Abstrakt

Wspólny enterobakteryjny antygen (Enterobacterial Common Antigen, ECA) jest powierzchniowymantygenem cukrowym obecnym u niemal wszystkich Gram-ujemnych bakterii z rodzinyEnterobacteriaceae. Pochodzenie ECA wydaje się związane z lipopolisacharydem (LPS, endotoksyna),na co wskazują wspólne szlaki biosyntezy obu antygenów. ECA występuje w trzech postaciach: liniowego polimeru związanego kowalencyjnie z fosfatydyloglicerolem (ECAPG), zakotwiczonym w błonie zewnętrznej ściany komórkowej, postaci cyklicznej (ECACYC) zbudowanej z 4-6 podjednostek, umiejscowionej w peryplazmie oraz z liniowego polimeru połączonego kowalencyjnie z oligocukrem rdzenia LPS (ECALPS). Niezależnie od postaci poli- i oligosacharydy ECA są zbudowane z powtarzających się biologicznych trójcukrowych podjednostek: →3)-α-d-Fucp4NAc-(1→4)-β-d-ManpNAcA-(1→4)-α-d-GlcpNAc-(1→, gdzie Fucp4NAc oznacza 4-acetamido- 2,4-dideoksygalaktozę, ManpNAcA – kwas N-acetylomannozaminouronowy, GlcpNAc – N-acetyloglukozaminę. W przypadku ECAPG i ECALPS identyfikowano cząsteczki zawierające jedną podjednostkę, a ich analiza strukturalna wskazała na Fucp4NAc jako cukier terminalny. Szczegółowe badania wykazały jego obecność u niemal wszystkich gatunków enterobakterii, z wyjątkiem pojedynczych przypadków, takich jak Erwinia chrysantemii. Obecność antygenu ECA wykazano również u rodzaju Plesiomonas należącego wówczas do rodziny Vibrionaceae [4] oraz rodzaju Yersinia [36] należącego do Pasteurellae, co było jednym z powodów zmiany taksonomii i zaliczenia ich do rodziny Enterobacteriaceae. Funkcja ECA nie jest dokłądnie poznana, jednak dotychczasowe badania wskazują m.in. na jego znaczenie w oporności komórki bakteryjnej na warunki środowiskowe, takie jak sole kwasów żółciowych w przewodzie pokarmowym człowieka. Ważna wydaje się immunogenność tego antygenu, ponieważ zdolność do wytwarzania swoistych przeciwciał dotyczy tylko nielicznych, szorstkich szczepów Gram-ujemnych bakterii, takich jak Shigella sonnei fazy II, Escherichia coli R1, R2, R4 i K-12, czy Yersinia enterocolitica O:3 i jest najprawdopodobniej skutkiem obecności ECALPS. Dowodu na istnienie tego połączenia dostarczyły analizy strukturalne antygenów powierzchniowych S. sonnei fazy II.

Odkrycie antygenu E

Wspólny enterobakteryjny antygen (ECA) został odkryty w latach 60 XX w. przez Calvina M. Kunina podczas badań nad zakażeniami układu moczowego wywoływanymi przez pałeczki Escherichia coli [28]. Kunin i wsp. opisali wówczas reakcje krzyżowe, obserwowane w teście biernej hemaglutynacji, między poliklonalną surowicą króliczą skierowaną przeciwko szorstkim bakteriom E. coli O14 a ludzkimi erytrocytami opłaszczonymi nieoczyszczonymi preparatami lipopolisacharydów (LPS, endotoksyna) wyizolowanymi od 126 szczepów E. coli różniących się serotypem O, czyli strukturą LPS. Preparatami LPS były frakcje PBS znad osadu termicznie inaktywowanych bakterii. Reakcje te zanikały po inkubacji surowicy anty-E. coli O14 z preparatami LPS uzyskanym z dowolnego szczepu E. coli. Podobne, choć słabsze reakcje krzyżowe obserwowano także dla surowic anty-E. coli O56 i O144. W do- świadczeniu Kunin, oprócz wykazania obecności wspólnego antygenu dla Enterobacteriaceae, wykazał również, że antygen ten musi występować w dwóch postaciach: immunogennej – stymulującej wytwarzanie swoistych przeciwciał w wyniku immunizacji zabitymi komórkami bakteryjnymi oraz nieimmunogennej – haptenu zdolnego jedynie do adsorpcji przeciwciał z surowic skierowanych przeciw szczepowi ECA-immunogennemu. Przez wiele lat przyjęło się określać nowo odkryty antygen mianem „antygenu Kunina”. Erytrocyty opłaszczone surowymi preparatami LPS reagowały silniej z surowicą przeciwko ECA od opłaszczonych oczyszczonymi preparatami. Sugerowało to, że ECA może być raczej zanieczyszczeniem niż integralnym składnikiem LPS, głównego antygenu powierzchniowego i  czynnika wirulencji Gram-ujemnych bakterii. LPS jest amfifilową cząsteczką zbudowaną z trzech głównych regionów: polisacharydu O-swoistego składającego się z powtarzających się cukrowych podjednostek, oligosacharydu rdzenia zbudowanego z kilku do kilkunastu reszt cukrowych oraz lipidu A kotwiczącego całą cząsteczkę w błonie zewnętrznej ściany komórkowej (ryc. 1). W odniesieniu do Gram-ujemnych bakterii, gładkie szczepy (smooth, S) syntezują LPS zawierający wszystkie wymienione regiony, natomiast szczepy szorstkie (rough, R) syntezują lipooligosacharydy (LOS) zbudowane jedynie z lipidu A podstawionego kompletnym lub niekompletnym oligocukrem rdzenia [35,49]. Badania nad immunogennością niektórych gatunków bakterii wykazały istnienie szczepów ECA-immunogennych również wśród innych gatunków enterobakterii, m.in. Shigella sonnei [53] i Yersinia enterocolitica. ECA-immunogenne okazały się jedynie szczepy szorstkie, tzn. pozbawione antygenu O-swoistego i zawierające kompletny oligocukier rdzenia, takie jak E. coli R1, R4 i K-12 [26] oraz E. coli R2 i R3 [8], szorstkie mutanty Y. enterocolitica O:3 (oligocukier rdzenia typu Ra) [48] czy S. sonnei fazy II [53], która w odróżnieniu od S. sonnei fazy I syntezuje LOS pozbawiony polisacharydu O-swoistego [13]. Obserwacje potwierdziło odkrycie, że z pozoru gładki szczep E. coli O14 jest w rzeczywistości szczepem typu szorstkiego syntezującym LOS zawierający oligosacharyd rdzenia typu R4, a właściwość ta jest maskowana przez antygen kapsularny K. Inkubując bakterie z przeciwciałami anty-ECA skoniugowanymi z ferrytyną i stosując mikroskopię elektronową, Rinno i wsp. potwierdzili lokalizację antygenu ECA w błonie zewnętrznej komórki bakteryjnej (ryc. 1), a także wykazali, że obecność innych antygenów powierzchniowych, takich jak polisacharyd O-swoisty czy antygen kapsularny K, ogranicza dostępność przeciwciał skierowanych przeciwko ECA [52].

