Abstrakt

Od wielu lat są podejmowane próby opracowania skutecznych metod transformacji roślin leczniczych za pomocą Agrobacterium tumefaciens. Jest to bakteria glebowa mająca naturalną zdolność zakażania roślin w miejscach zranień, tworząc rakowate narośla. Jest to możliwe dzięki przenoszeniu fragmentu jej plazmidu Ti do komórek roślinnych i trwałej integracji z genomem roślinnym. Skuteczność transformacji roślin leczniczych zależy od wielu czynników, m.in. od szczepu Agrobacterium, metod oraz procedur transformacji i od gatunku rośliny, typu, wieku eksplantatu, a także warunków regeneracji. Głównym celem transformacji roślin jest zwiększenie zawartości naturalnie w nich występujących związków aktywnych biologicznie oraz produkcja biofarmaceutyków. Transformacja genetyczna roślin z udziałem bakterii z rodzaju Agrobacterium jest procesem złożonym, wymaga wnikliwej analizy ekspresji wprowadzonego transgenu i zachodzi jedynie wtedy, gdy komórka rośliny nabywa zdolność do regeneracji. W wielu przypadkach wydajne procesy regeneracji zaobserwowane u roślin leczniczych są nieefektywne po przeprowadzeniu procedur transformacji. Dotąd podjęto próby transformacji genetycznej z wykorzystaniem A. tumefaciens roślin leczniczych z rodzin: Apocynaceae, Araceae, Araliaceae, Asphodelaceae, Asteraceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Papaveraceae, Plantaginaceae, Scrophulariaceae oraz Solanaceae.

Wstęp

Surowce pochodzenia roślinnego były wykorzystywane przez człowieka w celach leczniczych od zarania dziejów. W dalszym ciągu rośliny są źródłem cennych surowców leczniczych stosowanych zarówno w medycynie tradycyjnej, jak i oficjalnej. Wciąż są odkrywane ich nowe właściwości i zastosowania. W niektórych przypadkach rośliny są jedynym źródłem substancji leczniczej, która nie może być zsyntetyzowana chemicznie.

Narzędzia nowoczesnej inżynierii genetycznej pozwalają na uzyskanie roślin leczniczych o zwiększonych zawartościach substancji biologicznie czynnych lub użycie tych, a także innych gatunków roślin, do produkcji rekombinowanych białek o znaczeniu medycznym. W tym celu wykorzystywana jest naturalna zdolność Gram-ujemnych bakterii glebowych z rodzaju Agrobacterium do transformacji roślin. A. tumefaciens powoduje powstawanie guzowatości szyjki korzeniowej roślin dwuliściennych [19]. W procesie tym, zwanym agroinfekcją, następuje przenoszenie do komórek roślin fragmentu bakteryjnego transferowego DNA, tzw. T-DNA (transferred – DNA), który jest częścią dużego (około 200 kpz) plazmidu Ti (tumor inducing). Kluczowymi, z punktu widzenia transformacji, elementami plazmidu są: region wirulencji vir, fragment T-DNA ograniczony z obu stron sekwencjami granicznymi oraz geny odpowiedzialne za katabolizm opin i przekazywanie plazmidu Ti między komórkami bakterii [17]. Opiny, to metabolity wytwarzane przez rakowate narośla roślin w wyniku ekspresji genów pochodzących od Agrobacterium i wbudowanych do ich genomu. Są nieprzyswajalne dla roślin, ale są metabolizowane i służą jako pokarm dla Agrobacterium.

Szczepy Agrobacterium są klasyfikowane ze względu na obecność genów syntezy – charakterystycznego, zwykle jednego rodzaju opiny (np. nopaliny w szczepie C58 lub oktopiny w szczepie LBA4404). Komercyjnie są dostępne tzw. „rozbrojone” wirulentne szczepy Agrobacterium tumefaciens (pozbawione sekwencji genów szlaku syntezy hormonów roślinnych oraz genów syntazy opin), które umożliwiają skuteczną transformację wielu gatunków roślin [9]. W pracy omówiono rośliny lecznicze, które transformowano z wykorzystaniem A. tumefaciens (tab. 1).

Aloes zwyczajny

Aloes zwyczajny (Aloe vera (L.) Burm. f.) jest sukulentem z rodziny Asphodelaceae, wykorzystywanym do produkcji różnorodnych produktów leczniczych i kosmetyków. Stwierdzono występowanie w nim ponad 200 związków chemicznych, z których około 75 wykazuje aktywność biologiczną. Liście aloesu mają działanie przeciwdrobnoustrojowe, immunomodulujące, antyoksydacyjne, hepatoprotekcyjne oraz przeciwnowotworowe [41]. Głównym ograniczeniem w jego wykorzystaniu jest to, że nie jest rośliną samopylną oraz wysoki stopień bezpłodności kwiatów męskich. Aloes najczęściej jest rozmna- żany wegetatywnie. Jednak ze względu na niewiele roślin potomnych stosuje się na coraz szerszą skalę metody mikropropagacji oraz transformacji genetycznych [53]. Mikropropagacja aloesu polega na izolowaniu eksplantów z komórek merystematycznych i stymulacji tworzenia zawiązków roślin za pomocą bezpośredniej organogenezy [20,33]. He i wsp. optymalizowali różnorodne parametry regeneracji i transformacji pokrewnego gatunku Aloe barbadensis Miller, m.in. przez wybór odpowiedniego eksplantatu, metody sterylizacji, różne szczepy Agrobacterium (EHA105 i C58C1) oraz warunki kokultury. Uzyskali odpowiednio 80 i 30% wydajności [21]. Natomiast Lowther i wsp. wyprodukowali w kalusowych kulturach aloesu zwyczajnego transformowanych metodą biolistyczną ludzki interferon-α2 (IFN-α2) [39]. Interferony-α tworzą pierwszą linię obrony organizmu człowieka i są wytwarzane w odpowiedzi na infekcję wywołaną różnorodnymi mikroorganizmami, zwłaszcza wirusami [3].

