Streszczenie

Białka cytochromu P450 to najważniejsze enzymy biorące udział w metabolizmie większości sto­sowanych w klinice leków, odpowiedzialne za ich aktywację lub detoksykację. Niektóre z dróg metabolizmu leku mogą być jednak odpowiedzialne za jego podwyższoną toksyczność. Nowe sys­temy ekspresyjne białek cytochromu P450 w komórkach ssaków, w tym człowieka, projektowa­ne są w celu poznania roli metabolizmu w mechanizmie działania potencjalnych, jak i stosowa­nych w klinice leków, zarówno na poziomie molekularnym, jak i komórkowym. Mogą też służyć do badania wpływu badanych związków na aktywność i ekspresję enzymów metabolizujących. Szczególne znaczenie, zwłaszcza w badaniach potencjalnych chemioterapeutyków, mają ludzkie nowotworowe linie komórkowe wykazujące nadekspresję izoenzymów cytochromu P450. W ba­daniach nad metabolizmem i toksycznością leków najczęściej stosowaną linią komórkową jest ludzka linia HepG2 wyprowadzona z nowotworu wątroby. Ze względu jednak na niski poziom en­zymów metabolizujących w tych komórkach, opracowano linię komórkową Hep3A4, która cha­rakteryzowała się podwyższoną ekspresją izoenzymu CYP3A4. Stabilną nadekspresję izoenzymów cytochromu P450 uzyskano również w komórkach kolejnej linii wyprowadzonej z ludzkiego nowotworu wątroby, HepaRG oraz w komórkach linii IGROV-1, wywodzących się z nowotworu jajnika, a także dwóch linii wyprowadzonych z nowotworu okrężnicy: Caco-2 i LS180. W pracy przedstawiono dotychczas opracowane systemy ekspresyjne białek cytochromu P450 – modele: bakteryjny, drożdżowy, owadzi i ssaczy, w tym ludzki, z uwzględnieniem ich zalet i wad pod ką­tem przydatności do badań podstawowych, jak i wykorzystania na skalę komercyjną.

Słowa kluczowe:cytochrom P450 • ekspresja • linia komórkowa • metabolizm leków • transfekcja

Summary

Cytochrome P450 proteins are the most important enzymes involved in metabolic activation or detoxification of various drugs used in clinical practice. However, some drug metabolism path­ways may be responsible for their increased toxicity. New expression systems of cytochrome P450 proteins in mammalian cells, including human, are designed to explore the influence of metabo­lism on the cellular and molecular mechanisms of action of potential drugs and those used thera­peutically. They can also be used to study the effect of tested compounds on activity and expres­sion of metabolizing enzymes. Human tumor cell lines with overexpression of cytochrome P450 isoenzymes are of particular importance, especially in studies of potential chemotherapeutics. The HepG2 cell line, derived from human liver cancer, is the most commonly used in studies on drug metabolism and toxicity. However, due to the low level of metabolizing enzymes in these cells, the Hep3A4 cell line with overexpression of CYP3A4 isoenzyme was developed. The sta­ble overexpression of cytochrome P450 isoenzymes was also obtained in other human cancer cell lines, including hepatoma HepaRG cells, ovarian cancer IGROV-1 cells, colon cancer Caco-2, and LS180 cells. This review describes currently developed bacterial, yeast, insect and mamma­lian (including human) cytochrome P450 protein expression systems, in terms of their advanta­ges and disadvantages in the context of their suitability for basic research and use on a commer­cial scale.

Key words:cytochrome P450 • expression • drug metabolism • cell line • transfection

Wykaz skrótów:

ARE – sekwencja DNA będąca induktorem syntezy enzymów metabolizujących (antioxidant redox element); Caco-2, LS180 – ludzkie komórki nowotworu okrężnicy (human epithelial colorectal adenocarcinoma cells; intestinal human colon adenocarcinoma cells); CHL – unieśmiertelnione komórki płuc chomika chińskiego (immortalize chinese hamster lung cells); CHO – komórki jajnika chomika chińskiego (chinese hamster ovary); COS-1 – unieśmiertelnione komórki nerki afrykańskiej małpy zielonej (immortalize monkey kidney cells); CYP – izoenzymy cytochromu P450 (cytochrome P450 superfamily); HEK293 – ludzkie komórki embrionalne nerki (human embryonic kidney cells); HepG2 – ludzkie komórki nowotworu wątroby (human hepatoma cells); Hep3A4 – komórkinowotworu wątroby o podwyższonej ekspresji izoenzymu CYP3A4 (human hepatoma cells overexpressing CYP3A4); HepaRG – ludzkie komórki nowotworu wątroby (human hepatoma cells); HLM – ludzkie mikrosomy pochodzące z wątroby (human liver microsomes); IGROV-1 – ludzkie komórki nowotworu jajnika (human ovarian cancer cells); LLC-PK1 – świńskie komórki nabłonkowe (pig kidney epithelial cells); MCF-7/ARE – ludzkie komórki raka piersi z podwyższoną ekspresją sekwencji ARE (human breast adenocarcinoma cells overexpressing ARE); V79 – fibroblasty pochodzące z płuc chomika chińskiego (chinese hamster lung fibroblast).

Wprowadzenie

W organizmie większość stosowanych leków ulega prze­mianom metabolicznym prowadzącym do ich aktywacji lub detoksykacji. Metabolizm aktywacyjny może spowo­dować przejście proleku do jego aktywnej postaci tera­peutycznej lub będzie odpowiedzialny za wywołanie lub zwiększenie działania toksycznego. Z kolei przemiany detoksykacyjne mogą być odpowiedzialne za zmniejsze­nie efektów toksycznych, lecz także za osłabienie działa­nia terapeutycznego. Z tego powodu badanie metabolizmu leków oraz aktywności i ekspresji enzymów metabolizu­jących leki odgrywa główną rolę w określeniu ich właści­wości terapeutycznych. W ramach tych badań należy rów­nież uwzględnić wzajemne interakcje lek-lek oraz różnice genetyczne (np. polimorfizm) poszczególnych pacjentów. Interakcje lek-lek obserwowane w terapii wielolekowej wynikają z możliwości modulacji poziomu i ekspresji białek enzymatycznych przez jeden z leków, co powodu­je zmianę metabolizmu innych stosowanych leków [40]. Natomiast w wyniku polimorfizmu genów, ekspresja bia­łek metabolizujących może być różna u każdego pacjenta. Mamy więc do czynienia ze skomplikowanymi procesa­mi regulacji aktywności enzymatycznej i ekspresji genów enzymów metabolizujących, które wpływają na końcowy efekt działania leku [35,67].

Głównymi enzymami zaangażowanymi w metabolizm le­ków, zarówno aktywacyjny jak i detoksykacyjny, są białka cytochromu P450. Uważa się, że są one odpowiedzialne za transformację niemal 75% stosowanych w lecznic­twie chemioterapeutyków [26]. Białka cytochromu P450 tworzą dużą nadrodzinę enzymów zawierających w swej strukturze grupę hemową. Są one zaangażowane w oksy­dacyjny metabolizm wielu różnorodnych pod względem swej budowy i właściwości związków endogennych, ta­kich jak steroidy i kwasy tłuszczowe oraz egzogennych, do których należą związki ksenobiotyczne: leki, toksyny i związki kancerogenne. Enzymy cytochromu P450 kata­lizują różne reakcje chemiczne, np.: monooksygenacja, peroksydacja, redukcja, dealkilacja, epoksydacja lub de­halogenacja. Reakcje te prowadzą do powstania pochod­nych bardziej polarnych, które mogą być bezpośrednio usu­nięte z organizmu lub dalej być wiązane przez enzymy II fazy metabolizmu. Do tej pory w organizmie człowieka zidentyfikowano 17 grup izoenzymów cytochromu P450 (CYP), kodowanych przez 57 genów funkcjonalnych i 58 pseudogenów. Stwierdzono, że jedynie trzy główne grupy izoenzymów CYP zaangażowane są w metabolizm leków i ksenobiotyków: CYP1, CYP2 oraz CYP3 [55,74,75]. Są one odpowiedzialne za oksydacyjny metabolizm 78% leków przyjmowanych przez człowieka. Izoformami CYP, które najczęściej biorą udział w transformacjach związków są: CYP1A2 (4%), CYP2A6 (2%), CYP2C9 (10%), CYP2C19 (2%), CYP2E1 (2%), CYP2D6 (30%) i CYP3A4 (50%) (ryc. 1) [26,54,55]. Pozostałe grupy izoenzymów odpo­wiadają za metabolizm związków endogennych, odgrywa­jąc istotną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu komórki. Przypuszcza się, że produkty pseudogenów mogą spełniać funkcje regulacyjne podobnie jak RNAi [55].

Ryc. 1. Udział izoenzymów cytochromu P450 w metabolizmie leków (na podstawie [68], zmodyfikowano)

Wobec powyższych faktów, komórkowe systemy ekspresji cytochromów P450 kilku ważnych podrodzin: CYP1A2, CYP2C19 i CYP3A4 odgrywają główną rolę w badaniach wpływu leków na aktywność enzymatyczną innych leków, a także wpływu poziomu ekspresji enzymów metabolizu­jących na przebieg innych procesów ważnych dla życia ko­mórki. Zastosowanie komórek o stabilnej lub przejściowo zmiennej ekspresji cytochromów P450 jest szczególnie istot­ne w badaniach związków przeciwnowotworowych, w któ­rych jednym z kierunków badań jest terapia indywidualna poszczególnych pacjentów różniących się osobniczym po­ziomem ekspresji i aktywności enzymów metabolizujących.

Istnieje kilka systemów in vitro stosowanych do badania metabolizmu leków i ich wpływu na ekspresję enzymów metabolizujących. W praktyce stosuje się: mikrosomy wy­izolowane z ludzkiej wątroby (human liver microsomes HLM), frakcję cytosolową oraz frakcję S9 ludzkiej wą­troby, a także hepatocyty, głównie pierwotne ludzkie he­patocyty. Każdy z tych systemów ma jednak swoje wady. Najlepsze wyniki osiąga się wykorzystując pierwotne he­patocyty, które w pełni pozwalają odtworzyć szlaki bio­transformacji, jakim podlega lek w organizmie chorego. Jednak krótki czas życia oraz genetyczna niestabilność pier­wotnych hepatocytów (spadek ekspresji enzymów CYP) uniemożliwiają prowadzenie badań w szerszym zakresie. Z kolei w wyizolowanych komórkach wątroby lub mikro­somach nie zawsze dochodzi do ekspresji wszystkich en­zymów metabolizujących lub ich poziom jest zbyt niski, by efektywnie badać ich rolę [31]. Powszechnym stało się zatem stosowanie stabilnych linii komórek nowotworo­wych [24,60].

Najczęściej stosowanymi liniami komórkowymi otrzymany­mi z ludzkich nowotworów są: linia HepG2, wyprowadzo­na z nowotworu wątroby, linia IGROV-1, wyprowadzona z nowotworu jajnika oraz dwie linie wyprowadzone z no­wotworu okrężnicy: Caco-2 i LS180 [6]. Jednak poziom ekspresji izoenzymów cytochromu P450 w tych komór­kach, zwłaszcza w HepG2, jest stosunkowo niski [66]. Od niedawna coraz częściej stosowaną linią komórkową w ba­daniach nad metabolizmem i toksycznością leków jest li­nia HepaRG [36]. Została ona wyprowadzona z komórek wątroby chorej na raka wątroby i charakteryzuje się wy­soką ekspresją najważniejszych izoenzymów cytochromu P450 (CYP1A2, 2B6, 2D6, 2E1, 3A4) oraz enzymów za­angażowanych w II fazę metabolizmu leków i białek trans­portujących z rodziny ABC [24,36].

Otrzymano również komórki nowotworowe, w których uzy­skano nadekspresję białek cytochromu P450 [24]. Niżej przedstawiono opracowane i opisane dotychczas w litera­turze modele komórkowe, w których udało się osiągnąć nadekspresję białek CYP: bakterie, drożdże, komórki owa­dów oraz komórki ssaków, w tym ludzkie [55].

Pierwsze modele komórkowe o stabilnej ekspresji ludzkich białek CYP

Do badania metabolizmu leków wygodnym modelem są rekombinantowe izoenzymy cytochromu P450. Otrzymuje się je stosując modele komórkowe jako systemy ekspresyj­ne, do których należą: bakterie, drożdże, komórki owa­dów oraz ssaków.

Pierwszymi modelami komórkowymi, jakie posłużyły do otrzymania rekombinantowych enzymów cytochromu P450, były komórki bakteryjne. Później zastosowano również ko­mórki drożdżowe i owadzie. Wadą tych systemów jest to, że w nieco inny sposób niż w komórkach ludzkich prze­biegają w nich procesy transkrypcji, translacji oraz potran­slacyjna modyfikacja białka. Ponadto poziom pozostałych enzymów metabolizujących leki jest również inny bądź zmieniony. Niekiedy należy wprowadzić do nich dodat­kowe geny, których brak jest w transfekowanym systemie ekspresyjnym [55]. Mimo wielu niedoskonałości bakte­ryjnych modeli komórkowych, z powodzeniem przepro­wadzono na nich wiele badań dotyczących metabolizmu leków i co więcej, w dalszym ciągu stosuje się je do izo­lacji rekombinantowych enzymów cytochromu P450 oraz UDP-glukuronylotransferaz [31].

Bakterie

Escherichia coli jest szczepem bakterii, który najczęściej służy jako model komórkowy do transfekcji. Inny gatu­nek bakterii, który stosuje się jako system ekspresyjny to Salmonella typhimurium [37]. Dzięki zastosowaniu bak­teriofagów – wirusów atakujących bakterie, do komórek tych bakterii można łatwo wprowadzać różne rodzaje wek­torów o silnych promotorach. Cały proces transfekcji ko­mórek, aż do osiągnięcia stabilnej ekspresji wprowadzane­go białka, jest stosunkowy szybki – trwa około 3 miesięcy i jest również mało kosztowny [54]. Podobnie utrzymanie hodowli komórkowej nie wymaga wysokich nakładów fi­nansowych. Komórki rosną szybko w zawiesinie o dużej gęstości i w standardowych mediach hodowlanych [27,30], do której należy jedynie dodać prekursor hemu, niezbęd­ny do katalitycznej aktywności białek cytochromu P450 [73]. Izolację i oczyszczanie białek CYP można przepro­wadzić w łatwy sposób [27]. Główną wadą tego systemu ekspresyjnego jest to, że potranslacyjna modyfikacja bia­łek cytochromu P450 przebiega inaczej niż w komórkach ludzkich. Wymagana jest tutaj modyfikacja N-terminalnej sekwencji białka (zwiększenie zawartości par AT) [23,73]. Modyfikacja ta zapobiega formowaniu się drugorzędowych struktur, co również zwiększa rozpuszczalność białek [23]. Podczas hodowli komórek należy zapewnić odpowiednią temperaturę i pH w celu inkorporacji hemu i prawidłowe­go fałdowania się białka. Z kolei do osiągnięcia katali­tycznej aktywności białek cytochromu P450 w bakteriach, niezbędne jest wprowadzanie dodatkowych wektorów z ge­nami kodującymi białka odpowiedzialne za transfer elek­tronów – reduktazę cytochromu P450 oraz cytochrom b5. Wykazano również, że ekspresja białek CYP w komórkach E. coli zachodzi lepiej przy zapewnieniu niższego stęże­nia tlenu (poniżej 1%) podczas hodowli [63], a aktywność katalityczna izoenzymów jest wyższa przy dodatku egzo­gennej reduktazy cytochromu P450 [71]. Komórki bakte­rii posłużyły jako system ekspresji następujących ludzkich białek cytochromu P450: CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4 [23,71].

Drożdże

Komórki drożdży, to kolejny system ekspresyjny, w którym udało się uzyskać stabilną i bardzo wydajną ekspresję ludz­kich białek cytochromu P450. Gatunki, które poddaje się transfekcji to: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe lub Yarrowia lipolytica (też należący do rodzaju Saccharomyces). Drożdżowy model ma więcej zalet niż opisany wcześniej system bakteryjny. Proces transfekcji przebiega tutaj również szybko (około 3 miesięcy), a ho­dowla komórek oraz izolacja rekombinantowego białka nie sprawiają większej trudności. Synteza białka, jego fałdo­wanie i usytuowanie w błonie przebiegają identycznie jak w komórkach ssaków. Dzięki endogennej błonowej se­kwencji kotwiczącej białko zostaje zintegrowane z retiku­lum endoplazmatycznym. Co więcej, nie jest wymagana modyfikacja N-terminalnej sekwencji cDNA kodującego białko, jak w systemie bakteryjnym. Mikrosomy otrzyma­ne z drożdży są bogate w enzymy cytochromu P450 [12]. Główną wadą drożdżowego systemu ekspresyjnego jest to, że w tych komórkach ekspresja endogennych białek transferu elektronów, czyli reduktazy cytochromu P450 oraz cytochromu b5 zachodzi na zbyt niskim poziomie, by doszło do katalitycznej aktywacji białek CYP. Podobnie jak w systemie bakteryjnym, również do komórek droż­dży wprowadza się dodatkowy plazmid kodujący te biał­ka. Niezbędne jest także wzbogacenie podłoża hodowla­nego w prekursor hemu [12].

Mimo wielu zalet drożdże, w porównaniu do bakterii, są mniej powszechnym modelem komórkowym wykorzy­stywanym do ekspresji ludzkich białek cytochromu P450. Przyczyną tego może być to, iż hodowla bakterii oraz ich transfekcja jest mniej skomplikowana oraz wymaga mniejszych nakładów finansowych niż hodowla drożdży. Ponadto bakterie nie mają endogennych enzymów cyto­chromu P450, a ekspresja rekombinantowych CYP-ów za­chodzi na wyższym poziomie niż w drożdżach [1,58]. Co więcej, w przeciwieństwie do komórek drożdży, komór­ki bakterii można zastosować do produkcji rekombinan­towych ludzkich białek cytochromu P450 na dużą skalę preparatywną, zarówno w badaniach biooksydacyjnych, jak i w produkcji metabolitów [30]. Wiele zespołów na­ukowych na świecie stosuje ten model ekspresyjny także do badania metabolizmu leków. W komórkach drożdży osiągnięto ekspresję m.in. następujących ludzkich białek CYP: CYP1A1 [72], CYP1A2 [28], CYP2A6, CYP2B6 [72], CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19 [50,72], CYP2D6 [72], CYP2E1 [29] oraz CYP3A4 [1,12,50,72].

Komórki owadzie

Model ekspresyjny owadzi jest nieco mniej powszechny w produkcji mikrosomów bogatych w białka cytochro­mu P450 niż wcześniej przedstawione systemy: bakte­ryjny i drożdżowy. W odróżnieniu od systemów bakte­ryjnego i drożdżowego, komórki owadów nie mogą być wykorzystane na skalę preparatywną, a jedynie analitycz­ną. Zalety stosowania komórek owadzich są podobne jak w przypadku komórek drożdżowych. Gen kodujący biał­ka cytochromu P450 wprowadza się z użyciem bakulowi­rusa, a jego inkorporacja zachodzi w prawidłowym miej­scu we wnętrzu komórki gospodarza. Sama transfekcja jest łatwa i szybka – trwa 2-3 mies. Komórki owadzie, które najczęściej używa się do transfekcji to: Spodoptera frugiperda (Sf9) lub Trichoplusia ni (T.ni). W komórkach owadzich ekspresja białka przebiega podobnie jak w ko­mórkach ludzkich, stąd nie jest wymagana modyfikacja sekwencji cDNA [44]. Poziom ekspresji białek cytochro­mu P450 jest analogiczny jak we wcześniej opisanych sys­temach [8]. Co więcej, komórki owadzie są pozbawione endogennych białek cytochromu P450, a to zwiększa sku­teczność badań nad metabolizmem leków w tym systemie [31]. Podobnie jak w systemie bakteryjnym i drożdżowym, główną wadą modelu komórkowego opartego na bakulo­wirusie jest niski poziom endogennych enzymów transfe­ru elektronów, np. reduktazy cytochromu P450. Problem ten rozwiązano wprowadzając do komórki owadziej dru­gi wektor niosący gen tego enzymu lub tworząc jeden po­dwójny wektor, zawierający izoenzym i reduktazę cyto­chromu P450 [15]. Do pożywki hodowlanej dodaje się prekursor hemu, lecz mimo to, w części populacji komó­rek owadzich może brakować apoproteiny w strukturze hemu [64]. Korzekwa i wsp. jako pierwsi opracowali ko­mórki owadzie z ludzkimi białkami cytochromu P450 [8]. Z kolei firma Gentest (Woburn, USA) stworzyła komórki owadzie z następującymi ludzkimi białkami cytochromu P450: CYP1A1, CYP1A2, CYP2A5, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C9, CYP2D6, CYP3A4, CYP2E1 [38,51]. Handlowa nazwa tych mikrosomów to Supersome™.

Ssacze modele komórkowe o podwyższonej ekspresji białek cytochromu P450

Pierwsze komórki ssacze o podwyższonej ekspresji bia­łek cytochromu P450 opracowano w 1986 r. w USA, pod kierunkiem M. Watermana [25]. Model komórkowy jaki poddano transfekcji to unieśmiertelnione komórki nerki pochodzące od afrykańskiej małpy zielonej o nazwie COS-1. W genomie tych komórek znajduje się materiał ge­netyczny małpiego wirusa SV40, dzięki czemu łatwiej ule­gają one transfekcji tym właśnie wirusem. Od tamtej pory udało się stworzyć wiele innych ssaczych, w tym ludzkich, linii komórkowych o podwyższonej ekspresji białek cyto­chromu P450.

Główną zaletą każdego systemu ssaczego jest to, że po­wstające w nim białko ma budowę taką jak w komórce ludzkiej. Wewnątrzkomórkowe mechanizmy pozwalają na odpowiednie umiejscowienie białek cytochromu P450 w retikulum endoplazmatycznym. Są tam obecne enzymy odpowiedzialne za transfer elektronów, a także te biorące udział w II fazie metabolizmu. Dzięki temu można badać transformację leków, ich toksyczność i wpływ na proce­sy zachodzące w komórce. Nie jest wymagana dodatkowa transfekcja komórek wektorami zawierającymi geny kodu­jące reduktazę cytochromu P450 oraz cytochromu b5 [55], chociaż niektóre badania dowodzą, że dla lepszego funk­cjonowania izoenzymów cytochromu P450 korzystne jest wprowadzenie egzogennej reduktazy [19,24]. Dzięki ludz­kim transgenicznym liniom komórkowym można dokład­nie śledzić pojedyncze reakcje przeprowadzane przez kon­kretny enzym. Pozwala to określić wpływ danego białka CYP na biotransformację leku i różnice w cytotoksyczno­ści powstających metabolitów. Transgeniczne linie są przy­datne w izolacji właściwych aktywnych metabolitów, do określenia ich struktury, charakterystyki farmakologicznej i możliwych interakcji lek-lek [31].

Obecnie stosowane metody transfekcji wykorzystują różne wirusy, m.in.: SV40 – do transfekcji komórek COS-1 czy CHO (unieśmiertelnione komórki jajnika chomika chińskie­go), wirus krowianki – do komórek HepG2 (ludzki nowo­twór wątroby) lub wirus Epsteina-Barr – do ludzkich lim­focytów B. Te ostatnie komórki stały się dobrym systemem do przemysłowej produkcji białek cytochromu P450 [55].

Tworzenie ssaczych systemów ekspresyjnych białek cyto­chromu P450 jest najtrudniejszą metodą spośród wszystkich opisanych wyżej modeli. Cały proces transfekcji trwa oko­ło 6 miesięcy, a jego koszty są stosunkowo wysokie, głów­nie ze względu na utrzymanie hodowli komórek (wysoka cena podłoży hodowlanych i odczynników do podtrzyma­nia nadekspresji), co jest niewątpliwie wadą tego systemu ekspresyjnego [31,55]. Większość z opracowanych trans­genicznych linii komórkowych jest jednak równie prosta w hodowli jak linie macierzyste, z których powstały [24]. Poziom ekspresji białek cytochromu P450 jest w ssaczym modelu komórkowym dużo niższy niż w systemach opi­sanych wcześniej. Z tego względu ssacze komórki nie są stosowane do produkcji izoenzymów na skalę komercyj­ną [55]. Poziom białek cytochromu P450 w transfekowa­nych liniach jest jednak wystarczająco wysoki, by można przeprowadzać na nich badania metabolizmu w warun­kach laboratoryjnych.

Komórki COS

Jak już wspomniano wyżej, komórki COS były pierwszą ssaczą linią komórkową o podwyższonej ekspresji izoen­zymów cytochromu P450. Najczęściej wykorzystuje się dwie linie: COS-1 i COS-7. Stosując te komórki udało się stworzyć linię o zwiększonej ekspresji 17-α-hydroksyla­zy cytochromu P450 [25]. Pojawiło się również kilka do­niesień na temat nadekspresji innych hydroksylaz cyto­chromu P450.

Komórki V79

Pierwsza publikacja przedstawiająca zastosowanie komó­rek chomika chińskiego jako systemu ekspresyjnego bia­łek cytochromu P450 ukazała się w 1988 r. [20]. Komórki linii V79 to fibroblasty płuc chomika chińskiego, któ­re zastosowano ze względu na łatwą i powszechnie wy­konywaną w tych komórkach modyfikację genetyczną. Dodatkowo komórki te wprawdzie nie wykazują aktywno­ści enzymatycznej cytochromu P450, lecz mają endogenną reduktazę cytochromu P450. Komórki V79 transfekowa­no za pomocą wektora pSV2 pozostającego pod kontrolą promotora wirusa SV40. Pierwsza linia rekombinantowa wykazywała ekspresję szczurzego izoenzymu P-450IIB1 [20]. W następnych latach opracowano linie komórkowe V79 z ekspresją wielu ludzkich izoenzymów cytochromu P450, takich jak: CYP1A1 [42], CYP1B1 [41], CYP2D6 [5] i CYP3A4, CYP3A5 [52], CYP2E1 [47], które są sto­sowane w wielu laboratoriach.

Komórki CHO

Zespół T. Friedberga z Uniwersytetu w Dundee w Szkocji wykorzystał do transfekcji izoenzymami CYP również inny typ komórek chomika chińskiego – komórki linii CHO, wywodzące się z unieśmiertelnionych komórek jajnika. Komórki te są powszechnie stosowane w przemyśle jako system ekspresyjny do produkcji wielu rodzajów białek, dzięki możliwości ich łatwej transfekcji.

Wspomniano wcześniej, że w komórkach ssaczych są obecne enzymy transferu elektronów. Wydawało się jed­nak, że mała aktywność metaboliczna białek cytochromu P450 wprowadzanych do komórek może wynikać z nie­wystarczającej ilości reduktazy, która przywraca równo­ważniki do reakcji przeprowadzanych przez cytochrom P450. Z tego też względu postanowiono zwiększyć jej pulę wprowadzając egzogenną reduktazę [19]. Pierwsza opracowana transgeniczna linia komórkowa CHO wyka­zywała koekspresję ludzkiego izoenzymu CYP3A4 cyto­chromu P450 i NADPH reduktazy cytochromu P450 [19]. Opracowano również linie komórkowe wykazujące poje­dynczą nadekspresję reduktazy cytochromu P450 lub izo­enzymu CYP3A4. Stworzono także analogiczny system ekspresyjny w komórkach CHO dla izoenzymu CYP2D6 [61]. Wspomniane linie są nadal powszechnie stosowane [10,48]. W innych ośrodkach naukowych opracowano ko­mórki CHO z nadekspresją następujących ludzkich izo­enzymów cytochromu P450: CYP1A1 [3], CYP1A2 [49], CYP2A6, CYP2A13 [34].

Komórki CHL

Unieśmiertelnione komórki płuc chomika chińskiego – linia CHL, to kolejny przykład zastosowania tych komó­rek jako systemu ekspresyjnego białek cytochromu P450 [32]. Komórki CHL transfekowane były plazmidem pSR metodą koprecypitacji z fosforanem wapnia. Tutaj rów­nież, oprócz izoenzymów cytochromu P450, do komórek wprowadzano dodatkowo reduktazę cytochromu P450 po­chodzącą od świnki morskiej. W ten sposób uzyskano ko­mórki CHL z koekspresją reduktazy cytochromu P450 z na­stępującymi ludzkimi izoenzymami: CYP1A2, CYP2E1 [57], CYP3A4 [11,32], CYP3A7 [32].

Komórki LLC-PK1

Kolejny model ekspresyjny białek cytochromu P450 to ko­mórki LLC-PK1 – świńskie komórki nabłonkowe nerki, do których wprowadzono gen kodujący ludzki izoenzym CYP3A4. Komórki te wybrano do transfekcji ze wzglę­du na wysoką ekspresję białka oporności wielolekowej P-glikoproteiny (MDR1). Dzięki temu można było ba­dać interakcje, jakie zachodzą między aktywnością biał­ka CYP3A4 a MDR1. Za pomocą adenowirusa AdV, uży­wając kilku różnych wektorów lub wirusa Epsteina-Barr z wektorem p220.2 z silnym promotorem wirusa CMV, wprowadzono do komórek LLC-PK1 gen CYP3A4 [13,59], uzyskując bardzo wysoką i stabilną nadekspresję ludzkie­go izoenzymu CYP3A4.

Ludzkie linie z nadekspresją białek cytochromu P450

Dotąd opracowano niewiele ludzkich, w tym nowotworo­wych linii komórkowych wykazujących nadekspresję izo­enzymów cytochromu P450. Ponieważ wiele z poszukiwa­nych obecnie nowych chemioterapeutyków ma oddziaływać specyficznie na komórki nowotworowe, wiele uwagi po­święca się poszukiwaniu właśnie modeli linii nowotwo­rowych. Najwięcej białek cytochromu P450 znajduje się w wątrobie. Powszechnie dostępna i stosowana linia wy­prowadzona z ludzkich komórek nowotworowych wątroby, HepG2 charakteryzuje się, jak już wyżej wspomniano, ni­skim poziomem i aktywnością enzymów metabolizujących, zwłaszcza izoenzymu CYP3A4 [66]. Stąd konieczne sta­ło się poszukiwanie innych modeli i ich modyfikacja [24].

Komórki limfoblastyczne B

Pierwsza ludzka linia komórkowa wykazująca nadekspre­sję białek cytochromu P450 została wyprowadzona z limfo­blastów B [25]. Komórki limfoblastyczne B, zaprojektowa­ne jako AHH^-1 TK^+/-, to nienowotworowe, nieprzyklejające się komórki, w których w łatwy sposób zachodzi replika­cja wprowadzonych do chromosomów wektorów zawiera­jących origin replikacji dla wirusa Epsteina-Barr. Komórki te zawierają pojedyncze kopie genów kinazy tymidynowej i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej, dzięki czemu stały się idealne do badań toksykologicznych. Dodatkowo w komórkach AHH^-1 TH^+/- znajduje się odpowiedni po­ziom reduktazy cytochromu P450 i cytochromu b5 wspo­magających katalityczne działanie cytochromu P450. Do genomu transfekowanej komórki może zostać włączonych 5-40 kopii obcego cDNA. W związku z różną liczbą kopii DNA wprowadzanych białek cytochromu P450 rekombi­nantowe komórki limfoblastów B są niejednorodne, a cały proces transfekcji, aż do osiągnięcia stabilnej linii, jest dłu­gotrwały i żmudny [14].

Wykorzystując wyżej przedstawioną technikę, opracowa­no komórki limfoblastów B o podwyższonej ekspresji na­stępujących ludzkich izoenzymów: CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C6, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1 i CYP3A4. Do komórek wprowadzono dodatkowo gen ko­dujący mikrosomalną hydroksylazę epoksydową. Udało się otrzymać komórki wykazujące nadekspresję nie tylko poje­dynczego białka cytochromu P450, lecz również ich kom­binacji [14]. Komórki te służą zarówno jako źródło mikro­somów [62], jak i model komórkowy, na którym prowadzi się badania metabolizmu ksenobiotyków [4].

Komórki AD-293 (HEK293)

Linia wywodząca się z ludzkich komórek embrionalnych nerki, HEK293 to popularna nienowotworowa ludzka li­nia komórkowa, szeroko stosowana jako system ekspresyj­ny białek cytochromu P450. Z czasem zmodyfikowano tę linię, zwiększając jej właściwości adherentne, tworząc li­nię AD-293. Dzięki obecności genu E1 adenowirusa ko­mórki linii AD-293, podobnie jak HEK293, łatwo ulegają modyfikacjom genetycznym. Do transfekcji wykorzystuje się zatem wektory powstałe na bazie adenowirusów pozba­wionych genu E1, np. pAd, pMT2 czy pSVL [9].

W 1997 r. przeprowadzono pierwsze doświadczenia na re­kombinantowej linii AD-293 [43], która wykazywała stabil­ną nadekspresję izoenzymów CYP3A4 oraz CYP3A7. Do transfekcji wykorzystano plazmidy pMT2 mające w swo­jej sekwencji geny kodujące wspomniane białka cytochro­mu P450. Jako czynnik selekcyjny wprowadzono do nich gen kodujący genetycynę G418. Do wprowadzenia wekto­ra zastosowano metodę precypitacji z fosforanem wapnia. W późniejszych latach opracowano kolejne stabilne linie AD-293 o nadekspresji różnych ludzkich izoenzymów cy­tochromu P450, takich jak: CYP1A1, CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9. Ponownie stworzono linie komórkowe z nade­kspresją białek CYP3A4 i CYP3A7, a także CYP3A5, tym razem w koekspresji z reduktazą cytochromu P450. Podwójną nadekspresję uzyskano dzięki wprowadzeniu drugiego plazmidu z cDNA kodującego reduktazę przy zastosowaniu analogicznej metody [56]. Stworzono rów­nież linię komórkową HEK293 o podwójnej nadekspresji ludzkiego izoenzymu CYP2B1 i reduktazy cytochromu P450. Jako wektora użyto plazmid pMCV, a jako czynni­ka selekcyjnego genetycynę [45].

Komórki Caco-2

Zróżnicowane ludzkie komórki nowotworowe nabłonka odbytu Caco-2, to jedna z najpopularniejszych ludzkich linii nowotworowych stosowana do badania leków – ich wchłaniania, transportu do wnętrza komórki oraz metabo­lizmu. W bazach danych można znaleźć stosunkowo naj­więcej publikacji opisujących doświadczenia wykonane na tej linii komórkowej. Ze względu jednak na niski po­ziom endogennych białek cytochromu P450, podjęto pró­bę wprowadzenia dodatkowych kopii genów poszukiwa­nych enzymów [46]. Po raz pierwszy dwie transgeniczne linie Caco-2 opisano w 1996 r.: z nadekspresją izoenzy­mu CYP2A6 oraz CYP3A4. Rolę wektora pełnił plazmid p220.2 z origin replikacji dla wirusa Epsteina-Barr zawie­rający cDNA wspomnianych enzymów pozostających pod kontrolą promotora wirusa cytomegalii. Oprócz sekwencji kodujących białka cytochromu P450, plazmidy te zawiera­ły gen oporności na higromycynę B, dzięki czemu w łatwy sposób można było wyselekcjonować komórki rekombi­nantowe. Do wnętrza komórek wektory wprowadzono za pomocą elektroporacji [16]. Stosując wyżej opisaną tech­nikę uzyskano stabilną nadekspresję izoenzymów CYP2A6 i CYP3A4 w ludzkich nowotworowych komórkach Caco-2. W porównaniu do limfoblastów B, komórki Caco-2 charakteryzują się nieco niższą aktywnością CYP3A4. Ze względu na brak stabilności cech związanych z trans­portem leków do wnętrza komórki, wspomniana linia ko­mórkowa nie jest już obecnie tak powszechnie stosowana [7,17]. Dostępna jest również linia Caco-2 z nadekspresją izoenzymu CYP3A4, do wytworzenia której wykorzysta­no metodę przedstawioną dla systemu komórek LLC-PK1, gdzie wektorem był adenowirus AdV [59].

Komórki HepG2

Do badań metabolizmu i toksyczności leków przez długi czas stosowano ludzkie komórki nowotworowe wątroby HepG2. Ze względu jednak na stosunkowo niski poziom izoenzymów cytochromu P450, a zwłaszcza CYP3A4 [66], komórki tej linii zmodyfikowano, wprowadzając do nich sekwencje cDNA kodujące białka cytochromu P450. Pierwszą opracowaną transgeniczną linią komór­kową HepG2 była linia E47, wykazująca stabilną i wyso­ką nadekspresję izoenzymu CYP2E1 [69]. Do transfek­cji zastosowano plazmid pCl-neo z promotorem wirusa cytomegalii. W swojej sekwencji wektor ten zawierał gen kodujący enzym CYP2E1 oraz gen oporności na genety­cynę, który został wykorzystany jako czynnik selekcyjny do izolacji rekombinantowych komórek. Wektor wprowa­dzono za pomocą metody z zastosowaniem lipofektami­ny. Dla linii E47 opracowano także linię odnośnikową z tzw. wektorem zerowym – komórki C34, gdzie do ko­mórek HepG2 wprowadzono wektor pozbawiony jakie­gokolwiek białka. Dzięki temu, przy porównywaniu wy­ników toksyczności eliminowano wpływ samego procesu transfekcji komórek [69]. Kolejna opracowana linia ko­mórkowa, Hep3A4, charakteryzowała się podwyższoną ekspresją izoenzymu CYP3A4. cDNA kodujący białko CYP3A4 wprowadzono do komórek HepG2 analogicz­nie jak przy tworzeniu komórek E47 [22]. Opisane wy­żej linie są szeroko stosowane przez różne laboratoria na całym świecie [39,70].

Wykorzystując inną metodę transfekcji, a mianowicie sto­sując wektor pcDNA3.1 zawierający gen oporności na ge­netycynę jako marker selekcyjny, opracowano kilka linii komórkowych HepG2 z nadekspresją następujących bia­łek CYP: 1A1, 1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2E1 oraz 3A4. Wektor wprowadzono do komórek HepG2 dzięki li­pofektaminie. Skonstruowano również tzw. linię kontrol­ną, do której wprowadzono pusty wektor pcDNA3.1 [33].

Ciekawą strategię czasowej transfekcji komórek HepG2 eg­zogennymi białkami cytochromu P450 przedstawiła gru­pa naukowców z Hiszpanii. Opracowali oni adenowirusy zawierające w swym materiale genetycznym odpowiednie ludzkie izoenzymy cytochromu P450. Wektory te bardzo szybko wnikają do wnętrza komórek wątroby, gdzie ich DNA ulega ekspresji. Nadekspresja białek CYP utrzymu­je się w komórkach przez 3-4 dni. Proces transfekcji jest mało skomplikowany i szybki, choć należy go powtarzać przy każdym kolejnym doświadczeniu. W ten sposób otrzy­mano adenowirusy z następującymi ludzkimi izoenzyma­mi cytochromu P450: CYP1A2, CYP2C9 i CYP3A4 [21].

Komórki 1847

Kolejny przykład zastosowania ludzkich nowotworowych linii komórkowych do ekspresji białek cytochromu P450 to linia wywodząca się z komórek nowotworowych jajnika o nazwie 1847 [2]. Wybrano te komórki ze względu na obec­ność klonu opornego na działanie palitakselu, w którym w naturalny sposób doszło do nadekspresji białka oporno­ści wielolekowej P-glikoproteiny. Transfekcji poddano ko­mórki linii dzikiej o niskiej ekspresji genu MDR1, a także linii wykazującej nadekspresję. Do komórek wprowadzono gen kodujący izoenzym CYP3A4 oraz reduktazę cytochro­mu P450. Zastosowana metoda transfekcji była analogicz­na, jak opisana wyżej przy tworzeniu linii CHO-HR-3A4 [19]. Dzięki takiemu modelowi komórek można było ba­dać oddziaływania między białkami oporności wielole­kowej a izoenzymem CYP3A4, których ekspresja jest ze sobą powiązana przez wspólny czynnik jądrowy, PXR [2].

Komórki MCF-7/ARE

Ciekawą i obiecującą ludzką nowotworową linią komór­kową do badania wpływu białek cytochromu P450 na me­tabolizm i toksyczność chemioterapeutyków jest linia wy­wodząca się z komórek raka piersi, MCF-7 wykazująca podwyższoną ekspresję sekwencji ARE (antioxidant re­dox element) oraz czynnika 2 NF-E2 zależnego od p45 (Nrf2). Elementy ARE, to sekwencje DNA znajdujące się w obrębie promotora, funkcjonujące jako induktory eks­presji białek. Za indukcję białek odpowiada czynnik Nrf2. Badania wykazały, że przy podwyższonej ekspresji białka Nrf2 zachodzi indukcja ekspresji enzymów metabolizują­cych zawierających w sekwencji promotora element ARE. Dzięki takiemu mechanizmowi przede wszystkim zwięk­sza się poziom enzymów eliminujących reaktywne formy tlenu (ROS). Może również dojść do stymulacji ekspresji białek cytochromu P450. Wzrost indukcji ekspresji zależ­nej od elementu ARE można w komórkach linii MCF-7/ARE w łatwy sposób sprawdzać, dzięki obecności lucy­ferazy, której aktywność w tym przypadku jest zależna od poziomu czynnika Nrf2. Linia MCF-7/ARE stała się bar­dzo przydatnym modelem komórkowym do badania tok­syczności leków przeciwnowotworowych [65].

W związku z tym, że w komórkach linii MCF-7/ARE w ułatwiony sposób dochodzi do ekspresji białek zaanga­żowanych w metabolizm leków, komórki te wybrano do transfekcji genami kodującymi białka cytochromu P450. Izoenzymy, których nadekspresję udało się osiągnąć w oma­wianej linii komórkowej to: CYP1A1, CYP2A6, CYP2D6 oraz CYP3A4 w koekspresji z reduktazą cytochromu P450. Opracowano również linię, która jednocześnie wykazuje nadekspresję wszystkich wymienionych pięciu białek cy­tochromu P450. Zastosowanie tej linii komórkowej po­zwala odróżnić toksyczność chemioterapeutyków zależną od funkcjonowania samej komórki oraz toksyczność wy­nikającą z aktywności enzymów cytochromu P450 [18].

Podsumowanie

W procesie opracowywania nowych leków oraz ich wdra­żania do kliniki niezbędne jest poznanie metabolizmu, ja­kiemu podlega proponowany związek. Różne szlaki bio­transformacji mogą bowiem prowadzić do powstawania metabolitów bardzo toksycznych dla organizmu i wywo­ływać niebezpieczne działanie. Dodatkowo, znajomość aktywnych postaci chemioterapeutyków okazać się może przydatna w projektowaniu nowych leków lub ulepsza­niu już istniejących. Wiedza o metabolizmie danego leku może być również pomocna w przewidywaniu oddziały­wań między stosowanymi jednocześnie chemioterapeuty­kami w terapiach wielolekowych.

W powyższych badaniach wykorzystywane są m.in. opisane w niniejszej pracy modele komórkowe stosowane jako sys­temy ekspresyjne białek cytochromu P450. Dzięki wspo­mnianym liniom komórkowym wykazano lub potwier­dzono, że za metaboliczną aktywację irinotekanu [56], R-ifosfamidu [10] lub eliptycyny [53] odpowiada izoen­zym CYP3A4. Dowiedziono, że popularny lek, jakim jest paracetamol (APAPTM) powoduje spadek aktywno­ści izoenzymu CYP3A4, co może mieć poważne konse­kwencje przy stosowaniu kilku leków jednocześnie [22]. Dzięki transgenicznym liniom komórkowym sprawdzono wpływ polimorfizmu izoenzymu CYP2D6 na metabolizm kilku często stosowanych w klinice leków, m. in. tamoksy­fenu, imipraminy czy bufaralolu oraz związków będących w badaniach klinicznych. Wykazano, że właściwości ka­talityczne danej postaci polimorficznej CYP2D6 zależały od rodzaju substratu. Zatem zdolności metaboliczne pa­cjenta z określonym allelem genu CYP2D6 zmieniają się w zależności od stosowanego leku [5]. Z kolei mikroso­my bogate w izoenzym CYP2D6 otrzymane z transgenicz­nych komórek limfoblastycznych B zastosowano do badań nad metabolizmem pochodnych amfetaminy [62]. Linie komórkowe z nadekspresją izoenzymu CYP3A4 i biał­ka oporności wielolekowej P-glikoproteiny posłużyły zaś do badania wzajemnych korelacji między wspomnianymi dwoma białkami, których ekspresja zależna jest od jed­nego wspólnego czynnika jądrowego. Biorąc pod uwagę powyższe fakty, systemy ekspresyjne białek cytochromu P450 są bardzo przydatne do badania metabolizmu leków powszechnie stosowanych, a także tych wprowadzanych do kliniki. Stanowią bowiem czasami jedyną alternatywę dla badań roli cytochromu P450 w szlakach metabolizmu leków u chorych.

PIŚMIENNICTWO

[1] Andrews J., Abd-Ellah M.F., Randolph N.L., Kenworthy K.E., Carlile D.J., Friedberg T., Houston J.B.: Comparative study of the metabolism of drug substrates by human cytochrome P450 3A4 expressed in bacterial, yeast and human lymphoblastoid cells. Xenobiotica, 2002; 32: 937-947
[PubMed]  

[2] Baron J.M., Goh L.B., Yao D., Wolf C.R., Friedberg T.: Modulation of P450 CYP3A4-dependent metabolism by P-glycoprotein: implications for P450 phenotyping. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2001; 296: 351-358
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[3] Bendaly J., Zhao S., Neale J.R., Metry K.J., Doll M.A., States J.C., Pierce W.M Jr, Hein D.W.: 2-Amino-3,8-dimethylimidazo-[4,5-f]quinoxaline-induced DNA adduct formation and mutagenesis in DNA repair-deficient chinese hamster ovary cells expressing human cytochrome P4501A1 and rapid or slow acetylator N-acetyltransferase 2. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2007; 16: 1503-1509
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[4] Bodreddigari S., Jones L.K., Egner P.A., Groopman J.D., Sutter CH., Roebuck B.D., Guengerich F.P., Kensler T.W., Sutter T.R.: Protection against aflatoxin B₁-induced cytotoxicity by expression of the cloned aflatoxin B₁-aldehyde reductases rat AKR7A1 and human AKR7A3. Chem. Res. Toxicol., 2008; 21: 1134-1142
[PubMed]  

[5] Bogni A., Monshouwer M., Moscone A., Hidestrand M., Ingelman-Sundberg M., Hartung T., Coecke S.: Substrate specific metabolism by polymorphic cytochrome P450 2D6 alleles. Toxicol. In Vitro, 2005; 19: 621-629
[PubMed]  

[6] Brandon E.F., Bosch T.M., Deenen M.J., Levink R., Van Der Wal E., Van Meerveld J.B., Bijl M., Beijnen J.H., Schellens J.H., Meijerman I.: Validation of in vitro cell models used in drug metabolism and transport studies; genotyping of cytochrome P450, phase II enzymes and drug transporter polymorphisms in the human hepatoma (HepG2), ovarian carcinoma (IGROV-1) and colon carcinoma (Caco-2, LS180) cell lines. Toxicol. Appl. Pharmacol., 2006; 211: 1-10
[PubMed]  

[7] Budzinski J.W., Foster B.C., Trudeau V.L., Drouin C.E., Bafi-Yeboa N., Arnason J.T.: The interaction of selected phytochemicals, HIV drugs, and commercial-source herbal teas and capsules with human cytochrome P450 3A4 and p-glycoprotein. Pharm. Biol., 2008; 46: 53-65

[8] Buters J.T., Korzekwa K.R., Kunze K.L., Omata Y., Hardwick J.P., Gonzalez F.J.: cDNA-directed expression of human cytochrome P450 CYP3A4 using baculovirus. Drug Metab. Dispos., 1994; 22: 688-692
[PubMed]  

[9] Catalog information „AD-293 cells” Stratagene – An Agilent Technologies Company

[10] Chen C.S., Jounaidi Y., Waxman D.J.: Enantioselective metabolism and cytotoxicity of R-ifosfamide and S-ifosfamide by tumor cell-expressed cytochromes P450. Drug Metab. Dispos., 2005; 33: 1261-1267
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[11] Chen J., Yang X.X., Huang M., Hu Z.P., He M., Duan W., Chan E., Sheu F.S., Chen X., Zhou S.F.: Small interfering RNA-mediated silencing of cytochrome P450 3A4 gene. Drug Metab. Dispos., 2006; 34: 1650-1657
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[12] Cheng J., Wan D., Gu J., Gong Y., Yang S., Hao D., Yang L.: Establishment of a yeast system that stably expresses human cytochrome P450 reductase: Application for the study of drug metabolism of cytochrome P450s in vitro. Protein Expr. Purif., 2006; 47: 467-476
[PubMed]  

[13] Crespi C.L., Fox L., Stocker P., Hu M., Steimel D.T.: Analysis of drug transport and metabolism in cell monolayer systems that have been modified by cytochrome P4503A4 cDNA-expression. Eur. J. Pharm. Sci., 2000; 12: 63-68
[PubMed]  

[14] Crespi C.L., Langenbach R., Penman B.E.: Human cell lines, derived from AHH-1 TK+/- human lymphoblasts, genetically engineered for expression of cytochromes P450. Toxicology, 1993; 82: 89-104
[PubMed]  

[15] Crespi C.L., Penman B.W.: Use of cDNA-expressed human cytochrome P450 enzymes to study potential drug-drug interactions. Adv. Pharmacol., 1997; 43: 171-188
[PubMed]  

[16] Crespi C.L., Penman B.W., Hu M.: Development of Caco-2 cells expressing high level of cDNA-derived cytochrome P4503A4. Pharm. Res., 1996; 13: 1635-1641
[PubMed]  

[17] Cummins C.L., Jacobsen W., Christians U., Benet L.Z.: CYP3A4-transfected Caco-2 cells as a tool for understanding biochemical absorption barriers: studies with sirolimus and midazolam. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2004; 308: 143-155
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[18] Ding S., Vardy A., Elcombe C.R., Wolf C.R.: An in vitro model for the prediction of chemical metabolism and toxicity. Toxicology, 2009; 262: 23

[19] Ding S., Yao D., Burchell B., Wolf C.R., Friedberg T.: High levels of recombinant CYP3A4 expression in chinese hamster ovary cells are modulated by coexpressed human P450 reductase and hemin supplementation. Arch. Biochem. Biophys., 1997; 348: 403-410
[PubMed]  

[20] Doehmer J., Dogra S., Friedberg T., Monier S., Adesnik M., Glatt H., Oesch F.: Stable expression of rat cytochrome P-45011B1 cDNA in chinese hamster cells (V79) and metabolic activation of aflatoxin B1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988; 85: 5769-5773
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[21] Donato M.T., Hallifax D., Picazo L., Castell J.V., Houston J.B., Gomez-Lechó M.J., Lahoz A.: Metabolite formation kinetics and intrinsic clearance of phenacetin, tolbutamide, alprazolam, and midazolam in adenoviral cytochrome P450-transfected HepG2 cells and comparison with hepatocytes and in vivo. Drug Metab. Dispos., 2010; 38:1449-1455
[PubMed]  

[22] Feierman D.E., Melnikov Z., Zhang J.: The paradoxical effect of acetaminophen on CYP3A4 activity and content in transfected HepG2 cells. Arch. Biochem. Biophys., 2002; 398: 109-117
[PubMed]  

[23] Gillam E.M.: Engineering cytochrome P450 enzymes. Chem. Res. Toxicol., 2008; 21: 220-231
[PubMed]  

[24] Gomez-Lechon M.J., Donato M.T., Lahoz A., Castell J.V.: Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Curr. Drug. Metab., 2008; 9: 1-11
[PubMed]  

[25] Gonzalez F.J., Korzekwa K.R.: Cytochromes P450 expression systems. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1995; 35: 369-390
[PubMed]  

[26] Guengerich F.P.: Cytochrome P450s and other enzymes in drug metabolism and toxicity. AAPS J., 2006; 8: E101-E111
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[27] Guengerich F.P., Martin M.V.: Purification of cytochromes P450: products of bacterial recombinant expression systems. Methods Mol. Biol., 2006; 320: 31-37
[PubMed]  

[28] Guo Y., Breeden L.L., Fan W., Zhao L.P., Eaton D.L., Zarbl H.: Analysis of cellular responses to aflatoxin B₁ in yeast expressing human cytochrome P450 1A2 using cDNA microarrays. Mutat. Res., 2006; 593: 121-142
[PubMed]  

[29] Hanioka N., Yamamoto M., Tanaka-Kagawa T., Jinno H., Narimatsu S.: Functional characterization of human cytochrome P450 2E1 allelic variants: in vitro metabolism of benzene and toluene by recombinant enzymes expressed in yeast cells. Arch. Toxicol., 2010; 84: 363-371
[PubMed]  

[30] Hanlon S.P., Friedberg T., Wolf C.R., Ghisalba O., Kittelmann M.: Recombinant yeast and bacteria that express human P450s: bioreactors for drug discovery, development, and biotechnology. W: Modern Biooxidation: Enzymes, Reactions and Applications, red.: R.D. Schmid, V.B. Urlacher. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co, Weinheim, Germany, 2007, 231-252

[31] Hariparsad N., Sane R.S., Strom S.C., Desai P.B.: In vitro methods in human drug biotransformation research: implications for cancer chemotherapy. Toxicol. In Vitro, 2006; 20: 135-153
[PubMed]  

[32] Hashimoto H., Nakagawa T., Yokoi T., Sawada M., Itoh S., Kamataki T.: Fetus-specific CYP3A7 and adult-specific CYP3A4 expressed in chinese hamster CHL cells have similar capacity to activate carcinogenic mycotoxins. Cancer Res., 1995; 55: 787-791
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[33] Hashizume T., Yoshitomi S., Asahi S., Uematsu R., Matsumura S., Chatani F., Oda H.: Advantages of human hepatocyte-derived transformants expressing a series of human cytochrome p450 isoforms for genotoxicity examination. Toxicol. Sci., 2010; 16: 488-497
[PubMed]  

[34] He X.Y., Tang L., Wang S.L., Cai Q.S., Wang J.S., Hong J.Y.: Efficient activation of aflatoxin B1 by cytochrome P450 2A13, an enzyme predominantly expressed in human respiratory tract. Int. J. Cancer, 2006; 118: 2665-2671
[PubMed]  

[35] Ingelman-Sundberg M., Sim S.C., Gomez A., Rodriguez-Antona C.: Influence of cytochrome P450 polymorphisms on drug therapies: pharmacogenetic, pharmacoepigenetic and clinical aspects. Pharmacol. Ther., 2007; 116: 496-526
[PubMed]  

[36] Josse R., Aninat C., Glaise D., Dumont J., Fessard V., Morel F., Poul J.M., Guguen-Guillouzo C., Guillouzo A.: A long-term functional stability of human HepaRG hepatocytes and use for chronic toxicity and genotoxicity studies. Drug Metab. Dispos., 2008; 36: 1111-1118
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[37] Kamataki T.: Genetic polymorphism of CYP2A6 and tobacco-related cancer risk: from the establishment of genetically engineered Salmonella to large scale epidemiology. Genes Environ., 2006; 28: 77-83

[38] Kazui M., Nishiya Y., Ishizuka T., Hagihara K., Farid N.A., Okazaki O., Ikeda T., Kurihara A.: Identification of the human cytochrome P450 enzymes involved in the two oxidative steps in the bioactivation of clopidogrel to its pharmacologically active metabolite. Drug Metab. Dispos., 2010; 38: 92-99
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[39] Koch O.R., Fusco S., Ranieri S.C., Maulucci G., Palozza P., Larocca L.M., Cravero A.A., Farre’ S.M., De Spirito M., Galeotti T., Pani G.: Role of the life span determinant P66(shcA) in ethanol-induced liver damage. Lab. Invest., 2008; 88: 750-760
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[40] Kumar G.N., Surapaneni S.: Role of drug metabolism in drug discovery and development. Med. Res. Rev., 2001; 21: 397-411
[PubMed]  

[41] Kushman M.E., Kabler S.L., Ahmad S., Doehmer J., Morrow C.S., Townsend A.J.: Cytotoxicity and mutagenicity of dibenzo[a,l]pyrene and (±)-dibenzo[a,l]pyrene-11,12-dihydrodiol in V79MZ cells co-expressing either hCYP1A1 or hCYP1B1 together with human glutathione-S-transferase A1. Mutat. Res., 2007; 624: 80-87
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[42] Kushman M.E., Kabler S.L., Ahmad S., Doehmer J., Morrow C.S., Townsend A.J.: Protective efficacy of hGSTM1-1 against B[a]P and (+)- or (-)-B[a]P-7,8-dihydrodiol cytotoxicity, mutagenicity, and macromolecular adducts in V79 cells coexpressing hCYP1A1. Toxicol. Sci., 2007; 99: 51-57
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[43] Lacroix D., Sonnier M., Moncion A., Cheron G., Cresteil T.: Expression of CYP3A in the human liver: evidence that the shift between CYP3A7 and CYP3A4 occurs immediately after birth. Eur. J. Biochem., 1997; 247: 625-634
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[44] Lee C.A., Kost T.A., Serabjit-Singh C.J.: Recombinant baculovirus strategy for coexpression of functional human cytochrome P450 and P450 reductase. Methods Enzymol., 1996; 272: 86-95
[PubMed]  

[45] Lengler J., Omann M., Duvier D., Holzmuller H., Gregor W., Salmons B., Gunzburg W.H., Renner M.: Cytochrome P450 reductase dependent inhibition of cytochrome P450 2B1 activity: implications for gene directed enzyme prodrug therapy. Biochem. Pharmacol., 2006; 72: 893-901
[PubMed]  

[46] Li J., Hidalgo I.J.: The evolving role of the Caco-2 cell model to estimate intestinal absorption potential and elucidate transport mechanisms. W: The Process of New Drug Discovery and Development, Second Edition, red. C.G. Smith, J.T. O’Donnell. Informa Healthcare, USA 2006, 161-186

[47] Liu Y., Glatt H.: Human cytochrome P450 2E1 and sulfotransferase 1A1 coexpressed in chinese hamster V79 cells enhance spontaneous mutagenesis. Environ. Mol. Mutagen., 2010; 51: 23-30
[PubMed]  

[48] Lu H., Chen C.S., Waxman D.J.: Potentiation of methoxymorpholinyl doxorubicin anti-tumor activity by P450 3A4 gene transfer. Cancer Gene Ther., 2009; 16: 393-404
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[49] Metry K.J., Zhao S., Neale J.R., Doll M.A., States J.C., Mcgregor W.G., Pierce W.M. Jr., Hein D.W.: 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo [4,5-b] pyridine-induced DNA adducts and genotoxicity in chinese hamster ovary (CHO) cells expressing human CYP1A2 and rapid or slow acetylator N-acetyltransferase 2. Mol. Carcinog., 2007; 46: 553-563
[PubMed]  

[50] Narimatsu S., Yonemoto R., Saito K., Takaya K., Kumamoto T., Ishikawa T., Asanuma M., Funada M., Kiryu K., Naito S., Yoshida Y., Yamamoto S., Hanioka N.: Oxidative metabolism of 5-methoxy-N,N-diisopropyltryptamine (Foxy) by human liver microsomes and recombinant cytochrome P450 enzymes. Biochem. Pharmacol., 2006; 71: 1377-1385
[PubMed]  

[51] Pearce R.E., Lu W., Wang Y., Uetrecht J.P., Correia M.A., Leeder J.S.: Pathways of carbamazepine bioactivation in vitro. III. The role of human cytochrome P450 enzymes in the formation of 2,3-dihydroxycarbamazepine. Drug Metab. Dispos., 2008; 36: 1637-1649
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[52] Peng F.C., Chang C.C., Yang C.Y., Edwards R.J., Doehmer J.: Territrems B and C metabolism in human liver microsomes: major role of CYP3A4 and CYP3A5. Toxicology, 2006; 218: 172-185
[PubMed]  

[53] Poljaková J., Frei E., Gomez J.E., Aimová D., Eckschlager T., Hrabeta J., Stiborová M.: DNA adduct formation by the anticancer drug ellipticine in human leukemia HL-60 and CCRF-CEM cells. Cancer Lett., 2007; 252: 270-279
[PubMed]  

[54] Pritchard M.P., McLaughlin L., Friedberg T.: Establishment of functional human cytochrome P450 monooxygenase systems in Escherichia coli. Meth. Mol. Biol., 2006; 320: 19-29
[PubMed]  

[55] Purnapatre K., Khattar S.K., Saini K.S.: Cytochrome P450s in the development of target-based anticancer drugs. Cancer Lett., 2008; 259: 1-15
[PubMed]  

[56] Santos A., Zanetta S., Cresteil T., Deroussent A., Pein F., Raymond E., Vernillet L., Risse M.L., Boige V., Gouyette A., Vassal G.: Metabolism of irinotecan (CPT-11) by CYP3A4 and CYP3A5 in humans. Clin. Cancer Res., 2000; 6: 2012-2020
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[57] Sawada M., Kamataki T.: Genetically engineered cells stably expressing cytochrome P450 and their application to mutagen assays. Mutat. Res., 1998; 411: 19-43
[PubMed]  

[58] Schroer K., Kittelmann M., Lutz S.: Recombinant human cytochrome P450 monooxygenases for drug metabolite synthesis. Biotechnol. Bioeng., 2010; 106: 699-706
[PubMed]  

[59] Schuetz G.: Creation of polarized cells coexpressing CYP3A4, NADPH cytochrome P450 reductase and MDR1/p-glycoprotein. Pharm. Res., 2000; 17: 803-810
[PubMed]  

[60] Sharma S.V., Haber D.A., Settleman J.: Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat. Rev. Cancer., 2010; 10: 241-253
[PubMed]  

[61] Smith G., Mode S., Pillai I., Lian L.Y., Sutcliffe M.J., Pritchard M.P., Friedberg T., Roberts G.C., Wolf C.R.: Determinants of the substrate specificity of human cytochrome P-450 CYP2D6: design and construction of a mutant with testosterone hydroxylase activity. Biochem. J., 1998; 331: 783-792
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[62] Staack R.F., Maurer H.H.: Metabolism of designer drugs of abuse. Curr. Drug. Metab., 2005; 6: 259-274
[PubMed]  

[63] Vail R.B., Homann M.J., Hanna I., Zaks A.: Preparative synthesis of drug metabolites using human cytochrome P450s 3A4, 2C9 and 1A2 with NADPH-P450 reductase expressed in Escherichia coli. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2005; 32: 67-74
[PubMed]  

[64] Venkatakrishnan K., Von Moltke L.L., Greenblatt D.J.: Human drug metabolism and the cytochromes P450: application and relevance of in vitro models. J. Clin. Pharmacol., 2001; 41: 1149-1179
[PubMed]  

[65] Wang X.J., Hayes J.D., Wolf C.R.: Generation of a stable antioxidant response element-driven reporter gene cell line and its use to show redox-dependent activation of Nrf2 by cancer chemotherapeutic agents. Cancer Res., 2006; 66: 10983-10994
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[66] Westerink W., Schoonen W.: Cytochrome P450 enzyme levels in HepG2 cells and cryopreserved primary human hepatocytes and their induction in HepG2 cells. Toxicol. In Vitro, 2007; 21: 1581-1591
[PubMed]  

[67] Wilkinson G.R.: Drug metabolism and variability among patients in drug response. N. Engl. J. Med., 2005; 352: 2211-2221
[PubMed]  

[68] Wiśniewska A., Mazerska Z.: Izoenzymy cytochromu P450 w metabolizmie związków endo- i egzogennych. Postępy Biochem., 2009; 55: 259-271
[PubMed]  [Abstract]  

[69] Wu D., Cederbaum A.I.: Development and properties of HepG2 cells that constitutively express CYP2E1. Methods Mol. Biol., 2008; 447: 137-150
[PubMed]  

[70] Wu D., Wang X., Zhou R., Cederbaum A.: CYP2E1 enhances ethanol-induced lipid accumulation but impairs autophagy in HepG2 E47 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2010; 402: 116-122
[PubMed]  

[71] Yamazaki H., Nakamura M., Komatsu T., Ohyama K., Hatanaka N., Asahi S., Shimada N., Guengerich F.P., Shimada T., Nakajima M., Yokoi T.: Roles of NADPH-P450 reductase and apo- and holo-cytochrome b5 on xenobiotic oxidations catalyzed by 12 recombinant human cytochrome P450s expressed in membranes of Escherichia coli. Protein. Expr. Purif., 2002; 24: 329-337
[PubMed]  

[72] Yasuda K., Ikushiro S., Kamakura M., Ohta M., Sakaki T.: Metabolism of sesamin by cytochrome P450 in human liver microsomes. Drug Metab. Dispos., 2010; 38: 2117-2123
[PubMed]  

[73] Yun C.H., Yim S.K., Kim D.H., Ahn T.: Functional expression of human cytochrome P450 enzymes in Escherichia coli. Curr. Drug Metab., 2006; 7: 411-429
[PubMed]  

[74] Zanger U.M., Turpeinen M., Klein K., Schwab M.: Functional pharmacogenetics/genomics of human cytochromes P450 involved in drug biotransformation. Anal. Bioanal. Chem., 2008; 392: 1093-1108
[PubMed]  

[75] Zhou S.F., Liu J.P., Chowbay B.: Polymorphism of human cytochrome P450 enzymes and its clinical impact. Drug Metab. Rev., 2009; 41: 89-295
[PubMed]  

Autorki deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu