Abstrakt

Streszczenie

Monocyty należą do mieloidalnych komórek efektorowych, tworzą pierwszą linię obrony nieswoistej organizmu przed patogenami oraz pełnią istotną funkcję w utrzymaniu homeostazy organizmu. W wyniku stymulacji monocyty różnicują się w makrofagi mające zdolność do fagocytozy drobnoustrojów i do wydzielania czynników odgrywających główną rolę w regulacji reakcji immunologicznej organizmu. Długotrwała ekspozycja monocytów/makrofagów na lipopolisacharyd bakterii Gram-ujemnych – LPS doprowadza do nabycia przez te komórki immunotolerancji, czego skutkiem jest zaburzenie wielu procesów biologicznych m.in. wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych oraz towarzyszy wielu stanom chorobowym (schorzenia o podłożu immunologicznym, zapalnym, czy nowotworowym). W regulacji aktywności monocytów/makrofagów biorą udział także miRNA, które są jednocześnie zaangażowane w modulację immunotolerancji nabytej przez te komórki. Zjawisko immunotolerancji wpływa również na procesy potranskrypcyjne i potranslacyjne modyfikacje epigenetyczne, co może upośledzać prawidłową reakcję immunologiczną m.in. przez zmiany w regulacji ekspresji wielu genów zaangażowanych w jej przebieg. Przedmiotem pracy jest przedstawienie stanu wiedzy na temat modulacji aktywności monocytów/makrofagów w odpowiedzi na bakteryjną endotoksynę, a także konsekwencji zaburzenia odpowiedzi immunologicznej i równowagi ustroju.

Wstęp

Monocyty są komórkami pochodzącymi z haploidalnych komórek macierzystych dających początek prekursorom mieloidalnym i limfoidalnym, które w następstwie róż- nicowania ulegają dalszej specyfikacji w komórki efektorowe predysponowane do pełnienia określonych funkcji w organizmie. Rola monocytów podobnie jak innych komórek mieloidalnych czy limfoidalnych skupia się głównie na ochronie organizmu przed drobnoustrojami przez ich udział w reakcjach odpornościowych. W odpowiedzi na różne bodźce środowiska, tj. przerwanie ciągłości tkanek bądź infekcja patogenami, monocyty wydostają się z krwiobiegu i ulegają przekształceniu w komórki dendrytyczne lub fagocytarne makrofagi tkankowe [28].

Makrofagi opisał Miecznikow, który został laureatem Nagrody Nobla za zidentyfikowanie fagocytów i teorię fagocytozy. Od tego czasu poczyniono duży postęp w odkryciu mechanizmu aktywacji makrofagów i roli jaką odgrywają w organizmach. Dotychczasowe dane literaturowe wskazują, że makrofagi są ważnymi komórkami odporności wrodzonej [14]. Odporność wrodzona, będąca pierwszą barierą ochronną zapewnia szybką, ale niepełną odpowiedź przeciwbakteryjną organizmu gospodarza, do czasu aż rozwinie się nabyta odpowiedź immunologiczna [29]. Dlatego makrofagi odgrywają istotną rolę w pierwotnej reakcji organizmu na patogeny, prawidłowej homeostazie tkankowej, prezentacji obcych i własnych antygenów [14].

Układ odpornościowy ma jednak pewne wady, które wpływają na szlaki warunkujące prawidłową odpowiedź immunologiczną, a jego działanie może ulegać zakłóceniu pod wpływem pewnych czynników, takich jak np. LPS (lipopolysaccharide) będący endotoksyną bakteryjną [24].

Pierwszy kontakt monocytów i makrofagów z bakteryjną endotoksyną wywołuje pożądaną reakcję organizmu i uruchomienie transkrypcji genów kodujących cytokiny prozapalne w monocytach i makrofagach. Dłuższa ekspozycja tych komórek na bakteryjną endotoksynę powoduje natomiast nabywanie przez monocyty i makrofagi tolerancji na endotoksyny, która polega na zahamowaniu ekspresji genów kodujących cytokiny prozapalne, co upośledza działanie całego układu immunologicznego [24]. U podłoża tego zjawiska leżą epigenetyczne oraz potranslacyjne mechanizmy współpracujące ze szlakami transdukcji sygnału regulującymi ekspresję mediatorów prozapalnych. Zaburzenia wewnątrzkomórkowych szlaków mogą doprowadzić do paraliżu układu odpornościowego, dla którego cytokiny i chemokiny pełnią funkcję cząstek sygnałowych [29].

Różnicowanie monocytów w makrofagi oraz polaryzacja M1, M2

Klasyczne monocyty prozapalne zawierają zestaw receptorów rozpoznających konserwatywne wzorce patogenów PRR (pattern recognition receptors), uniwersalne dla szerokiej grupy tych organizmów. W zainfekowanym organizmie wchodzą w interakcje ze znajdującymi się na powierzchni drobnoustrojów charakterystycznymi wzorcami związanymi z patogenami PAMP (pathogen associated molecular patterns), w skład których wchodzi m.in. LPS, glikoproteiny, lipidy, cukry i białka powierzchniowe. Interakcja między PRR a PAMP uruchamia ekspresję cytokin prozapalnych, odpowiedzialnych za inicjację reakcji zapalnej [13].

Do najlepiej poznanych receptorów PRR należą receptory Toll-podobne TLR (Toll-like receptors), których N-końcowe fragmenty bogate w leucynę determinują rozpoznawanie PAMP, natomiast C-końcowa domena TIR odpowiada za mechanizmy wewnątrzkomórkowej odpowiedzi na PAMP [13].