Begonia bulwiasta

Begonia bulwiasta (Begonia tuberhybrida Voss) jest byliną ozdobną z rodziny begoniowatych (Begoniaceae). Występuje w niej kukurbitacyna B oraz D [38]. Kukurbitacyna B działa przeciwzapalnie oraz zapobiegająco i leczniczo w hepatotoksyczności wywołanej przez czterochlorek węgla. Natomiast kukurbitacyna D wykazuje silne właściwości cytotoksyczne przeciwko wielu liniom komórkowym wywodzącym się z ludzkich nowotworów złośliwych [6].

Kiyokawa i wsp. transformowali trzy gatunki begonii: Begonia semperflorens Link et Otto, Begonia x hiemalis (Fotsch) cv. Schwabenland Red oraz Begonia tuberhybrida cv. Perfecta za pomocą A. tumefaciens LBA4404, zawierającego wektor z genami rol, pochodzącymi z pokrewnego gatunku A. rhizogenes i determinującymi intensywny rozwój tzw. korzeni włośnikowatych. Jedynie w przypadku begonii bulwiastej uzyskali transformanty z ekspresją pojedynczych genów rolA, B i C. Dojrzałe rośliny, mimo transformacji z użyciem A. tumefaciens, fenotypowo miały cechy roślin begonii transformowanych A. rhizogenes i znacznie różniły się od roślin nietransformowanych. Miały ponadto nieprawidłowe cechy morfologiczne, takie jak: karłowatość, pomarszczone liście i płatki lub zaburzone procesy rozwojowe i opóźnione kwitnienie [31].

Bylica roczna

Bylica roczna (Artemisia annua L.) z rodziny astrowatych (Asteraceae) zawiera artemizynę, która jest stosowana jako środek przeciwko Plasmodium spp., chociaż obserwuje się narastającą na nią oporność zarodźców malarii, zwłaszcza w Azji Południowo-Wschodniej [55,70]. Zawartość artemizyny w bylicy jest niewielka (0,01-1,4% suchej masy) i zależy od genotypu oraz warunków hodowli [1], natomiast produkcja tego związku metodami syntezy chemicznej okazała się mało wydajna i kosztowna. Głównym enzymem w szlaku biosyntezy artemizyny jest monooksygeneza cytochromu P450 (CYP71AV1), która uczestniczy aż w trzech przekształceniach związków pośrednich [58]. Shen i wsp. transformowali liście bylicy rocznej konstruktami zawierającymi geny monooksygenezy cytochromu P450 (CYP71AV1) i reduktazy cytochromu P450 za pomocą A. tumefaciens szczepu EHA105. Po 20 tygodniach kultury otrzymanych roślin transgenicznych, w których odnotowano dużą zawartość mRNA wprowadzonych genów cyp71av1 i cpr, stwierdzono zwiększoną zawartość artemizyny w porównaniu z roślinami kontrolnymi, maksymalnie o 38% [58].

Elfahmi i wsp. transformowali liście dwutygodniowych i dwumiesięcznych roślin bylicy rocznej trzema szczepami A. tumefaciens: AGL1, GV3101 i LBA4404. Transformacja z użyciem szczepu AGL1 okazała się najbardziej wydajna i wyniosła prawie 71%, podczas gdy dla pozostałych szczepów była na poziomie odpowiednio 49,25 i 45,45% [12].

Ponadto próbowano wykorzystać bylicę roczną do produkcji paklitakselu jako leku przeciwnowotworowego. Wprowadzono gen txs syntazy taksadienu z cisu (Taxus) i transformowano młode liście bylicy za pomocą A. tumefaciens szczepu EHA105. W otrzymanych roślinach transgenicznych, w których potwierdzono ekspresję transgenu, odnotowano zawartość taksadienu (który może zostać przekształcony metodami chemicznymi do paklitakselu) w ilości 4,4-129,7 µg/g suchej masy [35].

Katarantus różowy

Katarantus różowy (Catharanthus roseus (L.)  G. Don), krzew z rodziny toinowatych (Apocynaceae) [64], jest rośliną modelową wykorzystywaną do badań nad metabolitami wtórnymi [13]. Dotąd wyizolowano z niego ponad 130 związków chemicznych [66]. Niestety ilość uzyskiwanych leków przeciwnowotworowych winkrystyny i winblastyny w dzikich odmianach katarantusa różowego jest mała. Ponadto próby wyprodukowania ich w większej ilości w kulturach zawiesinowych i korzeni oraz metodami chemicznymi nie przyniosły oczekiwanych rezultatów [40,73]. Srivastava i wsp. przeprowadzili optymalizację warunków transformacji kalusów uzyskanych z liści katarantusa różowego z użyciem A. tumefaciens szczepu LBA4404. W 98% transformowanych regenerantów potwierdzili obecność wprowadzanych transgenów: uidA, glyI i nptII [64]. Wang i wsp. opracowali metodę regeneracji i transformacji katarantusa różowego z użyciem A. tumefaciens szczepu EHA105. Po transformacji hipokotyli konstruktami kodującymi gen dat – acetylotransferazy 4-O-diacetylowindoliny, kluczowego enzymu w biosyntezie alkaloidów katarantusa, uzyskano regeneranty ze zwiększoną zawartością windoliny będącej prekursorem winblastyny. Osiągnęli 11% wydajność regeneracji stransformowanych eksplantatów [69].

Kozieradka pospolita

Kozieradka pospolita (Trigonella foenum-graecum L.) jest rośliną jednoroczną z rodziny bobowatych (Fabaceae). Zawiera alkaloidy (m.in. karpinę, trigonelinę), saponiny (takie jak fenugrekina czy diosgenina) oraz flawonoidy [47]. Jest stosowana w dolegliwościach przewodu pokarmowego (np. przy zaparciach), chorobach nerek, zapaleniu oskrzeli, przewlekłym kaszlu, zmianach zapalnych na skórze. Obniża stężenie glukozy we krwi, działa antyokscydacyjnie oraz immunomodulująco [15,47]. Jest wykorzystywana do maskowania smaku leków, gdyż smakiem i zapachem przypomina syrop klonowy [15].

Khawar i wsp. opracowali optymalizację warunków transformacji kozieradki pospolitej transformowanych konstruktem zawierającym gen uidA z wykorzystaniem A. tumefaciens dzikiego szczepu A281. W zregenerowanych z hipokotyli, liścieni oraz korzeni kozieradki potwierdzono ekspresję β-glukuronidazy (GUS) [30].

Len zwyczajny

Len zwyczajny (Linum usitatissimum L.), należący do rodziny lnowatych (Linaceae), jest jedną z najstarszych roślin uprawnych, wykorzystywaną głównie w przemyśle tekstylnym, ale też do otrzymywania oleju, stosowanego jako pokost oraz w farmacji. Olej lniany ma właściwości przeciwzakrzepowe i obniżające ciśnienie tętnicze krwi. Spożywanie mielonych nasion lnu zmniejsza zawartość cholesterolu całkowitego i LDL (lipoproteiny o niskiej gęstości) we krwi. Len stosowany jest również w leczeniu hiperglikemii, zmniejsza ryzyko chorób układu krążenia oraz ma właściwości antyoksydacyjne [26].

Mierziak i wsp. podjęli próbę uzyskania transgenicznego lnu o zwiększonej zawartości flawonoidów, które są bardzo aktywnymi naturalnymi antyoksydantami. W tym celu wykorzystali konstrukt zawierający geny chs, chi i dfr pochodzące od Petunia hybryda do transformacji Linum usitatissimum var. linola z udziałem A. tumefaciens. Uzyskali również transgeniczne rośliny zawierające gen gt pochodzący od Solanum sogarandinum. W następnym etapie krzyżowali wspomniane rośliny pokolenia F2 i analizowali zawartość flawonoidów w łodygach i torebkach nasiennych po 6 miesiącach. Stwierdzili zwiększoną ilość flawonoidów w roślinach uzyskanych po skrzyżowaniu. Ponadto ekstrakty z nich uzyskane miały silniejsze właściwości antyoksydacyjne w porównaniu z roślinami rodzicielskimi i nietransgenicznymi [43].

Włókno lniane może mieć natomiast potencjalne zastosowanie jako materiał opatrunkowy oraz nośnik i stabilizator leków [59]. Szopa i wsp., w celu otrzymania włókien zbudowanych częściowo z polihydroksymaślanu, wprowadzili do genomu lnu za pomocą A. tumefaciens trzygenowy konstrukt zawierający cDNA pochodzące od Ralstonia eutropha i kodujące bakteryjne enzymy szlaku biosyntezy polihydroksymaślanu: reduktazę acetoacetylo-CoA, β-ketotiolazę oraz syntazę polihydroksyma- ślanu. Włókna pochodzące z transgenicznych roślin cechowały się większą wytrzymałością i sztywnością w porównaniu z roślinami kontrolnymi. Ponadto prawie nie indukowały agregacji płytek krwi, w związku z czym mogą być przydatne do produkcji materiałów biomedycznych, które wchodzą w kontakt z krwią [65].

Mak lekarski

Mak lekarski (Papaver somniferum L.) z rodziny makowatych (Papaveraceae) jest źródłem wielu różnych alkaloidów m.in. morfiny i kodeiny wytwarzanej w rurkach mlecznych rośliny. W przekształceniu kodeinonu w kodeinę oraz morfinonu w morfinę uczestniczy enzym COR [22]. Hosseini i wsp. wprowadzili gen kodujący reduktazę kodeinonu do A. tumefaciens szczepu C58 i transformowali nim liście z 6-tygodniowych roślin maku lekarskiego za pomocą technik agroinfiltracji metodą przejściowej transformacji w celu nadprodukcji reduktazy kodeinonu. Po raz pierwszy udało im się uzyskać ekspresję przejściową kodeiny i morfiny w liściach roślin (wcześniej sądzono, że jest to możliwe jedynie do osiągnięcia w rurkach mlecznych) [22].

Mięta pieprzowa

Mięta pieprzowa (Mentha piperita L.), bylina z rodziny jasnotowatych (Lamiaceae), zawiera olejki eteryczne stosowane w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym i kosmetycznym [49]. Prekursorem wszystkich olejków eterycznych mięty jest monoterpen limonen (4-izopropenylo-1-metylocykloheksen), związek szeroko rozpowszechniony w królestwie roślin. Syntaza limonenu, enzym przekształcający pirofosforan geranylu w limonen, jest czynnikiem determinującym zawartość olejków eterycznych. Krasnyanski i wsp. wprowadzili gen syntazy limonenu do A. tumefaciens GV3101 i transformowali nim międzywęźla mięty pieprzowej. W uzyskanych regenerantach potwierdzono obecność syntazy limonenu podobnie jak w przypadku bezpośredniej transformacji protoplastów mięty pieprzowej z zastosowaniem PEG (glikolu polietylenowego) [32].

Naparstnica purpurowa (Digitalis purpurea L.) jest rozpowszechnioną rośliną ozdobną z rodziny babkowatych (Plantaginaceae), uprawianą również w celu pozyskiwania surowców leczniczych. Zawiera glikozydy nasercowe digitoksynę i digoksynę [2], stosowane przede wszystkim w leczeniu niewydolności krążenia [48,57]. Ponadto stwierdzono, że są one skuteczne przeciwko pewnym typom nowotworów [42,71]. Niestety zawartość glikozydów w naparstnicy purpurowej jest bardzo mała, a ich synteza chemiczna jest skomplikowana [48]. Stąd są podejmowane próby wykorzystania modyfikacji genetycznych w celu zwiększenia skali ich produkcji. Li i wsp. użyli fragmenty liści z 6-8-tygodniowych roślin naparstnicy purpurowej do transformacji z udzia- łem A. tumefaciens szczepów GV2260 i GV3101. Wektory binarne użyte do transformacji Agrobacterium zawierały gen reporterowy β-glukuronidazy w celu łatwiejszej wizualizacji roślin transgenicznych; wydajność transformacji wyniosła 52,2-60%. Prace nad optymalizacją warunków regeneracji i transformacji naparstnicy miały na celu potencjalne jej wykorzystanie jako platformy do nadprodukcji biologicznie aktywnych substancji leczniczych: digitoksyny, digoksyny i digoksygeniny [36].

Naparstnica purpurowa

Pokrzyk wilcza jagoda

Pokrzyk wilcza jagoda (Atropa belladonna L.), bylina z rodziny psiankowatych (Solanaceae), jest ważną rośliną leczniczą uprawianą w celu pozyskiwania atropiny i skopolaminy (będących znanymi antagonistami receptorów muskarynowych). Jest wykorzystywana do badań nad szlakami biosyntezy alkaloidów. Wyciągi z roślin stosuje się w okulistyce, w stanach zapalnych, chorobie wrzodowej, w przypadku reakcji histaminowej oraz bólu głowy [52,54]. Jest składnikiem leków homeopatycznych [54].

Song i wsp. opracowali protokół wydajnej transformacji pokrzyku za pomocą A. tumefaciens szczepów LBA4404, GV3101 oraz EHA105. W końcowym efekcie ponad 80% transformowanych hipokotyli zregenerowało transgeniczne rośliny w ciągu 2-3 miesięcy [62].

Remania kleista

Remania kleista (Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Steud) należy do rodziny trędownikowatych (Scrophulariaceae) [37]. Zawiera resweratrol, związki z grupy irydoidów (katalpol i dihydrokatalpol) oraz flawonoidy [37,56]. Resweratrol jest silnym antyoksydantem występującym także w dużych ilościach w skórkach winogron [56,67]. Wykazano, że ma właściwości neuro- i kardioprotekcyjne, zmniejszające ryzyko powstawania nowotworów, opóźniające procesy starzenia oraz przeciwgrzybicze [5,23,75]. Korzeń remanii kleistej ma właściwości przeciwgorączkowe, przeciwzakrzepowe, zmniejszające stężenie glukozy we krwi, stymulujące aktywność osteoblastów i hamujące resorpcję kości przez osteoklasty [37].

Ghimire i wsp. wykorzystali A. tumefaciens szczepu LBA4404 do transformacji remanii kleistej konstruktami zawierającymi gen syntetazy resweratrolu. Uzyskane rośliny transgeniczne miały znacząco więcej resweratrolu w liściach w porównaniu z roślinami kontrolnymi oraz wykazywały silniejsze właściwości antyoksydacyjne i mikrobójcze [18].

Rumian rzymski

Rumian rzymski (rumian szlachetny, Anthemis nobilis L.) jest popularną byliną z rodziny astrowatych (Asteraceae). Substancją czynną jest niebieski olejek eteryczny zawierający chamazulen, azulen (mniej niż w rumianku pospolitym Matricaria chamomilla), pinokarwon, farnezen, estry kwasów, flawonoidy (glikozydy kumarynowe, apigenina), poliacetyleny, kwasy organiczne, trójterpeny, sole mineralne, węglowodany, sterole [63].

Olejek jest szeroko stosowany w lecznictwie w związku z jego właściwościami przeciwzapalnymi, antybakteryjnymi, rozkurczającymi, cytotoksycznymi, sedatywnymi. Podawany zewnętrznie łagodzi podrażnienia i oparzenia skóry oraz objawy ukąszeń owadów. W kosmetyce jest substancją stosowaną przeciw wypryskom skórnym oraz jako składnik rozjaśniających i przeciwłupieżowych szamponów do włosów przetłuszczających się [25,63].

Jaziri i wsp. podjęli próby transformacji rumianu rzymskiego z użyciem A. tumefaciens szczepów C58 i T37. Analiza poszczególnych tkanek i organów transformowanych i zregenerowanych roślin wykazała podobną zawartość olejków eterycznych w porównaniu z roślinami kontrolnymi (nietransformowanymi) [25].

Rzęsa drobna

Rzęsa drobna (Lemna minor L.) jest rośliną wodną nale- żącą do rodziny obrazkowatych (Araceae). Wykazuje właściwości zmniejszające wrażliwość organizmu człowieka na działanie alergenów. Jest stosowana w leczeniu pokrzywki i obrzęków (zwłaszcza o podłożu uczuleniowym), podagry, infekcji górnych dróg oddechowych, chorób wątroby i tarczycy, jako środek przeciwgorączkowy oraz zewnętrznie przy przewlekłych owrzodzeniach i czyrakach [68]. Chhabra i wsp. opracowali protokół transformacji rzęsy z udziałem A. tumefaciens szczepu EHA105. Udało im się uzyskać rośliny transgeniczne z prawie 4% wydajnością, w czasie 11-13 tygodni [8].

Szałwia czerwona

Szałwia czerwona (Salvia miltiorrhiza Bunge) jest byliną z rodziny jasnotowatych (Lamiaceae) [11]. W korzeniu zawiera dwie grupy związków biologicznie aktywnych: pochodne kwasu kawowego i tanszinony. Jest stosowana w leczeniu schorzeń sercowo-naczyniowych, naczyń mózgowych, hiperlipidemii i w ostrym udarze niedokrwiennym [74]. Ponadto jej metabolity wtórne wykazują aktywność antywirusową, antynowotworową, przeciwzakrzepową oraz antyoksydacyjną [27]. Yan i wsp. opracowali prosty i skuteczny sposób transformacji szałwii czerwonej za pomocą A. tumefaciens szczepu EHA105. W badaniach testowano konstrukty z wprowadzonym genem reporterowym uidA i markerowym (selekcyjnym) nptII i uzyskano pierwsze potwierdzone transformanty szałwii czerwonej z 70% wydajnością. Opracowany przez nich protokół transformacji będzie mógł być wykorzystany do produkcji roślin o zwiększonej zawartości związków biologicznie czynnych [72].

Witania ospała

Witania ospała (Withania somnifera (L.) Dunal), roślina z rodziny psiankowatych (Solanaceae), zawiera ważne z medycznego punktu widzenia witanozydy i witanolidy występujące w korzeniach i liściach [44,60]. Wykazuje właściwości przeciwzapalne, antyoksydacyjne, immunomodulujące i przeciwnowotworowe [4,24].

Pandey i wsp. za pomocą A. tumefaciens szczepu LBA4404 transformowali fragmenty liści witanii ospałej i uzyskali transgeniczne rośliny z wydajnością 1,67%. Nie udało się jednak uzyskać regenerantów z użyciem szczepu A. tumefaciens EHA101 [45]. Sivanandhan i wsp. użyli A. tumefaciens szczepu LBA4404 do transformacji fragmentów łodyg zawierających międzywęźla i osiągnęli 10% wydajność transformacji. Stwierdzili, że zawartość witanolidów w pokoleniu T0 i T1 roślin transgenicznych była minimalnie większa w porównaniu z roślinami kontrolnymi [61].

Żeń-szeń amerykański

Żeń-szeń amerykański (Panax quinquefolium L.) jest wolno rosnącą byliną z rodziny araliowatych (Araliaceae), uprawianą ze względu na zawartość leczniczych składników w korzeniach [28]. Zawiera ginsenozydy, związki z grupy saponin triterpenowych. W różnych częściach rośliny stwierdzono występowanie ponad 60 ginsenozydów. Żeń-szeń wykazuje właściwości przeciwzapalne, antyoksydacyjne, immunostymulujące, hamujące rozwój nowotworów. Wpływa na układ krążenia, nerwowy, wydzielania wewnętrznego i odpornościowy. Korzystnie działa w chorobach degeneracyjnych układu nerwowego, działa antyarytmicznie, obniża ciśnienie tętnicze oraz zmniejsza zawartość glukozy we krwi [51]. Straty w uprawie wynikają z długiego okresu wzrostu i dużej wrażliwości roślin na infekcje grzybicze [28]. W celu zwiększenia oporności na infekcje grzybicze transformowano rośliny transgenami kodującymi chitynazę [50]. Chen i wsp. transformowali 2-3-tygodniowe epikotyle żeń-szenia amerykańskiego z zastosowaniem A. tumefaciens szczepu LBA4404 zawierającego wektor z genem chitynazy ryżowej. Udało im się osiągnąć 90% wydajność transformacji [7].

Żółwik nagi

Żółwik nagi (Chelone glabra L.) jest rośliną zaliczaną do rodziny babkowatych (Plantaginaceae) [2], zawiera glikozydy irydoidowe oraz aukubinę. Działa przeciwzapalnie, przeciwwirusowo, przeciwmalarycznie, przeciwgorączkowo, przeczyszczająco i przeciwnowotworowo, zwalcza robaki pasożytnicze [14,42,46]. Gao i wsp. transformowali fragmenty liści z użyciem A. tumefaciens szczepów GV2260 i GV3101. Uzyskali i wydajność transformacji na poziomie 2-8% [16].

Żyworódka

Żyworódka (Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers. jest sukulentem liściowym z rodziny gruboszowatych (Crassulaceae), który wytwarza aseksualnie charakterystyczne rozmnóżki na zakończeniach nerwów liści. Znalazła zastosowanie w medycynie m.in. jako: środek przeciwbólowy, przeciwzapalny, uspokajający i antyoksydacyjny. Stosowana w leczeniu chorób nowotworowych, wirusowych, bakteryjnych i alergicznych [10].Jung i wsp. transformowali młode liście i rozmnóżki za pomocą A. tumefaciens szczepu LBA4404 zawierającego wektor z genem zrekombinowanego przeciwciała 3D8 scFv [29]. To przeciwciało wykazuje aktywność DNA-zy w jądrze komórkowym hamując replikację DNA i transkrypcję oraz aktywność RNA-zy w cytoplazmie hamując translację bia- łek i w konsekwencji zapobiega namnażaniu wirusów DNA [34]. Osiągnęli oni wydajność transformacji na poziomie 77-84% [29].

Podsumowanie

Rośliny lecznicze, będące źródłem wielu związków chemicznych, są cenione nie tylko w medycynie. Z farmaceutycznego punktu widzenia, istotnym wydaje się wykorzystanie roślin leczniczych do badań nad produkcją biologicznie aktywnych metabolitów wtórnych. Wykorzystywane są m.in. do leczenia schorzeń kardiologicznych, dermatologicznych, ginekologicznych, nowotworowych, układu pokarmowego, oddechowego, wydalniczego oraz zaburzeń metabolicznych. Wykazują właściwości przeciwdrobnoustrojowe i antyoksydacyjne.

Agrobacterium tumefaciens jest przydatnym i skutecznym narzędziem inżynierii genetycznej, umożliwiającym uzyskanie z roślin większych ilości substancji leczniczych oraz produkcję nowych rekombinowanych związków biologicznie aktywnych. Transformacja roślin leczniczych, z których wiele pochodzi z różnych stref klimatycznych, nadal jest wielkim wyzwaniem. Wiele z nich jest oporne na infekcje Agrobacterium tumefaciens oraz często napotyka się trudności z regeneracją transformowanych eksplantatów. W związku z tym wydajność transformacji jest najczęściej mała, ponadto częstym problemem jest mała zawartość wytwarzanych w nich substancji biologicznie czynnych. Również ekspresja wprowadzanych transgenów nie jest jednakowa we wszystkich częściach rośliny i może wykazywać tendencje do spadku z upływem czasu. Nadal są prowadzone intensywne prace nad optymalizacją procesów regeneracji i transformacji roślin leczniczych oraz zwiększoną i stabilną ekspresją heterologicznych białek.

Przypisy

• 1. Abdin M.Z., Israr M., Rehman R.U., Jain S.K.: Artemisinin, a novelantimalarial drug: biochemical and molecular approaches forenhanced production. Planta Med., 2003; 69: 289-299
  Google Scholar
• 2. Albach D.C., Meudt H.M., Oxelman B.: Piecing together the „new“Plantaginaceae. Am. J. Bot., 2005; 92: 297-315
  Google Scholar
• 3. Bandurska K., Król I., Myga-Nowak M.: Interferony: między strukturąa funkcją. Postępy Hig. Med. Dośw., 2014; 68: 428-440
  Google Scholar
• 4. Bhattacharya A., Ramanathan M., Ghosal S., Bhattacharya S.K.:Effect of Withania somnifera glycowithanolides on iron-induced hepatotoxicityin rats. Phytother. Res., 2000; 14: 568-570
  Google Scholar
• 5. Cal C., Garban H., Jazirehi A., Yeh C., Mizutani Y., Bonavida B.: Resveratroland cancer: chemoprevention, apoptosis, and chemo-immunosensitizingactivities. Curr. Med. Chem. Anti-Canc. Agents., 2003; 3: 77-93
  Google Scholar
• 6. Chen J.C., Chiu M.H., Nie R.L., Cordell G.A., Qiu S.X.: Cucurbitacinsand cucurbitane glycosides: structures and biological activities. Nat.Prod. Rep., 2005; 22: 386-399
  Google Scholar
• 7. Chen W.P., Punja Z.K.: Agrobacterium-mediated transformationof American ginseng with a rice chitinase gene. Plant. Cell. Rep.,2002; 20: 1039-1045
  Google Scholar
• 8. Chhabra G., Chaudhary D., Sainger M., Jaiwal P.K.: Genetic transformationof Indian isolate of Lemna minor mediated by Agrobacteriumtumefaciens and recovery of transgenic plants. Physiol. Mol.Biol. Plants., 2011; 17: 129-136
  Google Scholar
• 9. Christie P.J., Gordon J.E.: The Agrobacterium Ti plasmids. Microbiol.Spectr., 2014; 2: PLAS-0010-2013
  Google Scholar
• 10. Cruz E.A., Reuter S., Martin H., Dehzad N., Muzitano M.F., Costa S.S., Rossi-Bergmann B., Buhl R., Stassen M., Taube C.: Kalanchoepinnata inhibits mast cell activation and prevents allergic airwaydisease. Phytomedicine, 2012; 19: 115-121
  Google Scholar
• 11. Dreger M., Krajewska-Patan A., Górska-Paukszta M., Pieszak M.,Buchwald W., Mikołajczak P.: Production of the secondary metabolitesin Salvia miltiorrhiza in vitro cultures. Herb. Polon., 2010; 56: 78-90
  Google Scholar
• 12. Elfahmi S.S., Suhandono S., Chahyadi A.: Optimization of genetictransformation of Artemisia annua L. using Agrobacterium for artemisininproduction. Pharmacogn. Mag., 2014; 10: S176-S180
  Google Scholar
• 13. Facchini P.J., De Luca V.: Opium poppy and Madagascar periwinkle:model non-model systems to investigate alkaloid biosynthesisin plants. Plant. J., 2008; 54: 763-784
  Google Scholar
• 14. Franzyk H., Olsen C.E., Jensen S.R.: Dopaol 2-keto- and 2,3-diketoglycosidesfrom Chelone obliqua. J. Nat. Prod., 2004; 67: 1052-1054
  Google Scholar
• 15. Gala B.V., Gujar V.: Product development, biochemical, anti-microbialand organoleptic analysis on (Trigonella foenum-graecum) fenugreekseeds and leaves. Plant Sciences Feed, 2014; 4: 15-18
  Google Scholar
• 16. Gao Z., Li Y., Chen J., Chen Z., Cui M.L.: A rapid and stable Agrobacterium-mediatedtransformation method of a medicinal plantChelone glabra L. App. Biochem. Biotechnol., 2015; 175: 2390-2398
  Google Scholar
• 17. Gelvin S. B.: Agrobacterium in the genomics age. Plant. Physiol.,2009; 150: 1665-1676
  Google Scholar
• 18. Ghimire B.K., Lim J.D., Yu C.Y.: Biological activity of Rehmanniaglutinosa transformed with resveratrol synthase genes. W: Transgenicplants – advances and limitations, red.: Yelda Ozden Çiftçi.InTech, 2012, 161-172
  Google Scholar
• 19. Gohlke J., Deeken R.: Plant responses to Agrobacterium tumefaciensand crown gall development. Front. Plant. Sci., 2014; 5: 1-11
  Google Scholar
• 20. Hashem Abadi D., Kaviani B.: In vitro proliferation of an importantmedicinal plant aloe – a method for rapid production. Aust. J.Crop. Sci., 2010; 4: 216-222
  Google Scholar
• 21. He C., Zhang J., Chen J., Ye X., Du L., Dong Y., Zhao H.: Genetictransformation of Aloe barbadensis Miller by Agrobacterium tumefaciens.J. Genet. Genomics., 2007; 34: 1053-1060
  Google Scholar
• 22. Hosseini B., Shahriari-Ahmadi F., Hashemi H., Marashi M.H.,Mohseniazar M., Farokhzad A., Sabokbari M.: Transient expressionof cor gene in Papaver somniferum. BioImpacts, 2011; 1: 229-235
  Google Scholar
• 23. Ignatowicz E., Baer-Dubowska W.: Resveratrol, a natural chemopreventiveagent against degenerative diseases. Pol. J. Pharmacol.,2001; 53: 557-569
  Google Scholar
• 24. Jayaprakasam B., Nair M.G.: Cyclooxygenase-2 enzyme inhibitorywithanolides from Withania somnifera leaves. Tetrahedron.,2003; 59: 841-849
  Google Scholar
• 25. Jaziri M., Fauconnier M.L., Guo Y.W., Marlier M., Vanhaelen M.:Genetic transformation of Anthemis nobilis L. (Roman chamomile).Biotechnol. Agricult. Forest., 1999; 45: 47-54
  Google Scholar
• 26. Jhala A., Hall L.: Flax (Linum usitatissimum L.): current uses andfuture applications. Aust. J. Bas. App. Sci., 2010; 4: 4304-4312
  Google Scholar
• 27. Jiang R.W., Lau K.M., Hon P.M., Mark T.C., Woo K.S., Fung K.P.:Chemistry and biological activities of caffeic acid derivatives fromSalvia miltiorrhiza. Curr. Med. Chem., 2005; 12: 237-246
  Google Scholar
• 28. Jiao X.L., Bi W., Li M., Luo Y., Gao W.W.: Dynamic response ofginsenosides in American ginseng to root fungal pathogens. PlantSoil, 2011; 339: 317-327
  Google Scholar
• 29. Jung Y., Rhee Y., Auh C.K., Shim H., Choi J.J., Kwon S.T., Yang J.S.,Kim D., Kwon M.H., Kim Y.S., Lee S.: Production of recombinant singlechain antibodies (scFv) in vegetatively reproductive Kalanchoe pinnataby in planta transformation. Plant. Cell. Rep., 2009; 28: 1593-1602
  Google Scholar
• 30. Khawar K.M., Gulbitti-Onarici S., Çöçü S., Erisen S., Sancak C.,Özcan S.: In vitro crown galls induced by Agrobacterium tumefaciensstrain A281 (pTiBo542) in Trigonella foenum-graecum. Biol. Plant.,2004; 48: 441-444
  Google Scholar
• 31. Kiyokawa S., Kikuchi Y., Kamada H., Harada H.: Genetic transformationof Begonia tuberhybrida by Ri rol genes. Plant Cell. Rep.,1996; 15: 606-609
  Google Scholar
• 32. Krasnyanski S., May R.A., Loskutov A., Ball T.M., Sink K.C.: Transformationof the limonene synthase gene into peppermint (Menthapiperita L.) and preliminary studies on the essential oil profiles ofsingle transgenic plants. Theor. Appl. Genet., 1999; 99: 676-682
  Google Scholar
• 33. Kumar M., Singh S., Singh S.: In vitro morphogenesis of a medicinalplant Aloe vera L. Asian J. Plant. Sci. Res., 2011; 1: 31-40
  Google Scholar
• 34. Lee G., Yu J., Cho S., Byun S.J., Kim D.H., Lee T.K., Kwon M.H.,Lee S.: A nucleic-acid hydrolyzing single chain antibody confersresistance to DNA virus infection in HeLa cells and C57BL/6 Mice.PLOS Pathog., 2014; 10: e1004208
  Google Scholar
• 35. Li M., Jiang F., Yu X., Miao Z.: Engineering isoprenoid biosynthesisin Artemisia annua L. for the production of taxadiene: a kayintermediate of taxol. Biomed. Res. Int., 2015; 2015: 504932
  Google Scholar
• 36. Li Y., Gao Z., Piao C., Lu K., Wang Z., Cui M.L.: A stable and efficientAgrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation ofthe medicinal plant Digitalis purpurea L. Appl. Biochem. Biotechnol.,2014; 172: 1807-1817
  Google Scholar
• 37. Lim D.W., Kim Y.T.: Dried root of Rehmannia glutinosa preventsbone loss in ovariectomized rats. Molecules, 2013; 18: 5804-5813
  Google Scholar
• 38. Lim T.K.: Begonia x tuberhybrida. W: Edible medicinal and non–medicinal plants. Vol. 7 Flowers. Springer Netherlands 2014, 556-558
  Google Scholar
• 39. Lowther W., Lorick K., Lawrence S.D., Yeow WS.: Expression ofbiologically active human interferon alpha 2 in Aloe vera. Transgenic.Res., 2012; 21: 1349-1357
  Google Scholar
• 40. Magnotta M., Murata J., Chen J., De Luca V.: Expression of deacetylvindoline-4-O-acetyltransferasein Catharanthus roseus hairyroots. Phytochemistry, 2007; 68: 1922-1931
  Google Scholar
• 41. Manvitha K., Bidya B.: Aloe vera: a wonder plant its history, cultivationand medicinal uses. J. Pharmacognosy Phytochem., 2014;2: 85-88
  Google Scholar
• 42. Menger L., Vacchelli E., Kepp O., Eggermont A., Tartour E., ZitvogelL., Kroemer G., Galluzzi L.: Trial watch: Cardiac glycosides andcancer therapy. Oncoimmunology, 2013; 2: e23082
  Google Scholar
• 43. Mierziak J., Wojtasik W., Kostyn K., Czuj T., Szopa J., Kulma A.:Crossbreeding of transgenic flax plants overproducing flavonoidsand glucosyltransferase results in progeny with improved antifungaland antioxidative properties. Mol. Breed., 2014; 34: 1917-1932
  Google Scholar
• 44. Mirjalili M.H., Fakhr-Tabatabaei S.M., Bonfill M., Alizadeh H.,Cusido R.M., Ghassempour A., Palazon J.: Morphology and withanolideproduction of Withania coagulans hairy root cultures. Eng.Life. Sci., 2009; 9: 197-204
  Google Scholar
• 45. Pandey V., Misra P., Chaturvedi P., Mishra M.K., Trivedi P.K., TuliR.: Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Withaniasomnifera (L.) Dunal: an important medical plant. Plant Cell. Rep.,2010; 29: 133-141
  Google Scholar
• 46. Park K.S., Chang I.M.: Anti-inflammatory activity of aucubin byinhibition of tumor necrosis factor-α production in RAW 264.7 cells.Planta Med., 2004; 70: 778-779
  Google Scholar
• 47. Patil S., Jain G.: Holistic approach of Trigonella foenum-graecumin phytochemistry and pharmacology – a review. Curr. Trends Technol.Sci. 2014; 3: 34-48
  Google Scholar
• 48. Pérez-Bermúdez P., García A.A., Tuñón I., Gavidia I.: Digitalispurpurea P5βR2, encoding steroid 5β-reductase, is a novel defense–related gene involved in cardenolide biosynthesis. New Phytol.,2010; 185: 687-700
  Google Scholar
• 49. Pramila D.M., Xavier R., Marimuthu K., Kathiresan S., Khoo M.L., Senthilkumar M., Sathya K., Sreeramanan S.: Phytochemical analysisand antimicrobial potential of methanolic leaf extract of peppermint(Mentha piperita: Lamiaceae). J. Med. Plant. Res., 2012; 6: 331-335
  Google Scholar
• 50. Punja Z.K.: Genetic engineering of plants to enhance resistanceto fungal pathogens – a review of progress and future prospects.Can. J. Plant. Pathol., 2001; 23: 216-235
  Google Scholar
• 51. Qi L.W., Wang C.Z., Yuan C.S.: Ginsenosides from American ginseng:chemical and pharmacological diversity. Phytochemistry, 2011;72: 689-699
  Google Scholar
• 52. Rajput H.: Effects of Atropa belladonna as an anti-cholinergic.Nat. Prod. Chem. Res., 2013; 1: 104
  Google Scholar
• 53. Reynolds T.: Aloes: the genus Aloe. CRC Press, Boca Raton 2004
  Google Scholar
• 54. Rita P., Animesh D.K.: An updated overview on Atropa belladonnaL. Int. Res. J. Pharm., 2011; 2: 11-17
  Google Scholar
• 55. Ro D.K., Paradise E.M., Ouellet M., Fisher K.J., Newman K.L.,Ndungu J.M., Ho K.A., Eachus R.A., Ham T.S., Kirby J., Chang M.C.,Withers S.T., Shiba Y., Sarpong R., Keasling J.D.: Production of theantimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast.Nature, 2006; 440: 940-943
  Google Scholar
• 56. Robb E.L., Page M.M., Wiens B.E., Stuart J.A.: Molecular mechanismsof oxidative stress resistance induced by resveratrol: specificand progressive induction of MnSOD. Biochem. Biophys. Res. Commun.,2008; 367: 406-412
  Google Scholar
• 57. Sharma A., Purkait B.: Identification of medicinally active ingredientin ultradiluted Digitalis purpurea: fluorescence spectroscopicand cyclic-voltammetric study. J. Anal. Methods Chem., 2012;2012: 109058
  Google Scholar
• 58. Shen Q., Chen Y.F., Wang T., Wu S.Y., Lu X., Zhang L., Zhang F.Y,Jiang W.M., Wang G.F., Tang K.X.: Overexpression of the cytochromeP450 monooxygenase (cyp71av1) and cytochrome P450 reductase(cpr) genes increased artemisinin content in Artemisia annua (Asteraceae).Genet. Mol. Res., 2012; 11: 3298-3309
  Google Scholar
• 59. Shim Y.Y., Reaney M.J.: Kinetic interactions between cyclolinopeptidesand immobilized human serum albumin by surface plasmonresonance. J. Agric. Food Chem., 2015; 63: 1099-1106
  Google Scholar
• 60. Sivanandhan G., Arun M., Mayavan S., Rajesh M., Mariashibu T.S.,Manickavasagam M., Selvaraj N., Ganapathi A.: Chitosan enhanceswithanolides production in adventitious root cultures of Withaniasomnifera (L.) Dunal. Ind. Crop. Prod., 2012; 37: 124-129
  Google Scholar
• 61. Sivanandhan G., Kapil Dev G., Theboral J., Selvaraj N., GanapathiA., Manickavasagam M.: Sonication, vacuum infiltration andthiol compounds enhance the Agrobacterium-mediated transformationfrequency of Withania somnifera (L.) Dunal. PLoS One, 2015;10: e0124693
  Google Scholar
• 62. Song G., Walworth A.: Agrobacterium tumefaciens-mediated transformationof Atropa belladonna. Plant Cell. Tiss. Organ. Cult., 2013;115: 107-113
  Google Scholar
• 63. Srivastava J.K., Shankar E., Gupta S.: Chamomile: a herbal medicineof the past with bright future. Mol. Med. Rep., 2010; 3: 895-901
  Google Scholar
• 64. Srivastava T., Das S., Sopory S.K., Srivastava P.S.: A reliable protocolfor transformation of Catharanthus roseus through Agrobacteriumtumefaciens. Physiol. Mol. Biol. Plants, 2009; 15: 93-98
  Google Scholar
• 65. Szopa J., Wróbel-Kwiatkowska M., Kulma A., Zuk M., Skórkowska-TelichowskaK., Dymińska L., Mączka M., Hanuza J., Zebrowski J.,Preisner M.: Chemical composition and molecular structure of fibersfrom transgenic flax producing polyhydroxybutyrate, and mechanicalproperties and platelet aggregation of composite materialscontaining these fibers. Compos. Sci. Technol., 2009; 69: 2438-2446
  Google Scholar
• 66. van Der Heijden R., Jacobs D.I., Snoeijer W., Hallard D., VerpoorteR.: The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology.Curr. Med. Chem., 2004; 11: 607-628
  Google Scholar
• 67. Vincenzi S., Tomasi D., Gaiotti F, Lovat L., Giacosa S., Torchio F.,Rio Segade S., Rolle L.: Comparative study of the resveratrol contentof twenty-one italian red grape varieties. S. Afr. J. Enol. Vitic.,2013; 34: 30-35
  Google Scholar
• 68. Vladimirova I.N., Georgiyants V.A.: Biologically active compoundsfrom Lemna minor S. G. Gray. Pharm. Chem. J., 2014; 47: 599-601
  Google Scholar
• 69. Wang Q., Xing S., Pan Q., Yuan F., Zhao J., Tian Y., Chen Y., WangG., Tang K.: Development of efficient Catharanthus roseus regenerationand transformation system using Agrobacterium tumefaciens andhypocotyls as explants. BMC Biotechnol., 2012; 12: 34
  Google Scholar
• 70. WHO Malaria Policy Advisory Committee and Secretariat.: Malariapolicy advisory committee to the WHO: conclusions and recommendationsof eighth biannual meeting (September 2015). Malar.J., 2016; 15: 117
  Google Scholar
• 71. Wu B., Li Y., Yan H., Ma Y., Luo H., Yuan L., Chen S. Lu S.: Comprehensivetranscriptome analysis reveals novel genes involved incardiac glycoside biosynthesis and mlncRNAs associated with secondarymetabolism and stress response in Digitalis purpurea. BMCGenomics, 2012; 13: 15
  Google Scholar
• 72. Yan Y., Wang Z.: Genetic transformation of the medicinal plantSalvia miltiorrhiza by Agrobacterium tumefaciens-mediated method.Plant Cell. Tiss. Organ. Cult., 2007; 88: 175-184
  Google Scholar
• 73. Yang L., Stöckigt J.: Trends for diverse production strategies ofplant medicinal alkaloids. Nat. Prod. Rep., 2010; 27:1469-1479
  Google Scholar
• 74. Zhou L., Zuo Z., Chow M.S.: Danshen: an overview of its chemistry,pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use. J. Clin.Pharmacol., 2005; 45: 1345-1359
  Google Scholar
• 75. Zhuang H., Kim Y.S., Koehler R.C., Dore S.: Potential mechanismby which resveratrol, a red wine constituent, protects neurons. Ann.N. Y. Acad. Sci., 2003; 993: 276-286
  Google Scholar

Pełna treść artykułu