Badania strukturalne E

Badania strukturalne ECA i próby jego izolacji znacznie utrudniała jego zdolność do niekowalencyjnego wiązania do różnych składników komórkowych i biopolimerów, które trudno było usunąć z preparatu. Dopiero zastosowanie metody ekstrakcji masy bakteryjnej 85% etanolem przez Ługowskiego i wsp. umożliwiło uzyskanie ze szczepów S. sonnei fazy I oraz fazy II stosunkowo czyste preparaty ECA, umożliwiające wykonanie jednych z pierwszych analiz składu próbki [32]. Männel i Mayer zastosowali ekstrakcję fenolowo-wodną, w celu otrzymania surowego preparatu LPS Salmonella enterica serowar Montevideo, a następnie, w celu izolacji ECA, ekstrakcję z użyciem mieszaniny fenol/chloroform/eter naftowy (ekstrakcja PCP) [37]. Obie metody izolacji pozwoliły na otrzymanie preparatów o podobnym stopniu czystości oraz porównywalnym składzie chemicznym. Männel i Mayer jako pierwsi wykonali analizę metylacyjną (GC-MS) otrzymanego preparatu i przedstawili strukturę antygenu ECA jako liniowego polimeru dwucukrowych podjednostek →4)-α-d-GlcpNAc-(1→4)-β-d-ManpNAcA-1(→, zawierających N-acetyloglukozaminę oraz kwas N-acetylo- -mannozaminouronowy. Oprócz składników cukrowych w preparacie wykryto również śladowe ilości kwasów tłuszczowych oraz grupy O-acetylowe. Był to niewątpliwy przełom w badaniach nad strukturą ECA i wydawać się mogło, że struktura jest już dokładnie poznana. Jednak zastosowanie spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) przez Ługowskiego i wsp. umożliwiło odkrycie nieznanego dodatkowego składnika cukrowego podjednostki ECA [34]. Widmo 1 H NMR uzyskane dla preparatu ECA otrzymanego z S. sonnei fazy I, oprócz sygnałów charakterystycznych dla cukrów opisanych przez Männela i Mayera, zawierało dodatkowy, charakterystyczny sygnał pochodzący od protonów grupy metylowej o intensywności 1:3 w stosunku do sygnałów dla protonów grup N-acetylowych. Zastosowanie przez Ługowskiego i wsp. zmodyfikowanej metody analizy metylacyjnej potwierdziło obecność dodatkowego składnika cukrowego – 3-podstawionej 4-acetamido-4,6-dideoksygalaktozy, →3)-Fucp4NAc. Przyczynami, dla których cukier ten nie został zidentyfikowany przez Männela i Mayera [37], był jego rozpad w czasie zastosowanej przez nich metody analizy metylacyjnej. W wyniku kwaśnej hydrolizy cukier ulega deacetylacji, a następnie degradacji do pochodnych pirolowych. Modyfikacja analizy metylacyjnej zastosowana przez Ługowskiego i wsp. polegała na wykorzystaniu do uwolnienia permetylowanych reszt cukrowych metanolizy lub solwolizy ciekłym, bezwodnym fluorowodorem. W takich warunkach labilne cukry nie ulegają degradacji, co umożliwia ich dalszą analizę. W 1983 r. Ługowski i wsp. zaproponowali prawidłową i obowiązującą obecnie strukturę powtarzającej się podjednostki antygenu ECA: →4)-β-d-ManpNAcA-(1→4)-α-d-GlcpNAc-(1→3)-α- d-Fucp4NAc-(1→. Wskazali również pozycję C-6 GlcpNAc, jako miejsce niestechiometrycznego podstawienia grupą O-acetylową [34].

Do dalszych badań nad strukturą ECA motywowało to, że niepowodzeniem kończyły się wszelkie próby wskazania biologicznej podjednostki, a więc określenia, który cukier znajduje się na końcu nieredukującym polisacharydu. Wyniki analizy metylacyjnej wskazywały na podstawienie wszystkich reszt cukrowych. Wyjaśnieniem uzyskanych wyników i niejako ukoronowaniem badań strukturalnych ECA, była praca Dell i wsp., w której autorzy opisali cykliczną postać antygenu ECA – ECACYC [7]. Zastosowali technikę spektrometrii mas z jonizacją szybkimi atomami FAB (fast atom bombardment) do badania preparatu ECA wyizolowanego z S. sonnei fazy I. Znając dokładną strukturę antygenu, spodziewali się zaobserwować jony odpowiadające polimerom zbudowanym z trójcukrowych podjednostek podstawionych różną liczbą grup O-acetylowych. Jednak wyniki, jakie otrzymali nie zgadzały się z masą wyliczoną teoretycznie, a różnica wynosiła 18 jednostek masy, co odpowiadało masie cząsteczki wody. Natomiast widmo masowe preparatu ECA poddanego hydrolizie 6 M kwasem solnym zawierało sygnały wskazujące na masę zgodną z masą teoretyczną dla liniowego łańcucha. Powyższe obserwacje nasunęły wniosek, że zaobserwowana różnica w masie cząsteczkowej wynika z cyklizacji łańcucha ECA. Hydroliza kwasem solnym powoduje przerwanie wiązania między resztami cukrowymi i powstanie postaci liniowej. Był to pierwszy udowodniony przypadek istnienia naturalnego cyklicznego heteropolisacharydu. Po latach, Farnback i wsp. uzyskali strukturę krystaliczną dla cyklicznej postaci antygenu ECA otrzymanego z Proteus penneri, co było ostatecznym dowodem na istnienie tej nietypowej cząsteczki [11].

Odkrycie postaci cyklicznej nie wykluczało istnienia liniowej postaci ECA. Peters i wsp. otrzymali przeciwciała monoklonalne immunizując myszy zabitymi bakteriami ECA-immunogennego szczepu E. coli O14. Uzyskane przeciwciała reagowały w immunoblotingu z oczyszczonym preparatem ECA, jak również z supernatantem znad termicznie inaktywowanych bakterii, dając charakterystyczne reakcje o wzorze drabinkowym, podobne do reakcji otrzymywanych dla LPS. Obserwacje te wskazywały na obecność liniowych polimerów ECA o różnej liczbie powtarzających się podjednostek [43]. Wykorzystując to samo przeciwciało, podobne wyniki otrzymali również Kuhn i wsp. [25] oraz Böttger i wsp. [4].

Zawartość kwasów tłuszczowych w otrzymywanych preparatach ECA wskazywała na obecność lipidu kotwiczącego polisacharydowy łańcuch w błonie zewnętrznej ściany komórkowej. Kuhn i wsp. analizowali region lipidowy antygenu ECA podczas badań nad tzw. czynnikiem „Pseudomonas” – enzymem hamującym opłaszczanie erytrocytów przez ECA [27,55], co uniemożliwiało reakcję hemaglutynacji ze swoistą surowicą anty-ECA. Preparat ECA poddawano działaniu fluorowodoru lub czynnika „Pseudomonas”, a następnie uwolnione lipidy badano wykorzystując GC-MS. Uzyskane wyniki wskazywały na różne miejsca hydrolizy ECA przez obydwa czynniki oraz co istotne, wskazywały na połączenie łańcucha ECA z fosfatydyloglicerolem (ECAPG). Ponadto według autorów, pierwszą resztą przyłączoną do PG wiązaniem fosfodiestrowym była GlcpNAc. W oparciu o uzyskane wyniki ustalono strukturę biologicznej podjednostki ECAPG: →3)-α-d-Fucp4NAc- (1→4)-β-d-ManpNAcA-1→4)-α-d-GlcpNAc-(1→. Obserwacja została potwierdzona w późniejszych badaniach nad produktami pośrednimi biosyntezy ECA, prowadzonymi przez Ricka i wsp. z zastosowaniem spektrometrii mas [51].

Immunogenność ECA i identyfikacja ECALPS

Zdolność komórek bakteryjnych do pobudzania układu immunologicznego w kierunku wytwarzania poliklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko ECA jest zależ- na od poziomu ekspresji zarówno ECA, jak i LPS. Immunogenne okazywały się prawie wyłącznie szczepy szorstkie, takich bakterii jak: S. sonnei, E. coli i S. enterica lub mutanty gładkich szczepów, u których zablokowano biosyntezę polisacharydu O-swoistego. Preparaty LPS izolowane od szczepów ECA-nieimmunogennych pozbawiono zanieczyszczeń w postaci antygenu ECA przez ekstrakcję 85% etanolem [54]. Tak uzyskane preparaty LPS nie reagowały z surowicą anty-ECA. Natomiast u szczepów ECA-immunogennych, nawet wielokrotne próby ekstrakcji preparatów LPS roztworem etanolu nie pozwalały na usunię- cie antygenu ECA. W tym wypadku nieskuteczne okazało się również zastosowanie ekstrakcji PCP umożliwiającej oczyszczanie preparatów LPS szczepów nieimmunogennych od antygenu ECA. Obserwacje te wskazywały, że antygen ECA w postaci immunogennej jest związany kowalencyjnie z LPS (ECALPS), natomiast w dominują- cej postaci nieimmunogennej występuje jako ECAPG. Od chwili odkrycia ECA przez Kunina wiadomo było, że nie wszystkie szczepy bakterii z rodziny Enterobacteriaceae są szczepami ECA-immunogennymi. Kiss i wsp. wyizolowali LOS z ECA-immunogennego, szorstkiego mutanta E. coli O8− :K27− (F470) pozbawionego antygenów O i K oraz LPS z kontrolnego, gładkiego szczepu E. coli O8:K27− , syntezującego polisacharyd O-swoisty [23]. Bakterie hodo wano w pożywce wzbogaconej w [14C]d-GlcpNAc, w celu wyznakowania składników podjednostki ECA, takich jak d-GlcpNAc i d-ManpNAcA. Następnie otrzymane preparaty oczyszczano od wolnego ECA metodą ekstrakcji PCP. Tak otrzymany LPS poddano łagodnej kwaśnej hydrolizie w celu usunięcia lipidu A, a otrzymaną mieszaninę polii oligosacharydów rozdzielano na kolumnie wypełnionej złożem DEAE-celuloza. Obecność znakowanej [14C] d-GlcpNAc w zbieranych frakcjach badano przez pomiar radioaktywności. Obecność [14C]d-GlcpNAc stwierdzono u frakcji oligocukrów rdzeni pochodzących od ECA-immunogennego szczepu F470. Wykazano także, że tylko niewielka część oligocukrów rdzeniowych podstawiona jest znakowaną [14C]d-GlcpNAc i tym samym antygenem ECA. Prawdopodobnie ze względu na niewystarczającą ilość materiału i  stosunkowo małą czułość aparatury w tamtych czasach, nie przeprowadzono analizy strukturalnej wyizolowanej frakcji. Sama identyfikacja znakowanego cukru była niewystarczająca, aby potwierdzić jednoznacznie obecność kowalencyjnego wiązania między ECA a oligosacharydem rdzenia LPS, wskazywała jedynie na wspólną elucję tych składników z kolumny. Niemniej jednak było to jedno z pierwszych doniesień o połączeniu antygenu ECA z oligocukrem rdzenia LPS.

Ługowski, pisząc o badaniach nad antygenem ECA [30], opisuje wstępne wyniki analizy strukturalnej frakcji oligosacharydów rdzenia ECA-immunogennego szczepu S. sonnej fazy II. Rozdzielając, z użyciem chromatografii żelowej, mieszaninę oligosacharydów otrzymanych po delipidacji LPS, uzyskał wiele frakcji, które następnie badał metodą immunoelektroforezy rakietowej z surowicą anty-ECA. Zaobserwował silne reakcje dla frakcji o masie nieznacznie większej od masy oligosacharydów rdzenia (migrujących szybciej przez kolumnę), świadczące o obecności epitopów ECA. Widmo 1 H NMR uzyskane dla tej frakcji, poza charakterystycznymi sygnałami dla atomów wodoru przyłączonych do anomerycznych atomów węgla pochodzących od oligocukru rdzenia, zawierało również sygnały pochodzące od dodatkowych składników. Wyraź- nie były widoczne również sygnały protonów grup acetylowych oraz grupy metylowej, które nie mogły pochodzić od oligosacharydu rdzenia. Ograniczenia sprzętowe oraz niewystarczająca ilość materiału uniemożliwiały w tamtych czasach dokładną analizę zidentyfikowanej frakcji.

Badania prowadzone nad obecnością przeciwciał skierowanych przeciwko ECA w surowicach zwierzęcych po immunizacji komórkami bakteryjnymi, wykazały obecność antygenu ECALPS w szorstkich szczepach Proteus mirabilis oraz Y. enterocolitica. W przypadku szczepu P. mirabilis, podobnie jak u E. coli R1, R4, K-12 [26], R2 i R3 [8], badacze stwierdzili, że do podstawienia cząsteczki LPS antygenem ECA jest wymagana obecność kompletnego oligocukru rdzenia [8]. W przypadku Y. enterocolitica, oprócz szczepów szorstkich, mających kompletny oligocukier rdzenia, zawierający region rdzenia zewnętrznego i wewnętrznego (chemotyp Ra), ECA-immunogenne okazały się również szorstkie mutanty mające tylko region rdzenia wewnętrznego (chemotyp Rc) [46,47,48]. Pośrednie dane wskazują, że w cząsteczce LPS gładkiego szczepu Y. enterocolitica O:3 zarówno polisacharyd O-swoisty, jak i antygen ECA mogą występować jednocześnie [40]. Przytoczone wnioski oparto na wynikach immunoblotingu preparatu LPS pozbawionego zanieczyszczenia postacią ECAPG. Oczyszczony preparat dawał reakcje o charakterystycznym wzorze drabinkowym (seria prążków reprezentujących cząsteczki o różnej liczbie powtarzających się trójcukrowych podjednostek ECA) zarówno z przeciwciałami monoklonalnymi swoistymi dla ECA, jak i dla polisacharydu O-swoistego. Co więcej, reakcje z przeciwciałami anty-ECA były widoczne dla preparatu LPS otrzymanego z bakterii hodowanych w temperaturze 22° C, natomiast nie obserwowano ich dla preparatu LPS otrzymanego z bakterii hodowanych w 37° C. Oznacza to, że synteza antygenu ECA u Y. enterocolitica jest zależna od temperatury. W dalszych badaniach Noszczyńska i wsp. zaobserwowali również wytwarzanie przeciwciał anty-ECA przez króliki immunizowane tzw. głęboko szorstkimi mutantami Y. enterocolitica O:3 zawierającymi LOS zbudowany z lipidu A podstawionego dwoma resztami kwasu 3-deoksy-D-manno-oktulozonowego (Kdo) (chemotyp Re) lub dwoma resztami Kdo podstawionymi jedną (chemotyp Rd2 ) lub dwoma cząsteczkami heptozy (chemotyp Rd1 ) [41]. Wyizolowano preparaty LPS, które poddano ekstrakcji PCP w celu usunięcia ECAPG. Immunobloting rozdzielonych preparatów LPS z poliklonalnymi surowicami skierowanymi przeciwko szorstkim szczepom Y. enterocolitica O:3 wykazał obecność antygenu ECA w oczyszczonych preparatach LPS. Wyniki te sugerują, że w przypadku Y. enterocolitica O:3 antygen ECA może być przyłączony do regionu Kdo wewnętrznego rdzenia LPS.

Istotne, pod względem bezpośrednich dowodów na kowalencyjne połączenie antygenu ECA z cząsteczką LPS, okazały się niedawne badania Goździewicza i wsp. [15]. Badacze skupili uwagę na ECA-immunogennym, szorstkim szczepie S. sonnei fazy II. Stosując standardową procedurę ekstrakcji fenolowo-wodnej, uzyskali preparat lipooligosacharydu (LOS), który poddali łagodnej hydrolizie w celu usunięcia lipidu A. Frakcję uzyskanych w ten sposób oligosacharydów rozdzielali z użyciem chromatografii żelowej. Zebrane frakcje analizowali za pomocą spektrometrii mas oraz spektroskopii NMR. Oprócz dominują- cej frakcji zawierającej oligosacharydy rdzenia, różniące się stechiometrią podstawień grupami fosforanowymi czy etanolaminą, uzyskali wiele frakcji o wyższych masach cząsteczkowych. Trudność opisywanych analiz polegała na współistnieniu w otrzymanym preparacie fragmentów wszystkich postaci ECA – ECACYC, ECAPG i ECALPS. W najszybciej migrujących frakcjach zidentyfikowano liniowe fragmenty polisacharydu ECA, które ich zdaniem mogą pochodzić z ECAPG. Zidentyfikowano również frakcje zawierające ECA w postaci cyklicznej. Najciekawsze, z punktu widzenia dowodów na istnienie ECALPS, okazały się frakcje migrujące tuż przed frakcją zawierającą niepodstawiony oligosacharyd rdzenia. Bowiem zawarte w tych frakcjach cząsteczki reagują w teście dot-blotingu zarówno z surowicą skierowaną przeciwko koniugatowi antygenu ECA z toksoidem tężcowym, jak i z surowicą skierowaną przeciwko koniugatowi oligosacharydu rdzenia. Analiza widm masowych wykazała obecność frakcji zawierających oligosacharyd rdzenia S. sonnei fazy II połączony kowalencyjnie z jedną, dwoma, trzema oraz czterema podjednostkami antygenu ECA. Ostatecznych dowodów na istnienie kowalencyjnego połączenia mię- dzy antygenem ECA a oligosacharydem rdzenia dostarczyła analiza serii dwuwymiarowych widm 1 H, 13C NMR otrzymanych dla frakcji zawierającej cząsteczki oligocukru rdzenia podstawione jedną podjednostką ECA. Dane przedstawione przez Goździewicza i wsp. jednoznacznie wskazują na połączenie antygenu ECA z oligosacharydem rdzenia S. sonnei fazy II kowalencyjnym wiązaniem α-(1→3) glikozydowym między α-d-GlcpNAc antygenu ECA a terminalną (w niepodstawionym oligosacharydzie) β-d-Glcp oligosacharydu rdzenia. Wyniki uzyskane przez nich potwierdzają wcześniej uzyskane dane dla ECAPG wskazujące na biologiczną podjednostkę ECA, w której resztą cukrową podstawiającą oligosacharyd rdzenia jest α-d-GlcpNAc.

Współistnienie ECACYC i LPS we frakcji wodnej otrzymanej podczas izolacji LPS metodą fenolowo-wodną zauwa- żyli wcześniej Fregolino i wsp., co opisali na przykładzie szczepu E. coli O157 [12]. Wyizolowali ECACYC oczyszczając chromatograficznie supernatant powstały podczas ultrawirowania surowego preparatu LPS, co jest znaną metodą oczyszczania LPS od pozostałości kwasów nukleinowych i białek. Uzyskali frakcje zawierające cykliczne ECA zło- żone z 4 i 5 podjednostek. Dane te wskazują na potrzebę uwzględniania tego antygenu w preparatach LPS.

Ważny aspekt występowania antygenu ECA poruszyli Erbel i wsp. [10], którzy zwrócili uwagę na możliwość zanieczyszczenia przez ECA preparatów białek ekspresjonowanych w systemach bakteryjnych wykorzystujących szczepy E. coli. Badacze identyfikowali charakterystyczne sygnały grup N-acetylowych pochodzących od składników antygenu ECA w różnych preparatach ekspresjonowanych białek. Stwierdzili, że ECA w  postaci cyklicznej stanowi częste zanieczyszczenie preparatów ekspresjonowanych białek, zwłaszcza przy długo prowadzonej ekspresji. Ma to szczególne znaczenie podczas badań immunologicznych, w których pewne aktywności ekspresjonowanego białka (np. immunogenność) mogą być fałszywie oznaczone właśnie przez wpływ zanieczyszczenia antygenem ECA.

Biosynteza E

Biosynteza antygenu ECA jest ściśle powiązana z biosyntezą LPS, a dokładnie z jednym ze szlaków biosyntezy polisacharydów O-swoistych – drogi zależnej od Wzx/ Wzy [18,21,22,56]. Podstawowymi substratami biosyntezy antygenu ECA, bez względu na jego postać, są poszczególne reszty cukrowe związane z wysokoenergetycznymi fosforanami nukleozydów: GlcpNAc oraz ManpNAcA z difosforanem urydyny (UDP), a Fucp4NAc z difosforanem tymidyny (TDP). Pochodna kwasu ManNAcA powstaje z GlcNAc-UDP z udziałem enzymów kodowanych przez geny wecB (UDP-GlcNAc → UDP-ManNAc) oraz wecC (UDP- -ManNAc → UDP-ManNAcA). Natomiast pochodna fukozy powstaje z glukozy, gdzie produktami pośrednimi są keto-6-deoksyglukoza oraz 4-aminofukoza, w wyniku działania enzymów kodowanych przez geny rlmB, wecE oraz wecD. Biosynteza ECA rozpoczyna się od przeniesienia GlcNAc z UDP na undekaprenylofosforan (Und-P) – lipidowy nośnik kolejnych substratów szlaku biosyntezy ECA. Powstały Und-PP-GlcNAc to tzw. lipid I [51], a za reakcję tę odpowiada glikozylotransferaza kodowana przez gen wecA. Und-P i lipid I to związki powstające podczas biosyntezy zarówno ECA, jak i LPS. Następny etap polega na przyłączeniu kolejnych reszt cukrowych z utworzeniem odpowiednio lipidu II (Und-PP-GlcNAc-ManNAcA, transferaza wecG) oraz lipidu III (Und-PP-GlcNAc-ManNAcA-Fuc4NAc, transferaza wecF). Powstały lipid III zawiera kompletną, trójcukrową podjednostkę ECA. Dalszy etap nie został jednoznacznie potwierdzony, jednak badacze sugerują, że zachodzi z udziałem enzymów homologicznych do tych biorących udział w biosyntezie LPS lub wspólnych dla obu szlaków. Tak zwana flipaza (gen wzxE) przenosi lipid III na stronę peryplazmatyczną błony, gdzie następnie polimeraza WzyE przyłącza kolejne trójcukrowe podjednostki tworząc polimer ECA. Kolejny enzym, kodowany przez gen wzzE, odpowiada za regulację długości łańcucha ECA. Etap przeniesienia powstałego polisacharydu ECA na fostadydyloglicerol (ECAPG) oraz jego transport do błony zewnętrznej pozostaje jak dotąd nieznany. Erbel i wsp. opisując szlak biosyntezy ECACYC u E. coli sugerują, że począwszy od lipidu III, dalsza biosynteza każdej z trzech znanych postaci ECA przebiega niezależnie [9]. Według nich cyklizacja łańcucha ECA miałaby być niezależna od polimerazy WzyE i zachodzić po wewnętrznej stronie błony cytoplazmatycznej, za czym przemawiają doniesienia, jakoby ECACYC miało być składnikiem cytoplazmy [1].

Podobieństwo biosyntezy ECA oraz LPS wynika z udziału tego samego mechanizmu wydłużania łańcucha polisacharydowego z udziałem polimerazy WzyE (w przypadku mechanizmu zależnego od polimerazy) oraz takich samych nośników intermediatów – Und-PP [49]. Synteza łańcuchów O-swoistych rozpoczyna się od tego samego prekursora, jak w przypadku antygenu ECA, czyli Und- -PP-Glc, który może ulec przekształceniu, np. do Und -PP-GlcNAc. Zatem reszty Glc lub GlcNAc są poniekąd inicjatorami biosyntezy polisacharydów O-swoistych, co powoduje, że w większości znanych przypadków znajdują się na ich końcu nieredukującym. W przypadku biosyntezy LPS, gotowy polisacharyd O-swoisty, powstały z udzia- łem polimerazy WzyE, jest przenoszony na oligosacharyd rdzenia połączony z lipidem A przez ligazę WaaL [16]. Wydaje się zatem prawdopodobne, że w niektórych przypadkach substratem dla ligazy WaaL mógłby być Und- -PP-ECA, co spowodowałoby przyłączenie tego antygenu do oligosacharydu rdzenia związanego z lipidem A, czyli utworzeniem ECALPS. Swoistość substratowa WaaL jest jednak znacznie większa wobec pochodnej polisacharydu O-swoistego, bo jak już wspomniano w przypadku LOS S. sonnei fazy II, tylko niewielka część oligosacharydu rdzenia jest podstawiona przez ECA [15]. W szczepach szorstkich, w których mutacje dotyczą wcześniejszych etapów biosyntezy LPS, brak podstawowego substratu dla enzymu WaaL faworyzuje ligację ECA. Przytoczone rozważania mają charakter teoretyczny, ponieważ jak dotąd, poza wspomnianym przypadkiem Y. enterocolitica, nie wykazano obecności ECALPS u gładkich szczepów bakterii.

Jedną z istotnych modyfikacji ECA jest podstawienie antygenu grupami O-acetylowymi. Kajimura i wsp. badali mechanizm O-acetylacji antygenu ECA u szczepu E. coli K12 [19]. Otrzymali mutanta ekspresjonującego zarówno ECAPG, jak i ECACYC pozbawione grup O-acetylowych. Dalsze badania wykazały obecność mutacji w genie yiaH, który jak wykazała analiza bioinformatyczna, koduje błonowe białko z rodziny acetylotransferaz. Nawiązując do nomenklatury genów zaangażowanych w biosyntezę ECA, zaproponowano oznaczenie genu dla O-acetylotransferazy ECA jako wecH. Jako powód takiej modyfikacji ECA, badacze podają wzrost hydrofobowości łańcucha polisacharydowego, co miałoby umożliwić dostosowywanie się bakterii do warunków środowiskowych oraz wspomagać asocjację z komórkami gospodarza lub innymi bakteriami. Znany jest również wpływ O-acetylacji powierzchniowych polisacharydów na wirulencję bakterii [3].

Znaczenie biologiczne E

Mimo iż dokładna funkcja antygenu ECA nie została jak dotąd jednoznacznie stwierdzona, dotychczasowe badania wskazują, że obecność tego antygenu wpływa na wirulencję i oporność bakterii na warunki środowiskowe. Ramos-Morales i wsp. badali wpływ ekspresji antygenu ECA na oporność szczepu S. enterica na działanie soli kwasów żółciowych na przykładzie deoksycholanu (DOC) – kwasu żółciowego naturalnie występującego w dwunastnicy [50]. Uzyskali mutanty pozbawione genów wecD oraz wecA zaangażowanych w biosyntezę ECA, co skutkowało brakiem ekspresji antygenu ECA. Następnie uzyskane mutanty oraz szczep dziki jako kontrolny, hodowano na pożywce Luria-Bertani (LB) lub LB z dodatkiem 1% DOC. Okazało się, że mutacje zaburzające biosyntezę ECA spowodowały znaczne zahamowanie wzrostu bakterii na płytkach z dodatkiem DOC i tylko nieznaczny spadek wzrostu na płytkach bez dodatku DOC. Podobne wyniki badań uzyskano dla mutanta S. enterica (delecja w obrębie genu wecB odpowiedzialnego za biosyntezę ECA) hodowanego na podłożu zawierającym 7,5% żółć wołową [38]. Otrzymane wyniki wskazują, że antygen ECA wzmaga oporność bakterii na bakteriobójcze warunki panujące w przewodzie pokarmowym. Obecność tego antygenu nie jest już tak istotna dla wirulencji bakterii w przypadku zapalenia otrzewnej.

Badania Kaijmury i wsp., prowadzone na izolowanych subkomórkowych frakcjach E. coli K-12 wykazały, że ECACYC jest obecne jedynie w przestrzeni peryplazmatycznej. Autorzy wykazali również, że 80% ECACYC jest uwalniana na zewnątrz komórki pod wpływem wstrząsu osmotycznego. W związku z tym znaczenia tej postaci upatruje się w funkcji osmoregulacji [20]. Mutacje wprowadzone w obrębie genów zaangażowanych w biosyntezę ECA (wecA, wecD, wecG) u Serratia marcescens skutkowały fenotypem charakteryzującym się wzmożonym uwalnianiem pęcherzyków zewnątrzbłonowych (OMVs, outer membrane vesicles). Obecnie proces uwalniania OMV przez bakterie jest postrzegany m.in. jako reakcja komórki bakteryjnej na stres wywoływany przez czynniki środowiskowe, ale także jako nośniki służące do uwalniania poza komórkę antybiotyków lub toksyn [39].

Wykazano, że u S. enterica mutacja genu wecA prowadząca do zablokowania biosyntezy ECA nie wpływała na morfologię komórki, ilość wytwarzanego LPS i ruchliwość bakterii. Brak ECA obniżał natomiast wirulencję, spowodował utratę zdolności do kolonizacji tkanek wątroby i śledziony oraz wydłużył czas przeżywalności w zakażonym organizmie, co zaobserwowano na mysim modelu zakażenia drogą pokarmową [14]. Klein i wsp. przeprowadzili szeroko zakrojone analizy genetyczne biblioteki mutantów Yersinia pestis wykazując negatywny wpływ mutacji w obrębie genów kodujących wecB i wecC na przeżywalność tej bakterii w makrofagach [24]. Podobne badania wykonane dla uropatogennego szczepu E. coli należącego do lekoopornego i charakteryzującego się dużym potencjałem zjadliwości typu sekwencyjnego ST131 doprowadziły do identyfikacji 22 genów odpowiedzialnych za oporność badanego szczepu na bakteriobójcze działanie ludzkiej surowicy, z których 5 związanych było z biosyntezą ECA (wzzE, wecF, wecD, wecA, waaL) [44].

Badania Castelli i wsp. wykazały natomiast wpływ obecności antygenu ECA na syntezę flageliny i w konsekwencji na ruchliwość bakterii S. marcescens [5,6]. Mutanty pozbawione jednego z genów wecD, wzxE lub wzyE nie miały wykształconej wici, co uniemożliwiało lub znacznie upośledzało ruchliwość tej bakterii. Paunova-Krasteva i wsp. badali cykliczną postać ECA z E. coli O157 pod kątem jej rozpoznawania przez układ odpornościowy [42]. Stwierdzili, że ECACYC jest rozpoznawany i wiązany przez ludzką lektynę wiążącą mannan (MBL), składnik układu dopełniacza. Badacze sugerują wręcz, że ECA należy do wzorców molekularnych związanych z patogenami, tzw. PAMP (Pathogen Associated Molecular Pattern). Są to jedyne jak dotąd doniesienia o rozpoznawaniu antygenu ECA przez lektyny układu dopełniacza oparte jedynie na wynikach testu immunoenzymatycznego ELISA oraz testu na fagocytozę przez neutrofile kulek lateksowych opłaszczonych ECACYC.

Potencjalne zastosowania antygenu E

Występowanie wspólnego antygenu na powierzchni wszystkich bakterii z rodziny Enterobacteriaceae było przyczynkiem do postrzegania go jako uniwersalnego antygenu szczepionkowego. Ługowski i wsp. jako pierwsi otrzymali koniugat de-O-acetylowanego antygenu ECACYC, uzyskanego przez ekstrakcję etanolem, z toksoidem tężcowym – silnie immunogennym i powszechnie wykorzystywanym w szczepionkach białkiem nośnikowym [31,33]. W wyniku immunizacji królików glikokoniugatem ECACYC-toksoid tężcowy otrzymali surowicę silnie reagującą z preparatami antygenu ECA. Otrzymana swoista surowica może służyć do identyfikacji samego antygenu, jak i bakterii z rodziny Enterobacteriaceae.

Levasseur i wsp. otrzymali zestaw przeciwciał monoklonalnych przeciwko enterobakteriom [29]. Jedno z nich, oznaczone jako CX9/15, wykazało reaktywność przeciwko żywym bakteriom należącym do rodziny Enterobacteriaceae oraz kilku szczepom spoza tej rodziny. Badacze stwierdzili, że przeciwciało to skierowane jest przeciwko antygenowi ECA i może być wykorzystane w diagnostyce szybkiego oznaczania bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Zastanawiający wydaje się jednak to, że przeciwciało to, testowane za pomocą immunoblotingu, reagowało z ekstraktami bakterii, otrzymanymi przez gotowanie masy bakteryjnej w buforze redukującym z SDS, jedynie w regionie odpowiadającym antygenowi o masie cząsteczkowej wynoszącej około 20 kDa, a obraz immunoblotingu nie przedstawiał charakterystycznego wzoru drabinkowego, jakiego należałoby się spodziewać dla ECA. Inni badacze również otrzymywali monoklonalne przeciwciała reagujące z antygenem ECA. Na przykład Peters i wsp. otrzymali przeciwciało monoklonalne reagujące z ekstraktem bakterii [43], które następnie Hübner i wsp. wykorzystali do opracowania testu immunoenzymatycznego ELISA przeznaczonego do wykrywania bakterii z rodziny Enterobacteriaceae w wodzie pitnej [17]. W opinii autorów zaproponowany test był szybszy, czulszy oraz bardziej swoisty niż stosowane wówczas metody. Natomiast Plomer i wsp. na bazie przeciwciał anty-ECA stworzyli piezoelektryczny immunosensor, który wykrywał bakterie E. coli K12 w zakresie 106 -109 komórek/ml [45].

Antygen ECA wydaje się szczególnie przydatnym w leczeniu uogólnionych infekcji bakteryjnych, a zwłaszcza sepsy, spowodowanej w prawie połowie przypadków przez Gram-ujemne bakterie, wśród których dominują gatunki, takie jak: E. coli, Klebsiella pneumoniae czy P. mirabilis. Antygen ECA występujący powszechnie na powierzchni komórek bakteryjnych wydaje się idealnym celem dla swoistych przeciwciał. Opsonizacja bakterii przez przeciwciała, a następnie uruchomienie kaskady reakcji proteolitycznych z udziałem białek układu dopełniacza skutkujące zabiciem patogenu, jest dobrze znanym procesem humoralnej, wrodzonej odpowiedzi układu odpornościowego. Przeciwciała wiążąc bakterie mogą także aktywować odpowiedź komórkową z udziałem m.in. komórek NK czy makrofagów (ADCC, Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity). Zatem przeciwciała rozpoznające dużą grupę potencjalnie patogennych bakterii, przynajmniej teoretycznie, mogłyby mieć zastosowanie terapeutyczne. Przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi ECA powinny rozpoznawać epitopy ECA na powierzchni komórek bakteryjnych oraz wykazywać właściwości ochronne względem szerokiej grupy bakterii, ze względu na obserwowane reakcje krzyżowe. W szerokich, wieloośrodkowych badaniach klinicznych wykonanych przez Albertsona i wsp. badano wpływ podawania monoklonalnych przeciwciał IgM anty-ECA (MAB-T88) na przeżywalność pacjentów ze zdiagnozowaną sepsą wywołaną przez Gram-ujemne bakterie. Pacjenci cierpiący na sepsę z niewydolnością wielonarządową oraz wstrząsem septycznym otrzymywali jednorazowo, dożylnie 300 mg przeciwciał MAB-T88 w roztworze albuminy lub samą albuminę jako placebo. Wyniki wskazywały na brak znaczącej różnicy mię- dzy grupami otrzymującymi MAB-T88 i placebo. Śmiertelność wynosiła odpowiednio 37 i 34%. Autorzy dość jednoznacznie stwierdzają, że brak jest jakichkolwiek dowodów popierających dalsze uwzględnianie tego przeciwciała w leczeniu sepsy. Należy jednak zwrócić uwagę na rodzaj przeciwciał – IgM, które niekoniecznie mogą wykazywać właściwości bakteriobójcze [2].

Przytoczone przykłady wskazują potrzebę dalszych badań nad antygenem wspólnym dla Enterobacteriaceae, które mogą w przyszłości zaowocować nowymi metodami wykrywania i leczenia chorób wywołanych przez tę powszechną rodzinę Gram-ujemnych bakterii.

Przypisy

• 1. Acker G., Bitter-Suermann D., Meier-Dieter U., Peters H., MayerH.: Immunocytochemical localization of enterobacterial commonantigen in Escherichia coli and Yersinia enterocolitica cells. J. Bacteriol.,1986; 168: 348-356
  Google Scholar
• 2. Albertson T.E., Panacek E.A., MacArthur R.D., Johnson S.B., BenjaminE., Matuschak G.M., Zaloga G., Maki D., Silverstein J., Tobias J.K.,Haenftling K., Black G., Cowens J.W.: Multicenter evaluation of a humanmonoclonal antibody to Enterobacteriaceae common antigen inpatients with Gram-negative sepsis. Crit. Care Med., 2003; 31: 419-427
  Google Scholar
• 3. Allison G.E., Verma N.K.: Serotype-converting bacteriophagesand O-antigen modification in Shigella flexneri. Trends Microbiol.,2000; 8: 17-23
  Google Scholar
• 4. Böttger E.C., Jürs M., Barrett T., Wachsmuth K., Metzger S., Bitter-SuermannD.: Qualitative and quantitative determination of enterobacterialcommon antigen (ECA) with monoclonal antibodies:expression of ECA by two Actinobacillus species. J. Clin. Microbiol.,1987; 25: 377-382
  Google Scholar
• 5. Castelli M.E., Fedrigo G.V., Clementín A.L., Ielmini M.V., FeldmanM.F., García Véscovi E.: Enterobacterial common antigen integrityis a checkpoint for flagellar biogenesis in Serratia marcescens. J. Bacteriol.,2008; 190: 213-220
  Google Scholar
• 6. Castelli M.E., Vescovi E.G.: The Rcs signal transduction pathway istriggered by enterobacterial common antigen structure alterationsin Serratia marcescens. J. Bacteriol., 2011; 193: 63-74
  Google Scholar
• 7. Dell A., Oates J., Lugowski C., Romanowska E., Kenne L., LindbergB.: The enterobacterial common-antigen, a cyclic polysaccharide.Carbohydr. Res., 1984; 133: 95-104
  Google Scholar
• 8. Duda K.A., Duda K.T., Beczala A., Kasperkiewicz K., Radziejewska–Lebrecht J., Skurnik M.: ECA-immunogenicity of Proteus mirabilisstrains. Arch. Immunol. Ther. Exp., 2009; 57: 147-151
  Google Scholar
• 9. Erbel P.J., Barr K., Gao N., Gerwig G.J., Rick P.D., Gardner K.H.:Identification and biosynthesis of cyclic enterobacterial commonantigen in Escherichia coli. J. Bacteriol., 2003; 185: 1995-2004
  Google Scholar
• 10. Erbel P.J., Seidel R., Macintosh S.E., Gentile L.N., Amor J.C., KahnR., Prestegard J.H., McIntosh L.P., Gardner K.H.: Cyclic enterobacterialcommon antigen: potential contaminant of bacterially expressedprotein preparations. J. Biomol. NMR, 2004; 29: 199-204
  Google Scholar
• 11. Färnbäck M., Eriksson L., Senchenkova S., Zych K., Knirel Y.A.,Sidorczyk Z., Widmalm G.: Crystal structure of a cyclic enterobacterialcommon antigen. Angew. Chem., 2003; 42: 2543-2546
  Google Scholar
• 12. Fregolino E., Ivanova R., Lanzetta R., Molinaro A., Parrilli M.,Paunova-Krasteva T., Stoitsova S.R., De Castro C.: Occurrence andstructure of cyclic Enterobacterial Common Antigen in Escherichiacoli O157:H⁻. Carbohydr. Res., 2012; 363: 29-32
  Google Scholar
• 13. Gamian A., Romanowska E.: The core structure of Shigella sonneilipopolysaccharide and the linkage between O-specific polysaccharideand the core region. Eur. J. Biochem., 1982; 129: 105-109
  Google Scholar
• 14. Gilbreath J.J., Colvocoresses Dodds J., Rick P.D., Soloski M.J., MerrellD.S., Metcalf E.S.: Enterobacterial common antigen mutants ofSalmonella enterica serovar Typhimurium establish a persistent infectionand provide protection against subsequent lethal challenge.Infect. Immun., 2012; 80: 441-450
  Google Scholar
• 15. Gozdziewicz T.K., Lugowski C., Lukasiewicz J.: First evidence fora covalent linkage between enterobacterial common antigen andlipopolysaccharide in Shigella sonnei phase II ECALPS. J. Biol. Chem.,2014; 289: 2745-2754
  Google Scholar
• 16. Greenfield L.K., Whitfield C.: Synthesis of lipopolysaccharideO-antigens by ABC transporter-dependent pathways. Carbohydr.Res., 2012; 356: 12-24
  Google Scholar
• 17. Hübner I., Steinmetz I., Obst U., Giebel D., Bitter-Suermann D.:Rapid determination of members of the family Enterobacteriaceaein drinking water by an immunological assay using a monoclonalantibody against enterobacterial common antigen. Appl. Environ.Microbiol., 1992; 58: 3187-3191
  Google Scholar
• 18. Islam S.T., Lam J.S.: Synthesis of bacterial polysaccharidesvia the Wzx/Wzy-dependent pathway. Can. J. Microbiol., 2014;60: 697-716
  Google Scholar
• 19. Kajimura J., Rahman A., Hsu J., Evans M.R., Gardner K.H., RickP.D.: O acetylation of the enterobacterial common antigen polysaccharideis catalyzed by the product of the yiaH gene of Escherichiacoli K-12. J. Bacteriol., 2006; 188: 7542-7550
  Google Scholar
• 20. Kajimura J., Rahman A., Rick P.D.: Assembly of cyclic enterobacterialcommon antigen in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 2005;187: 6917-6927
  Google Scholar
• 21. Kalynych S., Morona R., Cygler M.: Progress in understandingthe assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Microbiol. Rev.,38: 1048-1065
  Google Scholar
• 22. Kaszowska M.: Budowa chemiczna i biosynteza lipopolisacharydu– ważnego składnika osłony komórkowej bakterii Gram-ujemnych.Postępy Hig. Med. Dośw., 2004; 58: 333-342
  Google Scholar
• 23. Kiss P., Rinno J., Schmidt G., Mayer H.: Structural studies on theimmunogenic form of the enterobacterial common antigen. Eur. J.Biochem., 1978; 88: 211-218
  Google Scholar
• 24. Klein K.A., Fukuto H.S., Pelletier M., Romanov G., GrabensteinJ.P., Palmer L.E., Ernst R., Bliska J.B.: A transposon site hybridizationscreen identifies galU and wecBC as important forsurvival of Yersinia pestis in murine macrophages. J. Bacteriol.,2012; 194: 653-662
  Google Scholar
• 25. Kuhn H.M., Basu S., Mayer H.: Comparison of enterobacterialcommon antigen from different species by serological techniques.Eur. J. Biochem., 1987; 162: 69-74
  Google Scholar
• 26. Kuhn H.M., Meier-Dieter U., Mayer H.: ECA, the enterobacterialcommon antigen. FEMS Microbiol. Rev., 1988; 4: 195-222
  Google Scholar
• 27. Kuhn H.M., Neter E., Mayer H.: Modification of the lipid moietyof the enterobacterial common antigen by the “Pseudomonas factor”.Infect. Immun., 1983; 40: 696-700
  Google Scholar
• 28. Kunin C.M., Beard M.V., Halmagyi N.E.: Evidence for a commonhapten associated with endotoxin fractions of E. coli and other Enterobacteriaceae.Exp. Biol. Med., 1962; 111: 160-166
  Google Scholar
• 29. Levasseur S., Husson M.O., Leitz R., Merlin F., Laurent F., PeladanF., Drocourt J.L., Leclerc H., Van Hoegaerden M.: Rapid detection ofmembers of the family Enterobacteriaceae by a monoclonal antibody.Appl. Environ. Microbiol., 1992; 58: 1524-1529
  Google Scholar
• 30. Lugowski C.: Structure and immunological properties of enterobacterialcommon antigen (ECA). Postępy Hig. Med. Dośw., 1987; 41: 384-432
  Google Scholar
• 31. Lugowski C., Kulakowska M., Romanowska E.: Enterobacterialcommon antigen-tetanus toxoid conjugate as immunogen. Infect.Immun., 1983; 42: 1086-1091
  Google Scholar
• 32. Lugowski C., Romanowska E.: Enterobacterial common antigen:isolation from Shigella sonnei, purification and immunochemical characterization.Eur. J. Biochem., 1978; 91: 89-97
  Google Scholar
• 33. Lugowski C., Romanowska E.: Characterization of an enterobacterialcommon antigen (ECA) epitope recognized by anti-ECA-tetanustoxoid conjugate serum. FEMS Microbiol. Lett., 1991; 61: 315-318
  Google Scholar
• 34. Lugowski C., Romanowska E., Kenne L., Lindberg B.: Identificationof a trisaccharide repeating-unit in the enterobacterial common-antigen.Carbohydr. Res., 1983; 118: 173-181
  Google Scholar
• 35. Lukasiewicz J., Lugowski C.: Biologiczna aktywność lipopolisacharydu.Postępy Hig. Med. Dośw., 2003; 57: 33-53
  Google Scholar
• 36. Maeland J.A., Digranes A.: Common enterobacterial antigen inYersinia enterocolitica. Acta Pathol. Microbiol. Scand. B, 1975; 83: 382-386
  Google Scholar
• 37. Männel D., Mayer H.: Isolation and chemical characterization ofthe enterobacterial common antigen. Eur. J. Biochem., 1978; 86: 361-370
  Google Scholar
• 38. May J.F., Groisman E.A.: Conflicting roles for a cell surface modificationin Salmonella. Mol. Microbiol., 2013; 88: 970-983
  Google Scholar
• 39. McMahon K.J., Castelli M.E., Garcia Vescovi E., Feldman M.F.: Biogenesisof outer membrane vesicles in Serratia marcescens is thermoregulatedand can be induced by activation of the Rcs phosphorelaysystem. J. Bacteriol., 2012; 194: 3241-3249
  Google Scholar
• 40. Muszyński A., Rabsztyn K., Knapska K., Duda K.A., Duda-GrychtołK., Kasperkiewicz K., Radziejewska-Lebrecht J., Holst O., SkurnikM.: Enterobacterial common antigen and O-specific polysaccharidecoexist in the lipopolysaccharide of Yersinia enterocolitica serotypeO:3. Microbiology, 2013; 159: 1782-1793
  Google Scholar
• 41. Noszczynska M., Kasperkiewicz K., Duda K.A., Podhorodecka J.,Rabsztyn K., Gwizdala K., Swierzko A.S., Radziejewska-Lebrecht J.,Holst O., Skurnik M.: Serological characterization of the enterobacterialcommon antigen substitution of the lipopolysaccharide ofYersinia enterocolitica O:3. Microbiology, 2015; 161: 219-227
  Google Scholar
• 42. Paunova-Krasteva T.S., Pavlova V.A., De Castro C., Ivanova R.M.,Molinaro A., Nikolova E.B., Stoitsova S.R.: Cyclic enterobacterialcommon antigens from Escherichia coli O157 as microbe-associatedmolecular patterns. Canad. J. Microbiol., 2014; 60: 173-176
  Google Scholar
• 43. Peters H., Jürs M., Jann B., Jann K., Timmis K.N., Bitter-SuermannD.: Monoclonal antibodies to enterobacterial common antigen andto Escherichia coli lipopolysaccharide outer core: demonstration ofan antigenic determinant shared by enterobacterial common antigenand E. coli K5 capsular polysaccharide. Infect. Immun., 1985;50: 459-466
  Google Scholar
• 44. Phan M.D., Peters K.M., Sarkar S., Lukowski S.W., Allsopp L.P.,Gomes Moriel D., Achard M.E., Totsika M., Marshall V.M., Upton M.,Beatson S.A., Schembri M.A.: The serum resistome of a globally disseminatedmultidrug resistant uropathogenic Escherichia coli clone.PLoS Genet., 2013; 9: e1003834
  Google Scholar
• 45. Plomer M., Guilbault G.G., Hock B.: Development of a piezoelectricimmunosensor for the detection of enterobacteria. Enzyme Microb.Technol., 1992; 14: 230-235
  Google Scholar
• 46. Rabsztyn K., Kasperkiewicz K., Duda K.A., Li C.M., Lukasik M.,Radziejewska-Lebrecht J., Skurnik M.: Characterization of anti-ECAantibodies in rabbit antiserum against rough Yersinia enterocoliticaO:3. Biochemistry, 2011; 76: 832-839
  Google Scholar
• 47. Radziejewska-Lebrecht J., Kasperkiewicz K., Skurnik M., BradeL., Steinmetz I., Swierzko A.S., Muszynski A.: ECA-antibodies inantisera against R mutants of Yersinia enterocolitica O:3. Adv. Exp.Med. Biol., 2003; 529: 215-218
  Google Scholar
• 48. Radziejewska-Lebrecht J., Skurnik M., Shashkov A.S., Brade L.,Rozalski A., Bartodziejska B., Mayer H.: Immunochemical studieson R mutants of Yersinia enterocolitica O:3. Acta Biochim. Pol., 1998;45: 1011-1019
  Google Scholar
• 49. Raetz C.R., Whitfield C.: Lipopolysaccharide endotoxins. Annu.Rev. Biochem., 2002; 71: 635-700
  Google Scholar
• 50. Ramos-Morales F., Prieto A.I., Beuzon C.R., Holden D.W., CasadeusJ.: Role for Salmonella enterica enterobacterial common antigenin bile resistance and virulence. J. Bacteriol., 2003; 185: 5328-5332
  Google Scholar
• 51. Rick P.D., Hubbard G.L., Kitaoka M., Nagaki H., Kinoshita T.,Dowd S., Simplaceanu V., Ho C.: Characterization of the lipid-carrierinvolved in the synthesis of enterobacterial common antigen(ECA) and identification of a novel phosphoglyceride in a mutantof Salmonella typhimurium defective in ECA synthesis. Glycobiology,1998; 8: 557-567
  Google Scholar
• 52. Rinno J., Golecki J.R., Mayer H.: Localization of enterobacterialcommon antigen:immunogenic and nonimmunogenic enterobacterialcommon antigen-containing Escherichia coli. J. Bacteriol., 1980;141: 814-821
  Google Scholar
• 53. Romanowska E., Katzenellenbogen E., Lugowski C., Gamian A.,Bogulska M.: Immunochemical characteristics of Shigella sonnei andserotype 6 Shigella flexneri lipopolysaccharides and enterobacterialcommon antigen. Arch. Immunol. Ther. Exp., 1978; 26: 249-254
  Google Scholar
• 54. Suzuki T., Gorzynski E.A., Neter E.: Separation by ethanol ofcommon and somatic antigens of Enterobacteriaceae. J. Bacteriol.1964; 88: 1240-1243
  Google Scholar
• 55. Whang H.Y., Neter E.: Destruction of common antigen of Enterobacteriaceaeby psychrophilic Pseudomonas. J. Bacteriol., 1965;89: 1436-1437
  Google Scholar
• 56. Whitfield C.: Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens.Trends Microbiol., 1995; 3: 178-185
  Google Scholar

Pełna treść artykułu