Lipopolisacharydy bakteryjne są antygenami powierzchniowymi charakterystycznymi dla bakterii Gram-ujemnych, a aktywność biologiczna zależy od ich uwolnienia z komórek bakterii. Odgrywają zasadniczą rolę w budowie i funkcji zewnętrznej ich ściany komórkowej. Cząsteczka bakteryjnej endotoksyny jest zbudowana z lipidu A odpowiadającego za jego aktywność i endotoksyczność rdzenia oligocukrowego będącego domeną środkową i łańcucha O-swoistego warunkującego zmienność wewnątrzgatunkową patogenów. Bakteryjna endotoksyna bierze udział w transporcie hydrofobowych cząsteczek do wnętrza komórek bakteryjnych i jest istotnym czynnikiem w interakcjach mikroorganizm-gospodarz [31].

Monocyty różnicują się w makrofagi pod wpływem czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) lub czynnika stymulującego tworzenia kolonii makrofagów M-CSF (macrophage colony-stimulating factor). Polaryzacja makrofagów może się odbywać w sposób klasyczny – prozapalne makrofagi o fenotypie M1 bądź alternatywnej – przeciwzapalne makrofagi o fenotypie M2 [32].

Polaryzacja M1 zachodzi w pierwszym etapie odpowiedzi zapalnej pod wpływem ligandów bakteryjnych receptorów TRL, takich jak interferon gamma IFN-γ (interferon gamma) i bakteryjna endotoksyna. Wówczas prozapalne makrofagi M1 wydzielają wiele cytokin prozapalnych, tj. interleukiny IL-1β, -6, -12, -18 i czynnik martwicy nowotworu TNF-α (tumor necrosis factor), chemokin prozapalnych CCL 8-11 oraz 13, reaktywne formy tlenu ROS (reactive oxygen species) i uruchamiany jest metabolizm argininy inicjujący wytwarzanie tlenku azotu NO (nitric oxide) [27,32].

Polaryzacja M2 odbywa się w późniejszym etapie reakcji zapalnej – w procesach regeneracyjnych, a także w nowotworach, włóknieniu tkanek i miażdżycy [27]. Polaryzacja przeciwzapalnych makrofagów M2 może się odbywać trzema drogami polaryzacji: M2a, M2b oraz M2c. Polaryzacja M2a zachodzi pod wpływem IL-4 i IL-13, towarzyszy jej aktywacja czynników, takich jak receptory mannozowe CD206 i CD209 (mannose receptor), aktywatory receptorów steroidowych RNA SR-A1 (steroid receptor RNA activator 1), receptory lektyn typu C DCL-1 (phagocytic C-Type lectin receptor), insulinopodobne czynniki wzrostu IGF1 (insulin-like growth factor 1) oraz wytwarzanie fibroleukiny FGL2 (fibrinogen-like protein 2) i transformującego czynnika wzrostu TGF-β (transforming growth factor β), CCL (CCL13, 14, 17, 18, 23, 26). Polaryzacja M2b zachodzi głównie pod wpływem IL-1β lub bakteryjnej endotoksyny i towarzyszy jej wytwarzanie IL-10, CCL (CCL1, 20), CXCL (CXCL1, 2, 3). Polaryzacja M2c następuje natomiast w odpowiedzi na TGF-β i IL-10 towarzyszy jej wytwarzanie CD163, IL-21R, TLR1, TLR8 i CCL18 (ryc. 1) [26,17].

Ryc. 1. Klasyczna (M1) i alternatywna (M2a-c) aktywacja makrofagów [opracowanie autorskie]

Ważnym aspektem polaryzacji makrofagów jest możliwość ewolucji ekspresji transkrypcji niektórych genów w czasie. Przykładem może być stopniowe tłumienie ekspresji genów w prozapalnych monocytach i makrofagach w odpowiedzi na długotrwałą ekspozycję na bakteryjną endotoksynę, którą nazywa się „endotoksyną tolerancji” [20].

Wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe są zaangażowane w modulowanie odpowiedzi immunologicznej organizmu oraz ich zaburzenia w odpowiedzi na stymulację bakteryjną endotoksyną

MyD88 iTRIFjako mediatory sygnalizacji komórkowej inicjowanej aktywacją receptora TLR4

W wyniku kontaktu z patogenami, receptory TLR aktywują wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne. Aktywacja receptorów Toll-podobnych obecnych na powierzchni błon komórkowych monocytów/makrofagów prowadzi do indukcji swoistej odpowiedzi immunologicznej. Dotychczas u ludzi zidentyfikowano 10 rodzajów receptorów TLR: TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR10 obecnych w błonie komórkowej oraz TLR3, TLR7, TLR8 i TLR9 w błonach endosomów i lizosomów umiejscowionych w cytoplazmie [18]. Receptor TLR4 jest najlepiej poznanym receptorem TLR rozpoznającym lipopolisacharyd bakterii Gram-ujemnych – LPS. Natomiast długotrwała i/lub kilkukrotna ekspozycja monocytów/makrofagów na działanie bakteryjnej endotoksyny zaburza wewnątrzkomórkowe szlaki transdukcji sygnałów przekazywanych przez receptory TLR, na poziomie samego receptora, białek adaptorowych, enzymów, a także czynników transkrypcyjnych [1].

MyD88-zależna transdukcja sygnału przekazywana od receptora TLR4

Aktywacja receptora TLR4 jest uwarunkowana obecnością dwóch białek, takich jak: MD2 i mCD14 (postać błonowa białka CD14, zakotwiczona w błonie komórkowej m.in. monocytów/makrofagów, za pomocą łącznika glikofosfatydyloinozytolowego). W wyniku kontaktu z patogenem dochodzi do utworzenia kompleksu TLR4/MD2/ mCD14, który rozpoznaje LPS. Dalsza droga transdukcji sygnału od receptora TLR4 odbywa się za pośrednictwem białek adaptorowych, tj. MyD88 (myeloid differentiation 88) i TIRAP (TIR-domain-containing adapter protein) [1]. Homodimer składający się z białek MyD88-MyD88 w obecności białka TIRAP łączy się z receptorem TLR4, czego skutkiem jest aktywacja zarówno receptora, jak i kinazy IRAK4 (interleukin-1 receptor-associated kinase 4) oraz fosforylacja kinazy IRAK1 (interleukin-1 receptor-associated kinase 1). Ufosforylowana kinaza IRAK1 łączy się z czynnikiem TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6), aktywując kompleks TAK1/TAB, który prowadzi do aktywacji kinazy MAP (mitogen activated protein kinases) oraz kinaz serynowo-treoninowych IKK (inhibitor of nuclear factor-κB kinase) odpowiadających za fosforylację białek IκB [7]. Fosforylacja białek inhibitorowych powoduje ich degradację w wyniku ubikwitynacji i proteolitycznego rozkładu przez proteasom 26S. Wskutek odłączenia białka inhibitorowego IκB od czynnika transkrypcyjnego NF-κB (nuclear factor-kappa B) dochodzi do odsłonięcia sekwencji NLS białka NF-κB, umożliwiając jego translokację do jądra komórkowego, gdzie jako aktywny czynnik transkrypcyjny, reguluje transkrypcję licznych genów docelowych kodujących prozapalne cytokiny, chemokiny, cząsteczki adhezji komórkowej oraz enzymy wytwarzające czynniki prozapalne [38]. W odpowiedzi na stymulowanie komórek bakteryjną endotoksyną zaobserwowano w makrofagach o genotypie MyD88^– /^– oraz TRIF^– /^– , że białko MyD88 jest odpowiedzialne za aktywację NF-κB, a TRIF odpowiada za późniejszą jego aktywację [7].

MyD88-niezależna transdukcja sygnału przekazywana od receptora TLR4

Odpowiedź na dsRNA i długotrwałe oddziaływanie receptora TRL4 z endotoksyną bakteryjną prowadzi do MyD88-niezależnej aktywacji receptora TLR4, w której główną rolę odgrywa białko adaptorowe TRIF i białko TRAF3. Ubikwitylacja białka TRAF3 uaktywnia kinazy TBK1 (TANK-binding kinase 1; TANK-TRAF-associated NF-κB activator) i IKK, które następnie fosforylują czynnik transkrypcyjny IRF3 (interferon regulatory factor 3). Wówczas IRF3 ulega translokacji do jądra komórkowego, gdzie opóźnia ekspresje dwóch genów, takich jak: TNF-α i IFN-β. Natomiast w makrofagach długotrwale stymulowanych bakteryjną endotoksyną szlak TRIF/IRF3 doprowadza do nadekspresji genu kodującego przeciwzapalną cytokininę IL-10 [7,37].

Zaburzenia szlaku NF-κB podczas tolerancji bakteryjną endotoksyną

Jądrowy czynnik transkrypcyjny NF-κB należy do rodziny białek NF-κB. Dotychczas zidentyfikowano u ssaków pięć czynników transkrypcyjnych: p50/p105 (NF-κB1), p52/p100 (NF-κB2), p65 (RelA), RelB i c-Rel. Kanoniczny szlak NF-κB jest zaangażowany w proces regulacji transkrypcji wielu ważnych genów, będących mediatorami procesu zapalnego. W warunkach fizjologicznych czynnik transkrypcyjny NF-κB występuje w cytoplazmie większości komórek w postaci nieaktywnego dimeru utworzonego z białek p50/p65 połączonego z białkami IκB [38]. W odpowiedzi na różnorodne bodźce nieaktywny dimer p50/p65 ulega aktywacji i translokacji do jądra komórkowego, gdzie reguluje transkrypcję docelowych genów. Dostępne dane literaturowe dowodzą, że podczas tolerancji bakteryjną endotoksyną dochodzi do zaburzenia przekazywania sygnału na szlaku NF-κB zarówno w mysich makrofagach, jak i ludzkich monocytach. Zaobserwowano podwyższoną ekspresję homodimeru składającego się z białek p50/p50. Białka p50 w przeciwieństwie do białek p65 są pozbawione sekwencji TAD (transcription activation domain), umiejscowionej na C-końcu odpowiedzialnej za aktywację transkrypcji. Wówczas homodimer p50/p50 działa jako represor transkrypcji wielu genów, takich jak: TNF-α, IL-1β, IL-6 oraz IL-12β. Pośrednio wpływa natomiast na wzrost ekspresji genów kodujących czynniki przeciwzapalne, takie jak TGF-β i IL-10, których nadekspresja jest charakterystyczna dla procesu immunotolerancji [6]. Ponadto podczas tolerancji bakteryjną endotoksyną w cytoplazmie dochodzi do akumulacji inhibitorów IκB głównie: IκBα i IκBε, które przez przyłączenie się do NF-κB maskują sekwencję NLS, uniemożliwiając translokację czynnika transkrypcyjnego NF-κB do jądra komórkowego. Badania przeprowadzone przez Litvaka i wsp. [23] dowodzą, że stymulacja bakteryjną endotoksyną uaktywnia nie tylko białka NF-κB, ale także czynnik transkrypcyjny C/ EBPδ w mysich makrofagach, który jest zaangażowany w regulację ekspresji m.in. genu IL-6.

Negatywne regulatory sygnalizacji receptora TRL4 podczas tolerancji endotoksyną LPS

sCD14

Białko CD14 występuje w postaci rozpuszczalnej (sCD14) w surowicy, moczu i innych płynach fizjologicznych. Receptor sCD14 rywalizuje z mCD14 o wiązanie bakteryjnej endotoksyny, czego skutkiem może być brak odpowiedzi na jej działanie zarówno w układzie in vitro jak i in vivo, zwłaszcza w aktywacji komórek niewykazujących ekspresji mCD14, takich jak komórki śródbłonka, nabłonka i mięśni gładkich [25].

ST2

ST2 występujący w błonie komórkowej monocytów/ makrofagów należy do negatywnych regulatorów sygnalizacji TRL4. Badania Liu i wsp. [21] dowiodły, że w odpowiedzi na działanie bakteryjnej endotoksyny, białko ST2 hamuje sygnalizację MyD88-zależną, w którą jest zaangażowane m.in. białko TIRAP, uniemożliwiając translokację czynnika transkrypcyjnego NF-κB i aktywację ekspresji docelowych genów.

SIGIRR

Białko SIGIRR (single-immunoglobulin and toll – interleukin1 receptor) występuje w błonie komórkowej monocytów i niedojrzałych komórek dendrytycznych. Jest zbudowane z domeny zewnątrzkomórkowej Ig i wewnątrzkomórkowej TIR, które są niezbędne do hamowania przekazywania sygnału przez receptor IL-1β , natomiast tylko domena TIR jest odpowiedzialna za inhibicje sygnalizacji LPS. SIGIRR hamuje sygnalizację od receptoraTRL4, hamując zarówno MyD88-zależną, jak i niezależną ścieżkę transdukcji sygnału [1].

Białko MyD88s

Białko MyD88s jest zaangażowane w ujemny mechanizm kontrolujący nadmierną aktywację receptorów TLR. Badania in vitro przeprowadzone przez Janssens i wsp. [16] dowodzą, że 16-godzinna stymulacja bakteryjną endotoksyną wywołuje nadekspresję MyD88s w ludzkich unieśmiertelnionych monocytach linii THP1. Skutkiem nadmiernej ekspresji MyD88s jest utworzenie heterodimeru składającego się z białek MyD88s-MyD88 zamiast homodimeru MyD88-MyD88, którego obecność jest wymagana do rekrutacji IRAK4. Wówczas kinaza IRAK1 przez domenę DD oddziałuje z białkiem MyD88s, ale nie zostaje ufosforylowana przez IRAK4. Uniemożliwia to aktywację podrzędnych białek zaangażowanych w przewodzenie sygnału od receptora TLR4 [1].

IRK-M

Ekspresja IRK-M jest indukowana głównie w okresie różnicowania makrofagów i podczas sygnalizacji TRL. Wzrost ekspresji kinazy IRK-M w odpowiedzi na niskie stężenie bakteryjnej endotoksyny potwierdzono zarówno u myszy, jak i u ludzkich unieśmiertelnionych monocytów [1]. Domena DD (death domain) umiejscowiona na N-końcu kinazy IRK-M jest niezbędna do interakcji cytoplazmatycznej domeny TIR z białkiem MyD88. C-końcowa domena TIR jest najważniejsza w uruchomianiu kaskady sygnałów, w następstwie kontaktu z białkami adaptorowymi. Kinaza IRK-M może tworzyć również heterodimery z kinazą IRK-1/2 i wiązać się zarówno z białkiem MyD88, jak i białkiem TRF6. Kinaza IRAK-M razem z heterodimerem MyD88/IRAK4 hamuje fosforylację kinazy IRAK1, uniemożliwiając połączenie TRAF6 z IRAK1 i doprowadzając do inhibicji kinaz IKK i MAP, niezbędnych do aktywacji czynników transkrypcyjnych, tj. NF-κB i AP1 (activator protein 1), kontrolujących ekspresję czynników prozapalnych [6].

A20

Białko A20 może regulować zarówno MyD88-zależne i niezależne szlaki sygnalizacyjne od receptorów TLR. Hamuje ekspresje TRAF6 na szlaku receptora TLR4, prowadzącego do aktywacji NF-κB. Zahamowanie ekspresji TRAF6 uniemożliwia fosforylację białka IκB, co stabilizuje kompleks IκB-NF-κB w cytoplazmie, blokując aktywację transkrypcji istotnych genów przez czynnik transkrypcyjny NF-κB. Badania in vitro na mysich monocytach z endotoksemią wskazały, że kompleks A20-TRF6 zapobiega aktywacji NF-κB w odpowiedzi na działanie bakteryjnej endotoksyny, a wyciszenie białka A20 pozwala na przywrócenie funkcji TRAF6 i aktywację NF-κB. Białko to może zatem mieć podstawowe znaczenie dla powstawania zjawiska indukowanej endotoksyną tolerancji, ponieważ w badanym układzie eksperymentalnym zaobserwowano ekspresję białka A20 i MKP1 (inhibitor transdukcji sygnału) już po 2 h stymulacji mysich monocytów z endotoksemią bakteryjną endotoksyną [36].

Epigenetyczne modyfikacje wywołane przez tolerancję na bakteryjne endotoksyny

Analiza ekspresji genów w komórkach, w których wyindukowano zjawisko tolerancji pozwala na wyróżnienie dwóch klas genów, których transkrypcja inicjowana jest aktywacją receptora TLR4, mianowicie geny klasy T (called tolerizable genes or class T), tj. geny kodujące cytokiny prozapalne, których transkrypcja zostaje wyciszona w krótkim czasie po pierwszej ekspozycji komórek na działanie endotoksyny oraz geny klasy NT (non-toleriza genes or class NT), które pozostały indukowalne lub których transkrypcja ulega zwiększeniu w odpowiedzi na ponowną ekspozycję na bakteryjną endotoksynę [2].

Analiza transkryptomu ludzkich monocytów oraz mysich makrofagów w stanie ET (endotoxin tolerance) wykazała zmiany ekspresji genów spowodowane epigenetycznymi modyfikacjami histonów, które zmieniają stopień upakowania chromatyny, a to ma znaczący wpływ na jego dostępność dla czynników transkrypcyjnych [7]. Mono- i trzymetylacja reszty lizyny w pozycji 4 histonu H3 (H3K4me1, H3K4me3) oraz acetylacja reszt lizyny histonów H3 i H4 w obrębie proksymalnych i dystalnych sekwencji regulatorowych genów wzmacniają ich transkrypcję, podczas gdy metylacja lizyny w pozycji 9 i 27 histonu H3 (H3K9me3, H3K27me3) w kondensacji chromatyny i represji transkrypcji [4].

Według danych literaturowych pierwsza stymulacja makrofagów powoduje trzymetylację reszty lizyny w pozycji 4 histonu H3 (H3K4me3) zarówno w obrębie promotorów genów klasy T, jak i NT, acetylację histonu H4 oraz przyłączenia białka BRG1 będącego składnikiem kompleksu remodelującego nukleosomy, który ułatwia wiązanie się czynników transkrypcyjnych, m.in. NF-κB oraz ekspresję genów od niego zależnych [2,5]. Podczas gdy aktywująca transkrypcję metylacja lizyny w pozycji 4 histonu H3 utrzymuje się w sekwencjach promotorowych genów klasy NT, zostaje usunięta z regionów regulatorowych genów klasy T. W konsekwencji geny klasy NT, w przeciwieństwie do genów klasy T, ulegają transkrypcji w odpowiedzi na ponowną stymulację komórek bakteryjną endotoksyną. Badania Fostera i wsp. [11] zwróciły uwagę na możliwy udział enzymów odpowiedzialnych za epigenetyczne modyfikacje histonów w nabywaniu tolerancji niektórych genów. Inhibicja demetylazy LSD1 (lysine-specific histone demethylase 1), która odpowiada za eliminację metylacji reszt lizyny białek histonowych, za pomocą pargyliny zapobiegała wyciszeniu genów klasy T przez utrzymanie m.in. wspomnianej wcześniej trzymetylacji reszty lizyny w pozycji 4 histonu H3. W makrofagach nie zaobserwowano metylacji reszty lizyny w pozycji 9 i 27 histonu H3 (H3K9me, H3K27me) w żadnej z omawianych klas genów. Inaczej jest w monocytach z nabytą w wyniku ekspozycji na bakteryjną endotoksynę tolerancją, gdzie metylacja reszty lizyny w pozycji 9 (H3K9me) oraz brak fosforylacji seryny w pozycji 10 histonu H3 (H3S10) osłabiało wiązanie się czynnika transkrypcyjnego NF-κB (podjednostki p65) z promotorem genu IL-1β i obniżenie ekspresji cytokiny IL-1β. Podobny mechanizm represji transkrypcji zaobserwowano również w przypadku genu TNF-α. Ponadto, w wyciszeniu genów IL-1β i TNF-α wykazano udział białka o dużej ruchliwości elektroforetycznej – HMGB1 (high mobility group box 1 protein) ułatwiające wiązanie histonu H1 DNA w obrębie sekwencji promotorowych tych genów, co zwiększało kondensacje chromatyny i represję transkrypcji kontrolowanej przez czynnik NF-κB, w którym podjednostka p65 zastępowana była ponadto przez czynnik RelB (v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B) [7,11]. Uwolnienie białka HMGB1 spowodowane działanie bakteryjnej endotoksyny, powoduje oddysocjowanie RelB z promotorów genów IL-1β i TNF-α, a także eliminuje metylację reszty lizyny w pozycji 9 histonu H3 (H3K9me) [7,34].

Rola miRNA w modulowaniu aktywności monocytów/ makrofagów i immunotolerancji

Innym istotnym mechanizmem regulującym ekspresję genów są cząsteczki niekodującego RNA (non-coding RNA; ncRNA) stanowiące ponad 90% wszystkich transkryptów ludzkiego genomu. Do najlepiej poznanych ncRNA należą: długie niekodujące RNA (long non-coding RNA; lncRNA) oraz mikroRNA (microRNA; miRNA; miR). Dotychczasowe dane literaturowe wskazują, że miRNA odgrywa istotną rolę w różnicowaniu oraz aktywacji fenotypu monocytów/makrofagów. miRNA17-5p, miRNA-20a oraz miRNA-106a, miRNA424 zwiększają ekspresję genów czynnika transkrypcyjnego RUNX1 (runt-related transcription factor 1) oraz receptora M-CSF [10,30]. Podczas różnicowania monocytów do prozapalnych makrofagów o fenotypie M1 pod wpływem GM-CSF dochodzi do obniżenia ekspresji miRNA-142-3p, czego skutkiem jest wzrost aktywności czynnika transkrypcyjnego Egr2 (early growth response 2) [19]. W prozapalnych makrofagach M1 zidentyfikowano ekspresję miRNA26a, miRNA125a, miRNA155, w makrofagach o fenotypie M2a miRNA193b, natomiast w makrofagach fenotypu M2b miRNA27a, miRNA29b, miRNA132, miRNA155 i miRNA222 [12]. Badania przeprowadzone przez Zhu i wsp. [40] dowodzą, że w makrofagach stymulowanych bakteryjną endotoksyną dochodzi do obniżenia aktywności regulatorowego białka sygnałowego SIRPα (signal-regulatory protein α), który moduluje odpowiedź zapalną. Inhibicja aktywności SIRPα jest skorelowana z ekspresją miRNA-17, miRNA-20a oraz miRNA-106a, a skutkiem jest aktywacja odpowiedzi zapalnej makrofagów ze wzmożoną syntezą cytokin prozapalnych [40].

Najnowsze doniesienia naukowe wskazują, że miRNA uczestniczą w regulowaniu wrodzonej odporności oraz w modulacji zjawiska immunotolerancji. miRNA146a, miRNA155 oraz miRNA203 należą do najważniejszych i najlepiej opisanych cząsteczek zaangażowanych w regulowanie transdukcji sygnału w odpowiedzi na działanie endotoksyny bakteryjnej. miRNA146a odpowiada za rozwój tolerancji makrofagów na bakteryjną endotoksynę, która jest indukowana przewlekłą stymulacją receptora TLR4. Podczas zakażeń bakteryjnych, lipopolisacharyd indukuje w makrofagach ekspresję miRNA146a, którego nadekspresję zaobserwowano w czasie rozwoju immunotolerancji w tych komórkach. miRNA146a oraz miRNA147 należą również do negatywnych regulatorów sygnalizacji indukowanej przez ligandy receptorów TLR [35]. Ponadto kilkukrotna stymulacja makrofagów bakteryjną endotoksyną prowadzi do nadekspresji miRNA9 i miRNA155 [15]. miRNA155 jest również negatywnym regulatorem sygnalizacji receptora TRL4 zachodzącej na szlaku MyD88-zależnym (razem z miRN146a hamuje fosforylację kinazy IRAK4) i TRIF (hamuje aktywację kinaz IKK i białka TBK1) podczas tolerancji endotoksyną. Ponadto miR203 przez obniżenie ekspresji białka adaptorowego MyD88 również reguluje odpowiedź makrofagów na aktywację TLR4 (ryc. 2) [37]. Natomiast badania przeprowadzone przez Zhanga i wsp. [39] na mysiej makrofagowej linii komórkowej RAW264.7 wskazują, że miRNA181b również odgrywa istotną rolę podczas tolerancji makrofagów. Pierwsza stymulacja makrofagów bakteryjną endotoksyną powoduje NF-κB-zależną nadekspresję miRNA181b, która utrzymuje się po dwukrotnej stymulacji endotoksyną, co jest skorelowane z obniżeniem ekspresji genu IL-6. miRNA181b przyłączając się do regionu 3’UTR genu IL-6 powoduje zahamowanie jego translacji, co przekłada się na obniżenie ekspresji IL-6 [39].

Ryc. 2.Transdukcja sygnału przekazywana od receptora TLR4 i jego negatywna regulacja podczas tolerancji bakteryjną endotoksyną [opracowanie autorskie]

Wpływ endotoksyny bakteryjnej na immunosupresję towarzyszącą wielu stanom chorobowym oraz potencjalne metody leczenia

Immunosupresja występuje w wielu chorobach zagrażających życiu, takich jak nowotwory czy sepsa. Tolerancja komórek układu odpornościowego na lipopolisacharyd bakteryjny w przypadku sepsy przyczynia się do powstawania trudności w leczeniu tych chorób, powodując wysoką śmiertelność wśród pacjentów [33].

Główną przyczyną rozwoju sepsy jest występowanie nieprawidłowego działania układu odpornościowego gospodarza, co przyczynia się do powstawania przedłużającego się stanu zapalnego o dużym stopniu nasilenia [3]. Pierwsza faza choroby charakteryzuje się aktywacją leukocytów w odpowiedzi na endotoksynę bakteryjną i pobudzeniem ich do aktywności prozapalnej. W drugiej fazie następuje immunosupresja, charakteryzująca się obniżeniem poziomu ekspresji cytokin prozapalnych, takich jak: TNF-α, IL-6, IL-1α, IL-1β i IL-12 oraz aktywacją cytokin przeciwzapalnych, takich jak: IL-10, TGF-β i IL-1RA [7]. W tym wypadku podawanie choremu antybiotyku spowodowałoby uwolnienie bakteryjnej endotoksyny z komórek bakteryjnych, co doprowadziłoby do pogorszenia stanu pacjentów. W celu zmniejszenia śmiertelności wśród pacjentów poszukuje się leków powodujących wyciszenie stanu zapalnego organizmu.

Badania skupiają się na szukaniu antagonistów TLR4, takich jak nietoksyczne pochodne lipiduA [9]. Dokładne poznanie mechanizmu aktywacji i struktury receptorów TLR oraz szlaków sygnałowych, które inicjuje ich aktywacja, dostarczy nowych możliwości interwencji leczniczej przez manipulację odpowiedzi immunologicznej. TLR są związane z rozpoczęciem reakcji odporności wrodzonej, hamowanie ich aktywności znajduje więc uzasadnienie w leczeniu chorób związanych z nadmierną odpowiedzią immunologiczną [8].

Bakteryjna endotoksyna będąca głównym ligandem TLR4 odgrywa podstawową rolę w procesie nowotworzenia, któremu towarzyszy stan zapalny. Jest również odpowiedzialny za aktywację jądrowego czynnika NF-κB odpowiedzialnego za aktywację transkrypcji genów cytokin prozapalnych. W związku z tym hamowanie wiązania bakteryjnej endotoksyny z TLR4 może zmniejszyć aktywację NF-κB hamując tym samym odpowiedź zapalną i powstawanie lub rozwój nowotworu. Przykładem może być rak okrężnicy rozwijający się u chorych z przewlekłym zapaleniem okrężnicy spowodowanym przez bakterie Gram-ujemne [22].

Nietoksyczne pochodne bakteryjnej endotoksyny, takie jak monopochodna lipidu A (MLPA), polimeryczna postać bakteryjnej endotoksyny (SP-LPS) są wykorzystywane w badaniach nad szczepionkami. MLPA podane wraz z bFGF (basic fibroblast growth factor) wykazuje przeciwnowotworowe działanie u myszy, natomiast SP-LPS podane z lekiem Paklitaksel (przedstawiciel przeciwnowotworowych związków z grupy taksanów) wykazuje antynowotworowe działanie poprzez indukcję apoptozy w komórkach docelowych [9].

Podsumowanie

W pracy zebrano najnowsze doniesienia naukowe dotyczące roli monocytów i makrofagów w powstawaniu zjawiska tolerancji w odpowiedzi na bakteryjną endotoksynę. Tolerancja indukowana endotoksynami jest niekorzystnym zjawiskiem rozwijającym się w komórkach mających zdolność do ekspresji i wydzielania cytokin prozapalnych. Ekspresja większości cytokin jest kontrolowana przez jądrowy czynnik transkrypcyjny NF-κB (p50/p65), a transdukcja sygnału indukowana bakteryjną endotoksyną powoduje zmiany w obrębie sekwencji regulatorowych, uniemożliwiając tworzenie heterodimeru p65/p50 przy kolejnej ekspozycji na bakteryjną endotoksynę. Inny mechanizm to regulowanie ekspresji cytokin przez miRNA, które obniża poziom transkryptu niektórych cytokin prozapalnych. Możliwość modulowania aktywności i zmiany właściwości monocytów/makrofagów może się przyczynić do opracowania nowoczesnych terapii mających na celu zahamowanie niechcianej odpowiedzi autoimmunologicznej czy immunologicznej.

Przypisy

• 1. Antosz H., Choroszyńska D.: Negatywna regulacja sygnalizacji receptorów Toll-podobnych. Postępy Hig. Med. Dośw., 2013; 67: 339-351
  Google Scholar
• 2. Arbibe L., Sansonetti P.J.: Epigenetic regulation of host response to LPS: causing tolerance while avoiding Toll Errancy. Cell Host Microbe, 2007; 1: 244-246
  Google Scholar
• 3. Aziz M., Jacob A., Wang P.: Revisiting caspases in sepsis. Cell Death Dis., 2014; 5: e1526
  Google Scholar
• 4. Bayarsaihan D.: Epigenetic mechanisms in inflammation. J. Dent. Res., 2011; 90: 9-17
  Google Scholar
• 5. Bhatt D., Ghosh S.: Regulation of the NF-κB-mediated transcription of inflammatory genes. Front. Immunol., 2014; 5: 71
  Google Scholar
• 6. Biswas S.K., Lopez-Collazo E.: Endotoxin tolerance: new mechanisms, molecules and clinical significance. Trends Immunol., 2009; 30: 475-487
  Google Scholar
• 7. Biswas S.K., Shalova I.N.: Endotoxin tolerance as a key mechanism for immunosuppression. INTECH Open Access Publisher, 2012, Chapter 2
  Google Scholar
• 8. Christmas P.: Toll-like receptors: sensors that detect infection. Nature Education, 2010; 3: 85-90
  Google Scholar
• 9. Fontana L., Pelosi E., Greco P., Racanicchi S., Testa U., Liuzzi F., Croce C.M., Brunetti E., Grignani F., Peschle C.: MicroRNAs 17-5p-20a- 106a control monocytopoiesis through AML1 targeting and M-CSF receptor upregulation. Nat. Cell Biol., 2007; 9: 775-787
  Google Scholar
• 10. Foster S.L., Hargreaves D.C., Medzhitov R.: Gene-specific control of inflammation by TLR-induced chromatin modifications. Nature, 2007; 447: 972-979
  Google Scholar
• 11. Futoma-Kołoch B., Godlewska U., Pędlowski M.: Lipopolisacharyd bakteryjny jako najnowszy obiekt badań nad sepsą. Laboratorium – Przegląd Ogólnopolski, 2014; 7/8: 37-41
  Google Scholar
• 12. Graff J.W., Dickson A.M., Clay G., McCaffrey A.P., Wilson M.E.: Identifying functional microRNAs in macrophages with polarized phenotypes. J. Biol. Chem., 2012; 287: 21816-21825
  Google Scholar
• 13. Grygorowicz M.A., Kozłowska E.: Udział receptorów TLR rozpoznających wzorce molekularne organizmów patogennych w modulowaniu aktywności regulatorowych limfocytów T CD4+ CD25+ FOXP3+. Post. Mikrobiol., 2011; 50: 141-154
  Google Scholar
• 14. Hao N.B., Lü M.H., Fan Y.H., Cao Y.L., Zhang Z.R., Yang S.M.: Macrophage in tumor microenvironments and the progression of tumors. Clin. Dev. Immunol., 2012; 2012: 948098
  Google Scholar
• 15. Hotchi J., Hoshiga M., Takeda Y., Yuki T., Fujisaka T., Ishihara T., Hanafusa T.: Plaque-stabilizing effect of angiotensin-converting enzyme inhibitor and/or angiotensin receptor blocker in a rabbit plaque model. J. Atheroscler. Thromb., 2013; 20: 257-266
  Google Scholar
• 16. Janssens S., Burns K., Tschopp J., Beyaert R.: Regulation of interleukin-1- and lipopolysaccharide-induced NF-κB activation by alternative splicing of MyD88. Curr. Biol., 2002; 12: 467-471
  Google Scholar
• 17. Krausgruber T., Blazek K., Smallie T., Alzabin S., Lockstone H., Sahgal N., Hussell T., Feldmann M., Udalova I.A.: IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat. Immunol., 2011; 12: 231-238
  Google Scholar
• 18. Kulczycka L., Sysa-Jędrzejowska A., Robak E.: Udział receptorów Toll-like w patogenezie wybranych chorób skóry. Postępy Hig. Med. Dośw., 2010; 64: 364-371
  Google Scholar
• 19. Lagrange B., Martin R.Z., Droin N., Aucagne R., Paggetti J., Largeot A., Itzykson R., Solary E., Delva L., Bastie J.N.: A role for miR-142- 3p in colony-stimulating factor 1-induced monocyte differentiation into macrophages. Biochim. Biophys. Acta, 2013; 1833: 1936-1946
  Google Scholar
• 20. Lawrence T., Natoli G.: Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nat. Rev. Immunol., 2011; 11: 750-761
  Google Scholar
• 21. Litvak V., Ramsey S.A., Rust A.G., Zak D.E., Kennedy K.A., Lampano A.E., Nykter M., Shmulevich I., Aderem A.: Function of C/EBPδ in a regulatory circuit that discriminates between transient and persistent TLR4-induced signals. Nat. Immunol., 2009; 10: 437-443
  Google Scholar
• 22. Liu J., Buckley J.M., Redmond H.P., Wang J.H.: ST2 negatively regulates TLR2 signaling, but is not required for bacterial lipoprotein-induced tolerance. J. Immunol., 2010; 184: 5802-5808
  Google Scholar
• 23. Liu L., Li Y.H., Niu Y.B., Sun Y., Guo Z.J., Li Q., Li C., Feng J., Cao S.S., Mei Q.B.: An apple oligogalactan prevents against inflammation and carcinogenesis by targeting LPS/TLR4/NF-κB pathway in a mouse model of colitis-associated colon cancer. Carcinogenesis, 2010; 31: 1822-1832
  Google Scholar
• 24. Lu M., Varley A.W., Mundorf R.S.: Persistently active microbial molecules prolong innate immune tolerance in vivo. PLoS Pathog., 2013; 9: e1003339
  Google Scholar
• 25. Majewska M., Szczepanik M.: Rola receptorów toll-podobnych (TLR) w odporności wrodzonej i nabytej oraz ich funkcja w regulacji odpowiedzi immunologicznej. Postępy Hig. Med. Dośw., 2006; 60: 52-63
  Google Scholar
• 26. Martinez F.O., Gordon S.: The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime. Rep., 2014; 6: 13
  Google Scholar
• 27. Nazimek K., Bryniarski K.: Aktywność biologiczna makrofagów w zdrowiu i chorobie. Postępy Hig. Med. Dośw.: 2012; 66: 507-520
  Google Scholar
• 28. Nazimek K, Filipczak-Bryniarska I., Bryniarski K.: Rola leków, egzosomów i cząsteczek miRNA w modulacji aktywności immunologicznej makrofagów. Postępy Hig. Med. Dośw., 2015; 69: 1114-1129
  Google Scholar
• 29. Obata Y., Furusawa Y., Hase K.: Epigenetic modifications of the immune system in health and disease. Immunol. Cell Biol., 2015; 9: 226-232
  Google Scholar
• 30. Ponomarev E.D., Veremeyko T., Weiner H.L.: MicroRNAs are universal regulators of differentiation, activation, and polarization of microglia and macrophages in normal and diseased CNS. Glia, 2013; 61: 91-103
  Google Scholar
• 31. Reyes R.E., Andrade A.A., Jimenez R.C., González C.R., Herrera M.O.: Mechanisms of O-antigen structural variation of bacterial lipopolysaccharide (LPS). INTECH Open Access Publisher, 2012, Chapter 3
  Google Scholar
• 32. Roberts L.M., Ledvina H.E., Tuladhar S., Rana D., Steele S.P., Sempowski G.D., Frelinger J.A.: Depletion of alveolar macrophages in CD11c diphtheria toxin receptor mice produces an inflammatory response. Immun. Inflamm. Dis., 2015; 3: 71-81
  Google Scholar
• 33. Salomao R., Brunialti M.K., Rapozo M.M., Baggio-Zappia G.L., Galanos C.H., Freudenberg M.: Bacterial sensing, cell signaling, and modulation of the immune response during sepsis. Shock, 2012; 38: 227-242
  Google Scholar
• 34. Smolarczyk R., Cichoń T., Jarosz M., Szala S.: HMGB1 – rola w progresji i terapii przeciwnowotworowej. Postępy Hig. Med. Dośw., 2012; 66: 913-920
  Google Scholar
• 35. Sun Y., Cai J., Ma F., Lu P., Huang H., Zhou J:. miR-155 mediates suppressive effect of progesterone on TLR3, TLR4-triggered immune response. Immunol. Lett., 2012; 146: 25-30
  Google Scholar
• 36. van’t Veer C., van den Pangaart P.S., van Zoelen M.A., de Kruif M., Birjmohun R.S., Stroes E.S., de Vos A.F., van der Poll T.: Induction of IRAK-M is associated with lipopolysaccharide tolerance in a human endotoxemia model. J. Immunol., 2007; 179: 7110-7120
  Google Scholar
• 37. Wei J., Huang X., Zhang Z., Jia W., Zhao Z., Zhang Y., Liu X., Xu G.: MyD88 as a target of microRNA-203 in regulation of lipopolysaccharide or Bacille Calmette-Guerin induced inflammatory response of macrophage RAW264.7 cells. Mol. Immunol., 2013; 55: 303-309
  Google Scholar
• 38. Wiśnik E., Koter-Michalak M.: Komórkowy szlak sygnalizacyjny zależny od jądrowego czynnika transkrypcyjnego NF-κB i jego zaburzenia w wybranych chorobach nowotworowych. Post. Biol. Kom., 2015; 42: 559-572
  Google Scholar
• 39. Zhang W., Shen X., Xie L., Chu M., Ma Y.: MicroRNA-181b regulates endotoxin tolerance by targeting IL-6 in macrophage RAW264.7 cells. J. Inflamm., 2015; 12: 18
  Google Scholar
• 40. Zhu D., Pan C., Li L., Bian Z., Lv Z., Shi L., Zhang J., Li D., Gu H., Zhang C.Y., Liu Y., Zen K.: MicroRNA-17/20a/106a modulate macrophage inflammatory responses through targeting signal-regulatory protein α. J. Allergy Clin. Immunol., 2013; 132: 426-436.e8
  Google Scholar

Pełna treść artykułu