptor β chain and a 33 kd glycoprotein. Cell, 1993; 75: 283-294
[PubMed]  

[37] Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L., Thery C., Amigorena S.: Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annu. Rev. Immunol., 2002; 20: 621-667
[PubMed]  

[38] Guidos C.J.: Synergy between the pre-T cell receptor and Notch: cementing the αβ lineage choice. J. Exp. Med., 2006; 203: 2233-2237
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[39] Guo J., Hawwari A., Li H., Sun Z., Mahanta S.K., Littman D.R., Krangel M.S., He Y.W.: Regulation of the TCRalpha repertoire by the survival window of CD4(+)CD8(+) thymocytes. Nat. Immunol., 2002; 3: 469-476
[PubMed]  

[40] Guo R., Wan C.K., Carpenter J.H., Mousallem T., Boustany R.M., Kuan C.T., Burks A.W., Zhong X.P.: Synergistic control of T cell development and tumor suppression by diacylglycerol kinase α and ζ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008; 105: 11909-11914
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[41] Hara H., Takeda A., Takeuchi M., Wakeham A.C., Itie A., Sasaki M., Mak T.W., Yoshimura A., Nomoto K., Yoshida H.: The apoptotic protease-activating factor 1-mediated pathway of apoptosis is dispensable for negative selection of thymocytes. J. Immunol., 2002; 168: 2288-2295
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[42] Hayes S.M., Li L., Love P.E.: TCR signal strength influences αβ/γδ lineage fate. Immunity, 2005; 22: 583-593
[PubMed]  

[43] He Y.W.: Orphan nuclear receptors in T lymphocyte development. J. Leukoc. Biol., 2002; 72: 440-446
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[44] Heath W.R., Belz G.T., Behrens G.M., Smith C.M., Forehan S.P., Parish I.A., Davey G.M., Wilson N.S., Carbone F.R., Villadangos J.A.: Cross-presentation, dendritic cell subsets, and the generation of immunity to cellular antigens. Immunol. Rev., 2004; 199: 9-26
[PubMed]  

[45] Hogquist K.A., Baldwin T.A., Jameson S.C.: Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol., 2005; 5: 772-782
[PubMed]  

[46] Hori S., Nomura T., Sakaguchi S.: Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science, 2003; 299: 1057-1061
[PubMed]  

[47] Jensen P.E.: Recent advances in antigen processing and presentation. Nat. Immunol., 2007; 8: 1041-1048
[PubMed]  

[48] Jondal M., Pazirandeh A., Okret S.: Different roles for glucocorticoids in thymocyte homeostasis? Trends Immunol., 2004; 25: 595-600
[PubMed]  

[49] Kawamoto H.: A close developmental relationship between the lymphoid and myeloid lineages. Trends Immunol., 2006; 27: 169-175
[PubMed]  

[50] Kishimoto H., Sprent J.: Negative selection in the thymus includes semimature T cells. J. Exp. Med., 1997; 185: 263-271
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[51] Kisielow P.: Development and selection of T cells: how many subsets? How many rules? Arch. Immunol. Ther. Exp., 2003; 51: 407-414
[PubMed]  

[52] Kisielow P., Bluthmann H., Staerz U.D., Steinmetz M., von Boehmer H.: Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4⁺8⁺ thymocytes. Nature, 1988; 333: 742-746
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[53] Kisielow P., Miazek A.: Positive selection of T cells: rescue from programmed cell death and differentiation require continual engagement of the T cell receptor. J. Exp. Med., 1995; 181: 1975-1984
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[54] Kisielow P., Teh H.S., Bluthmann H., von Boehmer H.: Positive selection of antigen-specific T cells in thymus by restricting MHC molecules. Nature, 1988; 335: 730-733
[PubMed]  

[55] Kisielow P., von Boehmer H.: Development and selection of T cells: facts and puzzles. Adv. Immunol., 1995; 58: 87-209
[PubMed]  

[56] Kiss I., Oskolas H., Toth R., Bouillet P., Toth K., Fulop A., Scholtz B., Ledent C., Fesus L., Szondy Z.: Adenosine A2A receptor-mediated cell death of mouse thymocytes involves adenylate cyclase and Bim and is negatively regulated by Nur77. Eur. J. Immunol., 2006; 36: 1559-1571
[PubMed]  

[57] Kolluri S.K., Zhu X., Zhou X., Lin B., Chen Y., Sun K., Tian X., Town J., Cao X., Lin F., Zhai D., Kitada S., Luciano F., O’Donnell E., Cao Y., He F., Lin J., Reed J.C., Satterthwait A.C., Zhang X.K.: A short Nur77-derived peptide converts Bcl-2 from a protector to a killer. Cancer Cell, 2008; 14: 285-298
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[58] Kong Y.Y., Fischer K.D., Bachmann M.F., Mariathasan S., Kozieradzki I., Nghiem M.P., Bouchard D., Bernstein A., Ohashi P.S., Penninger J.M.: Vav regulates peptide-specific apoptosis in thymocytes. J. Exp. Med., 1998; 188: 2099-2111
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[59] Koretzky G.A., Abtahian F., Silverman M.A.: SLP76 and SLP65: complex regulation of signalling in lymphocytes and beyond. Nat. Rev. Immunol., 2006; 6: 67-78
[PubMed]  

[60] Kreslavsky T., Garbe A.I., Krueger A., von Boehmer H.: T cell receptor-instructed αβ versus γδ lineage commitment revealed by single-cell analysis. J. Exp. Med., 2008; 205: 1173-1186
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[61] Kroemer G., Galluzzi L., Brenner C.: Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev., 2007; 87: 99-163
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[62] Lauritsen J.P., Haks M.C., Lefebvre J.M., Kappes D.J., Wiest D.L.: Recent insights into the signals that control αβ/γδ-lineage fate. Immunol. Rev., 2006; 209: 176-190
[PubMed]  

[63] Lee S.L., Wesselschmidt R.L., Linette G.P., Kanagawa O., Russell J.H., Milbrandt J.: Unimpaired thymic and peripheral T cell death in mice lacking the nuclear receptor NGFI-B (Nur77). Science, 1995; 269: 532-535
[PubMed]  

[64] Lei K., Davis R.J.: JNK phosphorylation of Bim-related members of the Bcl2 family induces Bax-dependent apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: 2432-2437
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[65] Lin B., Kolluri S.K., Lin F., Liu W., Han Y.H., Cao X., Dawson M.I., Reed J.C., Zhang X.K.: Conversion of Bcl-2 from protector to killer by interaction with nuclear orphan receptor Nur77/TR3. Cell, 2004; 116: 527-540
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[66] Liston A., Lesage S., Wilson J., Peltonen L., Goodnow C.C.: Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol., 2003; 4: 350-354
[PubMed]  

[67] Liu Z.G., Smith S.W., McLaughlin K.A., Schwartz L.M., Osborne B.A.: Apoptotic signals delivered through the T-cell receptor of a T-cell hybrid require the immediate-early gene nur77. Nature, 1994; 367: 281-284
[PubMed]  

[68] Mandal M., Borowski C., Palomero T., Ferrando A.A., Oberdoerffer P., Meng F., Ruiz-Vela A., Ciofani M., Zuniga-Pflucker J.C., Screpanti I., Look A.T., Korsmeyer S.J., Rajewsky K., von Boehmer H., Aifantis I.: The BCL2A1 gene as a pre-T cell receptor-induced regulator of thymocyte survival. J. Exp. Med., 2005; 201: 603-614
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[69] Marani M., Tenev T., Hancock D., Downward J., Lemoine N.R.: Identification of novel isoforms of the BH3 domain protein Bim which directly activate Bax to trigger apoptosis. Mol. Cell. Biol., 2002; 22: 3577-3589
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[70] Marsden V.S., O’Connor L., O’Reilly L.A., Silke J., Metcalf D., Ekert P.G., Huang D.C., Cecconi F., Kuida K., Tomaselli K.J., Roy S., Nicholson D.W., Vaux D.L., Bouillet P., Adams J.M., Strasser A.: Apoptosis initiated by Bcl-2-regulated caspase activation independently of the cytochrome c/Apaf-1/caspase-9 apoptosome. Nature, 2002; 419: 634-637
[PubMed]  

[71] Matuszyk J., Cebrat M., Kalas W., Strzadala L.: HA1004, an inhibitor of serine/threonine protein kinases, restores the sensitivity of thymic lymphomas to Ca²⁺-mediated apoptosis through a protein kinase A-independent mechanism. Int. Immunopharmacol., 2002; 2: 435-442
[PubMed]  

[72] Matuszyk J., Strządała L.: Regulacja ekspresji i funkcji receptorów jądrowych rodziny Nur77 i ich udział w kontrolnych punktach szlaków sygnałowych prowadzących do apoptozy, różnicowania i produkcji hormonów steroidowych. Post. Biol. Kom., 2002; 29: 61-80
[Abstract]  

[73] McCarty N., Paust S., Ikizawa K., Dan I., Li X., Cantor H.: Signaling by the kinase MINK is essential in the negative selection of autoreactive thymocytes. Nat. Immunol., 2005; 6: 65-72
[PubMed]  

[74] McCaughtry T.M., Hogquist K.A.: Central tolerance: what have we learned from mice? Semin. Immunopathol., 2008; 30: 399-409
[PubMed]  

[75] Monks C.R., Freiberg B.A., Kupfer H., Sciaky N., Kupfer A.: Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature, 1998; 395: 82-86
[PubMed]  

[76] Mor A., Philips M.R.: Compartmentalized Ras/MAPK signaling. Annu. Rev. Immunol., 2006; 24: 771-800
[PubMed]  

[77] Mullican S.E., Zhang S., Konopleva M., Ruvolo V., Andreeff M., Milbrandt J., Conneely O.M.: Abrogation of nuclear receptors Nr4a3 and Nr4a1 leads to development of acute myeloid leukemia. Nat. Med., 2007; 13: 730-735
[PubMed]  

[78] Murphy L.O., Smith S., Chen R.H., Fingar D.C., Blenis J.: Molecular interpretation of ERK signal duration by immediate early gene products. Nat. Cell Biol., 2002; 4: 556-564
[PubMed]  

[79] Narayan K., Kang J.: Molecular events that regulate αβ versus γδ T cell lineage commitment: old suspects, new players and different game plans. Curr. Opin. Immunol., 2007; 19: 169-175
[PubMed]  

[80] Palmer E., Naeher D.: Affinity threshold for thymic selection through a T-cell receptor-co-receptor zipper. Nat. Rev. Immunol., 2009; 9: 207-213
[PubMed]  

[81] Petrie H.T., Hugo P., Scollay R., Shortman K.: Lineage relationships and developmental kinetics of immature thymocytes: CD3, CD4, and CD8 acquisition in vivo and in vitro. J. Exp. Med., 1990; 172: 1583-1588
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[82] Prasad A., Zikherman J., Das J., Roose J.P., Weiss A., Chakraborty A.K.: Origin of the sharp boundary that discriminates positive and negative selection of thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009; 106: 528-533
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[83] Rathmell J.C., Lindsten T., Zong W.X., Cinalli R.M., Thompson C.B.: Deficiency in Bak and Bax perturbs thymic selection and lymphoid homeostasis. Nat. Immunol., 2002; 3: 932-939
[PubMed]  

[84] Rothenberg E.V., Moore J.E., Yui M.A.: Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol., 2008; 8: 9-21
[PubMed]  

[85] Sabapathy K., Hu Y., Kallunki T., Schreiber M., David J.P., Jochum W., Wagner E.F., Karin M.: JNK2 is required for efficient T-cell activation and apoptosis but not for normal lymphocyte development. Curr. Biol., 1999; 9: 116-125
[PubMed]  

[86] Sabapathy K., Kallunki T., David J.P., Graef I., Karin M., Wagner E.F.: c-Jun NH2-terminal kinase (JNK)1 and JNK2 have similar and stage-dependent roles in regulating T cell apoptosis and proliferation. J. Exp. Med., 2001; 193: 317-328
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[87] Savill J., Fadok V.: Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature, 2000; 407: 784-788
[PubMed]  

[88] Schlissel M.S., Durum S.D., Muegge K.: The interleukin 7 receptor is required for T cell receptor γ locus accessibility to the V(D)J recombinase. J. Exp. Med., 2000; 191: 1045-1050
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[89] Schmitz I., Clayton L.K., Reinherz E.L.: Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo. Int. Immunol., 2003; 15: 1237-1248
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[90] Shaulian E., Karin M.: AP-1 as a regulator of cell life and death. Nat. Cell Biol., 2002; 4: E131- E136
[PubMed]  

[91] Sitkovsky M.V., Lukashev D., Apasov S., Kojima H., Koshiba M., Caldwell C., Ohta A., Thiel M.: Physiological control of immune response and inflammatory tissue damage by hypoxia-inducible factors and adenosine A2A receptors. Annu. Rev. Immunol., 2004; 22: 657-682
[PubMed]  

[92] Sohn S.J., Rajpal A., Winoto A.: Apoptosis during lymphoid development. Curr. Opin. Immunol., 2003; 15: 209-216
[PubMed]  

[93] Sohn S.J., Thompson J., Winoto A.: Apoptosis during negative selection of autoreactive thymocytes. Curr. Opin. Immunol., 2007; 19: 510-515
[PubMed]  

[94] Sommers C.L., Samelson L.E., Love P.E.: LAT: a T lymphocyte adapter protein that couples the antigen receptor to downstream signaling pathways. Bioessays, 2004; 26: 61-67
[PubMed]  

[95] Sprent J., Kishimoto H.: The thymus and negative selection. Immunol. Rev., 2002; 185: 126-135
[PubMed]  

[96] Starr T.K., Jameson S.C., Hogquist K.A.: Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol., 2003; 21: 139-176
[PubMed]  

[97] Stone J.C.: Regulation of Ras in lymphocytes: get a GRP. Biochem. Soc. Trans., 2006; 34: 858-861
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[98] Strasser A., Puthalakath H., O’Reilly L.A., Bouillet P.: What do we know about the mechanisms of elimination of autoreactive T and B cells and what challenges remain. Immunol Cell Biol., 2008; 86: 57-66
[PubMed]  

[99] Swat W., Ignatowicz L., von Boehmer H., Kisielow P.: Clonal deletion of immature CD4⁺8⁺ thymocytes in suspension culture by extrathymic antigen-presenting cells. Nature, 1991; 351: 150-153
[PubMed]  

[100] Swat W., von Boehmer H., Kisielow P.: Small CD4⁺8⁺TCR^low thymocytes contain precursors of mature T cells. Eur. J. Immunol., 1994; 24: 1010-1012
[PubMed]  

[101] Taghon T., Rothenberg E.V.: Molecular mechanisms that control mouse and human TCR-αβ and TCR-γδ T cell development. Semin. Immunopathol., 2008; 30: 383-398
[PubMed]  

[102] Tanigaki K., Honjo T.: Regulation of lymphocyte development by Notch signaling. Nat. Immunol., 2007; 8: 451-456
[PubMed]  

[103] Tanigaki K., Tsuji M., Yamamoto N., Han H., Tsukada J., Inoue H., Kubo M., Honjo T.: Regulation of αβ/γδ T cell lineage commitment and peripheral T cell responses by Notch/RBP-J signaling. Immunity, 2004; 20: 611-622
[PubMed]  

[104] Teh H.S., Kisielow P., Scott B., Kishi H., Uematsu Y., Blüthmann H., von Boehmer H.: Thymic major histocompatibility complex antigens and the αβ T-cell receptor determine the CD4/CD8 phenotype of T cells. Nature, 1988; 335: 229-233
[PubMed]  

[105] Turner M., Billadeau D.D.: VAV proteins as signal integrators for multi-subunit immune-recognition receptors. Nat. Rev. Immunol., 2002; 2: 476-486
[PubMed]  

[106] Villunger A., Marsden V.S., Zhan Y., Erlacher M., Lew A.M., Bouillet P., Berzins S., Godfrey D.I., Heath W.R., Strasser A.: Negative selection of semimature CD4⁺8^– HSA⁺ thymocytes requires the BH3-only protein Bim but is independent of death receptor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004; 101: 7052-7057
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[107] von Boehmer H.: Coming to grips with Notch. J. Exp. Med., 2001; 194: F43-F46
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[108] von Boehmer H.: Selection of the T-cell repertoire: receptor-controlled checkpoints in T-cell development. Adv. Immunol., 2004; 84: 201-238
[PubMed]  

[109] von Boehmer H.: Unique features of the pre-T-cell receptor α-chain: not just a surrogate. Nat. Rev. Immunol., 2005; 5: 571-577
[PubMed]  

[110] von Boehmer H., Aifantis I., Feinberg J., Lechner O., Saint-Ruf C., Walter U., Buer J., Azogui O.: Pleiotropic changes controlled by the pre-T-cell receptor. Curr. Opin. Immunol., 1999; 11: 135-142
[PubMed]  

[111] von Boehmer H., Kisielow P.: Negative selection of the T-cell repertoire: where and when does it occur? Immunol Rev., 2006; 209: 284-289
[PubMed]  

[112] von Boehmer H., Kisielow P.: Self-nonself discrimination by T cells. Science, 1990; 248: 1369-1373
[PubMed]  

[113] von Boehmer H., Teh H.S., Kisielow P.: The thymus selects the useful, neglects the useless and destroys the harmful. Immunol. Today, 1989; 10: 57-61
[PubMed]  

[114] Vyas J.M., Van der Veen A.G., Ploegh H.L.: The known unknowns of antigen processing and presentation. Nat. Rev. Immunol., 2008; 8: 607-618
[PubMed]  

[115] Wada H., Masuda K., Satoh R., Kakugawa K., Ikawa T., Katsura Y., Kawamoto H.: Adult T-cell progenitors retain myeloid potential. Nature, 2008; 452: 768-772
[PubMed]  

[116] Weih F., Ryseck R.P., Chen L., Bravo R.: Apoptosis of nur77/N10-transgenic thymocytes involves the Fas/Fas ligand pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 93: 5533-5538
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[117] Winoto A., Littman D.R.: Nuclear hormone receptors in T lymphocytes. Cell, 2002; 109 Suppl: S57-S66
[PubMed]  

[118] Woronicz J.D., Calnan B., Ngo V., Winoto A.: Requirement for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis of T-cell hybridomas. Nature, 1994; 367: 277-281
[PubMed]  

[119] Xi H., Schwartz R., Engel I., Murre C., Kersh G.J.: Interplay between RORγt, Egr3, and E proteins controls proliferation in response to pre-TCR signals. Immunity, 2006; 24: 813-826
[PubMed]  

[120] Yamasaki S., Ishikawa E., Sakuma M., Ogata K., Sakata-Sogawa K., Hiroshima M., Wiest D.L., Tokunaga M., Saito T.: Mechanistic basis of pre-T cell receptor-mediated autonomous signaling critical for thymocyte development. Nat. Immunol., 2006; 7: 67-75
[PubMed]  

[121] Yamasaki S., Saito T.: Molecular basis for pre-TCR-mediated autonomous signaling. Trends Immunol., 2007; 28: 39-43
[PubMed]  

[122] Youle R.J., Strasser A.: The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2008; 9: 47-59
[PubMed]  

[123] Zhang L., Insel P.A.: The pro-apoptotic protein Bim is a convergence point for cAMP/protein kinase A- and glucocorticoid-promoted apoptosis of lymphoid cells. J. Biol. Chem., 2004; 279: 20858-20865
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[124] Zhou T., Cheng J., Yang P., Wang Z., Liu C., Su X., Bluethmann H., Mountz J.D.: Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med., 1996; 183: 1879-1892
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

Autor deklaruje brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu