Streszczenie

Utrzymanie integralności błony komórkowej zależy od rozmieszczenia i funkcjonalności występujących w niej białek. Dlatego prawidłowe działanie systemów kontroli jakości jest podstawą przeżycia organizmów. Zachowanie homeostazy proteomu w zmieniających się warunkach środowiskowych jest możliwe dzięki usuwaniu zbędnych białek, przy jednoczesnym zwiększeniu ekspresji innych. Zablokowane w błonie białka mogą wchodzić w niepożądane interakcje z innymi cząsteczkami, tworzyć agregaty i nabierać toksycznego charakteru. W komórkach eukariotycznych zidentyfikowano kilka mechanizmów rozpoznawania nieprawidłowości konformacyjnych w obrębie błony komórkowej – zależny od chaperonów system wykrywający źle sfałdowane domeny cytoplazmatyczne oraz zawarty w strukturze samego białka system LID, opierający się na ekspozycji degronu po przyjęciu odpowiedniej konformacji. U drożdży opisano również sieć zależności adaptorów ART i ligazy Rsp5, współpracujących w degradacji transporterów błonowych. Rsp5 jest E3 ligazą ubikwityny należącą do rodziny Nedd4, jedyną dotychczas zidentyfikowaną drożdżową ligazą ubikwitynującą białka błonowe. Ubikwitynacja przez Rsp5 jest sygnałem do internalizacji białek w procesie endocytozy; następnie są rozpoznawane przez system ESCRT, wprowadzane do MVB i degradowane przez proteazy wakuolarne. Rsp5 preferuje budowanie łańcuchów poli-Ub przez K63, a na błonowe substraty naprowadzana może być przez tzw. białka adaptorowe. Dotychczas zidentyfikowano kilkanaście białek pełniących funkcje adaptorów dla Rsp5, większość z nich należy do rodziny α-arestyn. Wykazano, że zaburzenia ubikwitynacji białek błonowych mogą prowadzić do nowotworzenia, rozwoju chorób neurodegeneracyjnych, chorób układu krążenia i nadciśnienia. Wciąż jednak brak odpowiednich środków, które można by zastosować w terapii. Drożdże Saccharomyces cerevisiae są jednym z najlepszych modeli do badań mechanizmów ubikwitynacji i degradacji białek błonowych.

Wstęp

Utrzymywanie integralności błony komórkowej (PM, plasma membrane) jest podstawą życia komórki. Membrana cytoplazmatyczna tworzy platformę kontaktu ze środowiskiem zewnętrznym. Zakotwiczone w błonie receptory sygnałowe, akwaporyny, transportery substancji odżywczych i inne białka są niezbędne do przeżycia, wzrostu i zachowania homeostazy. Zachowanie prawidłowej struktury błony zależy od rozmieszczenia i funkcjonalności białek w niej występujących, stąd sprawnie działające systemy kontroli jakości i degradacji białek leżą u podstaw przeżycia, szczególnie organizmów jednokomórkowych. Zmieniające się warunki środowiska i dostępność czynników odżywczych wymuszają dostosowanie przez komórkę białek z obrębu błony komórkowej, stanowiących do 20% proteomu [2]. Białka niewykorzystywane, zbędne lub już wykorzystane są wyprowadzane z błony i degradowane (turnover) przy jednoczesnym zwiększeniu ekspresji innych białek, które w danych warunkach są niezbędne. Zachowanie homeostazy proteomu komórki (proteostasis) wymaga regulacji na poziomie transkrypcji, translacji i degradacji. Prawidłowy balans między wytwarzaniem białka, a jego degradacją zależy od fałdowania, potranslacyjnych modyfikacji, oligomeryzacji, prawidłowego sortowania i aktywności mechanizmów degradacyjnych. Z zaburzeniami funkcjonowania białek błonowych powiązano wiele chorób.

Białka uszkodzone i źle sfałdowane mogą wchodzić w niepożądane interakcje z innymi cząsteczkami, tworzyć w komórkach agregaty i nabierać toksycznego charakteru. Szybkie rozpoznanie i pozbycie się tego typu zagrożeń jest szczególnie ważne w przypadku błony cytoplazmatycznej, gdzie nawet kilka wadliwych białek transmembranowych może zaburzyć homeostazę lipidowo-białkową doprowadzając do destabilizacji i śmierci komórki [13]. Funkcjonalne białka również podlegają nieustannemu cyklowi syntezy i proteolizy – wyjątkiem są m.in. krystaliny soczewki oka, które nigdy nie ulegają wymianie ani degradacji [79]. W zależności od funkcji, fazy cyklu komórkowego i panujących warunków środowiskowych, białka charakteryzują się różnym czasem półtrwania. U drożdży Saccharomyces cerevisiae waha się od 4 minut do 48 godzin (podczas gdy cykl komórkowy trwa około 90 min) [16].

W komórkach eukariotycznych są dwie główne ścieżki degradacji białek – zależna od ubikwityny degradacja w proteasomie oraz proteoliza wakuolarna/lizosomalna. Uszkodzone i niepotrzebne białka cytozolowe, po rozpoznaniu, są kierowane na drogę degradacji proteasomalnej, choć w warunkach stresu głodowego mogą wybiórczo ulegać autofagii i następnie proteolizie wakuolarnej [12]. W proteasomie są hydrolizowane również białka zewnętrznej błony mitochondrialnej [27,87] oraz retrotranslokowane z retikulum endoplazmatycznego (ER) [41,49]. Otoczone podwójną błoną mitochondria, jako jedyne organella, wykształciły własny system proteolityczny – macierz mitochondrialna oraz błona wewnętrzna nie mają dostępu do cytoplazmatycznego systemu degradacji, stąd zawierają własne ATP-zależne proteazy i oligopeptydazy [63]. Zupełnie inaczej są usuwane białka błony komórkowej, które podlegają kilkuetapowemu transportowi do wakuoli (lizosomu w komórkach zwierzęcych), gdzie wraz z fragmentami błony są degradowane przez nieswoiste proteazy i lipazy [71].

Biorąc pod uwagę różnorodność białek błonowych (np. transportery, receptory, kanały) zaburzenia procesu ich regulacji poprzez ubikwitynację doprowadzają do zmian w sieci odpowiedzi wewnątrzkomórkowej (down stream signaling pathways), a to wpływa na fizjologię komórki [31]. Zaburzenia ubikwitynacji białek błonowych mogą bezpośrednio lub pośrednio wpływać na rozwój wielu chorób np. nowotworzenie, choroby serca, neurodegeneracyjne czy metaboliczne [31].

Ubikwitynacja białek

Ubikwitynacja jest sposobem znakowania białek przeznaczonych do degradacji, endocytozy, naprawy i innych procesów komórkowych. Polega na kowalencyjnym przyłączeniu zbudowanej z 76 aminokwasów ubikwityny (Ub) do substratu, którym może być również inna cząsteczka ubikwityny. Tworzy się w ten sposób wiązanie izopeptydowe między resztą lizynową substratu, a C-końcową glicyną ubikwityny [47]. W cząsteczce ubikwityny zidentyfikowano 6 reszt lizynowych: K6, K11, K29, K33, K48 i K63 (ryc.1), z których każda może utworzyć wiązanie izopeptydowe z następną cząsteczką ubikwityny. W wyniku poliubikwitynacji powstaje łańcuch ubikwityn, który w zależności od tego, przez którą resztę lizynową ubikwityny jest zbudowany, nadaje białku różne przeznaczenie. Łańcuchy dołączone do lizyny K48 kierują substrat na ścieżkę degradacji proteasomalnej [118], a odchodzące od lizyny K63 są sygnałem związanym z wieloma procesami komórkowymi, m.in. naprawą DNA [111] i odpowiedzią na stres środowiskowy [10], ale co najważniejsze w obrocie białek błony komórkowej – są sygnałem sortowania do ciał wielopęcherzykowych (MVBs, multivesicular bodies) [67].

Ryc. 1. Typy ubikwitynacji; A – sekwencja aminokwasowa ubikwityny z zaznaczonymi lizynami (K), poprzez które może dochodzić do tworzenia układów poliubikwitynowych, B – przyłączanie cząsteczki ubikwityny do substratu może doprowadzić do monoubikwitynacji, multiubikwitynacji lub poliubikwitynacji

Substrat może ulegać monoubikwitynacji, multiubikwitynacji (pojedyncze cząsteczki ubikwityny są przyłączane do różnych reszt lizynowych substratu) lub być poliubikwitynowany na wielu resztach lizynowych (ryc. 1), np. permeaza Gap1 u drożdży S. cereviasiae ma dwa takie miejsca – K9 i K16 [110]. Badania mutantów lizynowych Gap1 i receptora α-faktora wykazały, że już pojedyncza ubikwitynacja wystarcza do internalizacji białka błonowego [112,117], choć poliubikwitynacja przez UbK63 jest niezbędna do skierowania na ścieżkę MVB i degradacji wakuolarnej [67].

Proces ubikwitynacji przebiega w trzech etapach. W pierwszym dochodzi do aktywacji ubikwityny i przeniesieniu jej na resztę cysteinową enzymu aktywującego E1, powstaje wiązanie tioestrowe. Następnie ubikwityna zostaje przeniesiona na resztę cysteinową enzymu koniugującego E2. W ostatnim etapie ligaza ubikwityny, tzw. enzym E3, katalizuje powstanie wiązania izopeptydowego między C-końcową glicyną ubikwityny a grupą aminową reszty lizynowej substratu białkowego [47] (ryc. 2). U drożdży S. cerevisiae zidentyfikowano 4 geny kodujące ubikwitynę: UBI1, UBI2, UBI3, UBI4 (tabela 1). Większość organizmów eukariotycznych ma tylko jeden enzym aktywujący E1 [95], a wiele E2 i E3. Na przykład u S. cerevisiae występuje jeden enzym E1 (Uba1), jedenaście E2 (tabela 1) i 60-100 enzymów uczestniczących w ligacji [30]. Różnorodność ligaz E3 wynika z ich swoistości substratowej – są odpowiedzialne za rozpoznawanie substratu (również w kompleksach z E2), które odbywa się w różnych warunkach i umiejscowieniu. Ligazy ubikwityny funkcjonujące jako regulatory cyklu komórkowego rozpoznają inne substraty niż ligazy kierujące uszkodzone białka do degradacji. Natomiast w obrębie samych substratów, uszkodzenia mogą przyjmować różne formy wymagające innego rodzaju identyfikacji. Rozpoznawanie może mieć charakter bezpośredni lub występować z udziałem mediatorów. Ligaza Rsp5 biorąca m.in. udział w odpowiedzi na szok cieplny, rozpoznaje i ubikwitynuje białka cytoplazmatyczne bezpośrednio lub z udziałem białka opiekuńczego Hsp40 [28], a wchodząc w interakcje z białkami ARTs funkcjonuje jako część systemu jakości (QC, quality control) białek błonowych [136]. Zanim białko zostanie ubikwitynowane, musi zostać rozpoznane jako przeznaczone do degradacji. Pozwalają na to sygnały degradacyjne, tzw. degrony, zawarte w samej strukturze tych białek. Degronami mogą być krótkie sekwencje, np. PEST (region bogaty w prolinę, gutaminian, serynę i treoninę) [101], wolne grupy α-aminowe, motywy z charakterystycznie ufosforylowanymi resztami serynowymi/treoninowymi, a także odsłonięte reszty hydrofobowe [100].

Geny kodujące ubikwitynę
UBI1 (YIL148W)	Koduje białko ubikwityna-L40A (składnik podjednostki 60S rybosomu) [93]
UBI2 (YKR094C)	Koduje białko ubikwityna-L40B (składnik podjednostki 60S rybosomu) [93]
UBI3 (YLR167W)	Koduje białko ubikwityna-S31 (składnik rybosomu) [93]
UBI4 (YLL039C)	Koduje prekursorową formę pentameru poliubikwityny (5 kopii genu ubikwityny powtórzone bez przerw w układzie „head- to-tail”)
Białka E1	Charakterystyka
Uba1	Enzym aktywujący ubikwitynę; łączy się z terminalną glicyną ubikwityny poprzez wysokoenergetyczne wiązanie tioestrowe; aktywacja wymaga ATP; białko niezbędne do życia komórki [81]
Białka koniugujące/ E2/ UBC	Charakterystyka
Ubc1	Związane z biogenezą wakuoli, ERAD, kontrolą jakości białek jądrowych, degradacją proteasomalną [109]
Ubc2/Rad6	Związane z procesami naprawy DNA, regulacją histonu H2B, N-end rule degradacją białek [56]
Ubc3/Cdc34	Regulacja cyklu komórkowego; niezbędne do życia komórki
Ubc4	Kontrola jakości białek poza jądrem, związane z odpowiedzią na stres [108]
Ubc5	Podobne do Ubc4, ekspresja głównie w fazie stacjonarnej [108]
Ubc6/Doa2	Zlokalizowany na błonie ER; związany z ERAD; związany z degradacja proteasomalną [35]
Ubc7	Związany z ERAD [35]
Ubc8	Reguluje glukoneogenezę [98]
Ubc10	Zlokalizowany w peroksysomach, niezbędny do biogenezy peroksysomów [25]
Ubc11	[122]
Ubc12	E2 dla Rub1 (ubiquitin-like protein) [73]
Ubc13	Związany z naprawą DNA; tworzy heterodimer z Mms2 [19]
Deubikwitynazy	Charakterystyka
Ubp1	Zlokalizowane w ER i cytoplazmie [120]
Ubp2	Homeostaza K63 w stresie osmotycznym; deubikwitynacja Rsp5; związane z sortowaniem białek błonowych [14,64]; związany z ubikwitynacją PCNA i replikacją DNA [3], związany z regulacją ART [50]
Ubp3	Zlokalizowany w cytoplazmie; tworzy kompleks z Bre5; związany z regulacją transportu między ER i Golgi; związany z odpowiedzią na stres replikacyjny [14,119]
Doa4/Ubp4	Deubikwitynacja białek z pęcherzyków MVB; związany z degradacją białek błonowych; niezbędny do recyklingu Ub [94,103]; związany z odpowiedzią komórki na rtęć [53]
Ubp5	Zlokalizowany w miejscu pączkowania [130]
Ubp6	Związany z degradacją proteasomalną; związany z recyklingiem Ub [39]; związany z odpowiedzią komórki na rtęć [53]
Ubp7	Zlokalizowany w cytoplażmie; powiązany z naprawą DNA przez rekombinację [18]; związany z endocytozą [125]
Ubp8	Deubikwitynuje histon H2B [80]
Ubp9	Związany z transportem białek błonowych; wchodzi w interakcje z Duf1 [15]
Ubp10	Zlokalizowany w jądrze; reguluje PCNA [33]
Ubp11	[4]
Ubp12	Zlokalizowany w jądrze i cytoplazmie [4]
Ubp13	Związany z odpowiedzią komórki na rtęć [53]
Ubp14	Związany z degradację Fbp1 [102], związany z odpowiedzią komórki na rtęć [53]
Ubp15	Wpływa na progresję cyklu komórkowego w fazie G1/S [92]; związany z odpowiedzią komórki na rtęć [53]; związany z ubikwitynacją PCNA i replikacją DNA [3]; związany z regulacją ART [50]
Ubp 16	Mitochondrialne [62]; związany z ubikwitynacją PCNA i replikacją DNA [3]
Otu1	Wchodzi w interakcje z Cdc48 [104]; związany z regulacją odpowiedzi na stres replikacyjny [119]
Otu2	Związany z rybosomami; związany z regulacją odpowiedzi na stres replikacyjny [119]
Rpn11	Metalopeptydaza związana z deubikwitynacją i degradacją białek w proteasomie [123]

Tabela 1. Składniki systemu ubikwitynacji u Saccharomyces cerevisiae

Mechanizm rozpoznawania uszkodzonych białek błonowych (i cytoplazmatycznych) jest słabo poznany, choć zidentyfikowano różne elementy systemu QC zaangażowane w ten proces. W rozfałdowanych domenach cytoplazmatycznych, ogólnym degronem wydają się eksponowane reszty hydrofobowe, gdzie rekrutacja chaperonów nie wymaga odsłonięcia konkretnej sekwencji. Bardziej swoistych sygnałów degradacyjnych można się dopatrywać w sekwencjach rozpoznawanych przez ligazy E3, np. Rsp5 ma domeny WW, mogące wiązać się do białek z motywem PY [136], być może w ten sposób bezpośrednio rozpoznaje uszkodzone białka.

Proces ubikwitynacji jest odwracalny. Cząsteczki ubikwityny ulegają recyklingowi po rozcięciu wiązania izopeptydowego między resztą lizynową substratu a glicynową ubikwityny. Za uwolnienie ubikwityny są odpowiedzialne swoiste izopeptydazy nazywane deubikwitynazami (DUBs, deubiquitinating enzymes) [4]. U drożdży S. cerevisiae zidentyfikowano dotychczas kilkanaście deubikwitynaz (tabela 1). Aktywność DUB jest potrzebna nie tylko do uwalniania ubikwityny ze znakowanego substratu, lecz również do uzyskania nowych cząsteczek przez obrabianie produktów genów Ubi1-Ubi4, kodujących fuzyjne białka połączonej ubikwityny i rybosomalnych białek L40 i S31 [29]. Rola deubikwitynaz w regulacji procesów komórkowych jest obecnie szeroko badana. Ubikwitynacja białek błony umożliwia ich endocytozę i degradację wakuolarną
Większość białek występujących wewnątrz komórki jest degradowana w proteasomach w cytoplazmie lub jądrze. Szacuje się, że u drożdży przynajmniej 80% proteasomów występuje w jądrze, gdzie za ubikwitynację wadliwych białek (również cytoplazmatycznych) odpowiada ligaza San1 [6,105]. W zupełnie inny sposób są proteolizowane białka błony komórkowej. Zbędne komórce, wykorzystane lub uszkodzone białka, przez endocytozę i sortowanie do ciał wielopęcherzykowych, docierają do wakuoli/lizosomu, gdzie są degradowane z fragmentami błony (ryc. 3). Wcześniej białko musi zostać rozpoznane przez ligazę E3 lub adaptor [89] i ubikwitynowane, co umożliwia internalizację dzięki rekrutacji białek endocytarnych, choć opisana została również endocytoza niezależna od ubikwitynacji [21]. Wiele z białek biorących udział w endocytozie i sortowaniu do endosomów ma domeny wiążące ubikwitynę (UBDs, ubiquitin binding domains). Adaptory Ent1, Ent2 i Ede1 rozpoznają białka znakowane do degradacji i umożliwiają jego interakcje z maszynerią endocytarną [40]. Powstaje tzw. wczesny endosom i na tym etapie możliwy jest jeszcze recykling białka, które po deubikwitynacji może zostać skierowane z powrotem do błony komórkowej bezpośrednio lub przez TGN (trans-Golgi network) [51]. W innym wypadku następuje rekrutacja kompleksów ESCRT (endosomal complex required for transport), które odczytują ubikwitynację jako sygnał sortowania do ILVs (intraluminal vesicles), pęcherzyków powstających po wpukleniu się błony do wnętrza endosomu. Późny endosom zawierający wiele ILVs nazwano ciałem wielopęcherzykowym (MVB). Formacja ILVs wymaga aktywności pięciu konserwatywnych ewolucyjnie endosomalnych kompleksów sortujących ESCRT-0, ESCRT-I, ESCRT-II, ESCRT-III i ESCRT-IV. U drożdży S. cerevisiae w skład kompleksów wchodzą białka: ESCRT-0 (Vps27, Hse1), ESCRT-I (Vps23, Vps28, Vps37, Mvb12), ESCRT-II (Vps36, Vps22, Vps25), ESCRT-III (Vps20, Snf7, Vps24, Vps2, Vps60, Did2) i Vps4-AAA-ATPazy (Vps4, Vta1). Białka kompleksów ESCRT 0/I/II wchodzą w interakcje z ubikwitynowamymi białkami wykorzystując motywy interakcji z ubikwityną (UIM, ubiquitin-interaction motif) [52]. Wiążą się do ubikwityny przez resztę Ile44 i z nią sąsiadujące, uniemożliwiając jednoczesną interakcję wielu ESCRTs z jedną cząsteczką ubikwityny [129]. Tworzenie ILVs rozpoczyna rozpoznanie ubikwitynowanego ładunku (cargo) i przyłączenie się ESCRT-0 do endosomu. Na nakierowanie ESCRT do endosomu wpływa oddziaływanie z lipidami błony komórkowej. Podjednostka Hrs/Vps27 ESCRT-0 zawiera domenę FYVE, która swoiście wiąże trifosforanfosfatydyloinozytolu (PtdIns(3)P) i umożliwia rekrutację kompleksu do błony [99]. Podobnie inne domeny w obrębie ESCRT mają swoistą i nieswoistą zdolność wiązania do różnych lipidów, np. domena GLUE Vsp26 w ESCRT-II wiąże się do PtdIns(3)P i innych fosfatydyloinozytoli [34]. ESCRT-0 jest niezbędny do rekrutacji ESCRT-I i inicjuje szlak powstawania MVB. Wykazano, że również ligaza Rsp5 wchodzi w interakcje z ESCRT-0, wiążąc motyw PY w podjednostce Hse1, być może przykładając się do zmiany losów białka w ostatniej chwili [76]. ESCRT-I z jednej strony kompleksu wiąże się do ESCRT-0, a z drugiej do ESCRT II, jednocześnie ESCRT-I i –II wiążą ładunek, dzięki czemu powstaje region zawierający ubikwitynowane białka i rozpoczyna się inwaginacja błony endosomu [46]. ESCRT-II wiąże podjednostkę Vsp20, co umożliwia złożenie występującego w formie monomerycznej kompleksu ESCRT-III w całość, natomiast ESCRT-III odpowiada za złożenie ILV i oddzielenie go od błony endosomu. Zanim proces zostanie zakończony, podjednostka Snf7 ESCRT-III wiąże białko adaptorowe Bro1, rekrutujące do miejsca formacji pęcherzyka enzym deubikwitynujący Doa4, który umożliwia uwolnienie i recykling ubikwityny związanej z białkami (cargo) przeznaczonymi do degradacji [75]. Gdy zostanie pomyślnie rozdzielony do pęcherzyka wewnątrz MVB, kompleks Vps4-Vta1 o aktywności ATP-azy, rozmontowuje ESCRT-III rozfałdowując jego podjednostki, ale nie degradując ich [131]. Jeśli wszystkie cargo zostaną posortowane, dojrzałe MVB ulega fuzji z wakuolą i uwalnia swoją zawartość do lumen, gdzie poddana jest działaniu peptydaz. Dotychczas scharakteryzowano siedem wakuolarnych proteaz u S. cerevisiae: trzy aminopeptydazy (Ape1, Ape3, Dap2), dwie endopeptydazy (Pep4, Prb1) oraz dwie karboksypeptydazy (Prc1, Cps1) [43]. Pozwalają na cięcia substratów, a uzyskane w wyniku proteolizy białek aminokwasy są transportowane pompami błony wakuolarnej do cytoplazmy, gdzie zostają ponownie użyte do syntezy białek [57].

Ryc. 3. Zbędne białka błonowe są ubikwitynowane, a następnie przez endocytozę i sortowanie do ciał wielopęcherzykowych docierają do wakuoli/lizosomu, gdzie są degradowane z fragmentami błony

Kontrola jakości białek błony cytoplazmatycznej

System kontroli jakości (quality control system) pozwala na rozpoznanie, oznakowanie i wysłanie wadliwych białek do degradacji. W cytoplazmie opiera się głównie na rekrutacji białek szoku cieplnego (HSPs, heat shock proteins), rodziny białek opiekuńczych (chaperony), których głównym zadaniem jest rozpoznawanie i wiązanie się do odsłoniętych reszt hydrofobowych białek, dzięki czemu promują prawidłowe fałdowanie i zapobiegają toksycznym skutkom agregacji [20]. Chaperony asystują w ponownym fałdowaniu uszkodzonych białek, ale też zapobiegają przedwczesnym zaburzeniom konformacyjnym już w podczas syntezy i umożliwiają przyjęcie prawidłowej konformacji po niej [61]. Wiązanie nie wymaga najczęściej odsłonięcia swoistej sekwencji, gdyż istotne jest szybkie rozpoznanie i eliminacja każdego nieprawidłowego strukturalnie białka. Jeśli po rozpoznaniu nie uda się przywrócić białka do poprawnej konformacji, kierowane jest na drogę degradacji [20].

Badania mutantów ssaczych [36,128] i drożdżowych [37,55,66,72] wykazały, że białka PM z uszkodzeniami konformacyjnymi zostają wycofane z błony i są degradowane w lizosomach/wakuolach. Po raz pierwszy proces ten opisano dla receptora α-faktora w komórkach S. cereviasiae [55]. W badaniach wykorzystano wrażliwe na temperaturę mutanty ste2-3, w komórkach których w temperaturze restrykcyjnej (34°C) receptory po syntezie kierowane były bezpośrednio do degradacji w wakuoli, z pominięciem PM. W temperaturze permisywnej (24°C) prawidłowo lokalizowały się w błonie, jednak po podwyższeniu temperatury do 34°C były kierowane do proteolizy wakuolarnej [55]. Wykazano w ten sposób, że źle sfałdowane białka PM podlegają kontroli jakości nie tylko w ER, ale również w samej błonie cytoplazmatycznej. Nie wiadomo jeszcze, w jaki sposób różne defekty pozwalają na rozpoznanie konkretnego substratu przez system kontroli jakości. Badania drożdżowego mutanta H+-ATPazy błonowej Pma1 ze zmianami w jednej z domen cytoplazmatycznych (A165G i V197I) wskazały obecność takich systemów na poziomie błony komórkowej i potwierdziły wakuolarne przeznaczenie wadliwych form Pma1 [37,84]. U wrażliwego na temperaturę mutanta pma1-10 w warunkach restrykcyjnych (37°C) nowo zsyntezowane i pomyślnie dostarczone do błony cytoplazmatycznej kopie Pma1-10 były od razu degradowane w wakuoli [37], podczas kiedy okres półrozpadu natywnej formy białka wynosi około 11 godzin [17].

Zależny od chaperonów system kontroli jakości białek błonowych

Ligaza ubikwityny Rsp5 i sieć Rsp5-adaptor

Rsp5 jest E3 ligazą ubikwityny należącą do rodziny Nedd4, jedyną dotychczas zidentyfikowaną drożdżową ligazą ubikwitynującą białka błonowe. W strukturze Rsp5 wyróżnić można N-końcową domenę C2, która wykazuje interakcję z wieloma białkami i fosfolipidami [86], a także z C-końcową domenę katalityczną HECT, umożliwiającą przekazywanie ubikwityny z enzymu koniugującego E2 na substrat (ryc. 4) [54]. Interakcje z substratami zapewnia obecność trzech 40-aminokwasowych domen WW, zawierających dwie konserwatywne reszty tryptofanowe [134], które mogą się wiązać do białek zawierających bogaty w proliny motyw PPxY (PY), np. mediatorów ART [136] i substratów (ENaC) [23]. Ubikwitynacja białek błonowych przez Rsp5 jest sygnałem do ich internalizacji w procesie endocytozy [22], jednak Rsp5 (podobnie jak jej ssaczy homolog Nedd4) pełni również rolę w czasie szoku cieplnego, znakując białka cytozolowe do degradacji proteasomalnej [28]. Gdy substrat ulega rozfałdowaniu, może wyeksponować powszechny wśród białek motyw PPxY, który jest rozpoznawany przez domeny WW. Ligaza ubikwityny Rsp5 preferuje budowanie łańcuchów poli-Ub przez K63 [60].

Ryc. 4. Struktura ligazy ubikwityny Rsp5. W białku Rsp5 wyznaczono obecność domen WW (interakcja z substratem lub adaptorem), C2 (interakcja z fosfolipidami) i HECT (domena katalityczna)

W przypadku białek Fur4, Gap1 obserwowano zależną od Rsp5 ubikwitynację i internalizację mimo braku w sekwencji tych białek motywu PPXY [69]. Wykazano, że Rsp5 może być naprowadzana na błonowe substraty przez tzw. białka adaptorowe. Dotychczas zidentyfikowano kilkanaście białek pełniących funkcje adaptorów Rsp5. Większość z nich należy do rodziny α-arestyn [97], określa się je jako adaptory ART (arrestin-related trafficking adaptors). Do grupy adaptorów Rsp5 zakwalifikowano również drożdżowe białka Bul1, Bul2, Bsd2 [45,48,133], Ear1, Ssh4 [68], Tre1 i Tre2 [115] (tabela 2). Białka te pośredniczą w rozpoznawaniu i ubikwitynacji białek błonowych [136], sprawują więc ważną rolę w remodelingu błony komórkowej [88,89]. Degradacja wielu białek PM jest odpowiedzią adaptacyjną na różne zmiany środowiskowe, np. stres głodowy [57]. Taka regulacja ma na celu przystosowanie komórki do nowych warunków i mogą w niej uczestniczyć swoiste adaptory ART [77], ich funkcja nie ogranicza się więc do kontrolowania jakości białek. Dotąd do rodziny ART zakwalifikowano dziesięć białek (Art1-10) wykazujących podobieństwa w funkcji i budowie domenowej [74,88,89] (tabela 2). Wykazano również, że większość z nich (włączając Bul1,2 [83,90], Art1-Art8, Art10 [74,88]) ma motyw PPxY, który umożliwia wiązanie do ligazy Rsp5 przez domeny WW (wyjątkiem jest Art9 niemające motywu PPXY) [74].

Adaptory		Charakterystyka
Art1/Ldb19	Zlokalizowany w błonie komórkowej; regulacja endocytozy [75]
Art2/Ecm21	Zlokalizowany w błonie komórkowej; regulacja endocytozy [89]
Art3/Aly2	Reguluje endocytozę białek błonowych, reguluje sortowanie Gap1 w odpowiedzi na czynniki odżywcze [43]
Art4/Rod1	Zlokalizowany w błonie komórkowej; regulacja endocytozy [7]
Art5	Związany z endocytozą białek błonowych [75]
Art6/Aly1	Regulacja endocytozy; sortowanie białek w odpowiedzi na czynniki odżywcze [43]
Art7/Rog3	Regulacja endocytozy [89]
Art8/Csr2	Regulacja endocytozy; reguluje użycie niefermentowalnych źródeł węgla [89]
Art9/Rim8	Niezbędny do wzrostu w warunkach anaerobowych; związany z odpowiedzią na zmiany pH [89]
Art10	Zlokalizowany w cytoplazmie; nadekspresja powoduje oporność na arsenin [117]
Bul1	Regulacja sortowania permeaz aminokwasów z błony do wakuoli [46, 134]
Bul2	Funkcjonalny homolog Bul1 [134]
Bsd2	Reguluje transport metali przez błonę; reguluje wakuolarną degradację Smf1 [49]
Ear1	Reguluje segregowanie białek błonowych do MVB [69]
Ssh4	Reguluje segregowanie białek błonowych do MVB [69]
Tre1	Zlokalizowany w błonie komórkowej; wchodzi w interakcje z Bsd2; reguluje wakuolarną degradację Smf1 [116]
Tre2	Zlokalizowany w błonie komórkowej; wchodzi w interakcje z Bsd2; reguluje wakuolarną degradację Smf1 [116]

Tabela 2. Adaptory dla ligazy ubikwityny Rsp5

Szok cieplny i inne czynniki proteotoksyczne (np. etanol, DTT, diamid) indukują wzmożoną endocytozę i degradację białek błonowych, co wiąże się z eliminacją uszkodzeń w obrębie błony komórkowej [136]. Komórki ekspresjonujące zmutowane w obrębie domen WW białko rsp5-ww2 i rsp5-ww3 wykazywały znacznie zwiększoną wrażliwość na temperaturę i nie mogły rosnąć w temperaturze 38°C, natomiast utrata interakcji Rsp5-ART powodowała akumulację rozfałdowanych białek w PM, co za tym idzie utratę integralności błony i śmierć komórki [136]. Wskazuje to na ważną role domen WW Rsp5 wchodzących w interakcje z białkami adaptorów, i że to właśnie mediatory są odpowiedzialne za rozpoznawanie uszkodzonych, zbędnych lub wykorzystanych białek błonowych, które następnie są ubikwitynowane przez Rsp5 [28].

Dotychczasowe badania wskazują na specyfikę substratową mediatorów ART. Białka ART regulują endocytozę i degradację różnych transporterów błonowych, choć ich funkcje mogą się na siebie nakładać. Zaobserwowano również, że dany substrat może być rozpoznawany przez różne ART w zależności od warunków. Przykładowo Art4 w prawidłowych warunkach (obecność glukozy) pośredniczy w regulacji Hxt6, ale w warunkach stresowych internalizacja tego transportera wymaga aktywności Art8 [88,136]. Art1 przy współpracy z Art2 pośredniczy w endocytozie i degradacji Tat2 i Fur4, samo odpowiedzialne jest za regulację endocytozy m.in. permeaz metioniny Mup1, argininy Can1 i lizyny Lyp1 [74,88,136]. Art1 uczestniczy w degradacji wielu błędnie fałdowanych białek błony komórkowej w warunkach stresu cieplnego [24].

W temperaturze 38°C Art1 są transportowane do błony komórkowej i choć nie pośredniczą w indukowanej szokiem cieplnym degradacji wakuolarnej większości badanych białek błonowych, delecja Δart1 wykazywała podobną wrażliwość do mutantów rsp5-ww2 i rsp5-ww3 [136]. Sieć Rsp5-ART jest więc niezbędna do ochrony komórki przed toksycznymi skutkami akumulacji białek błony komórkowej i jest głównym składnikiem systemu kontroli jakości (QC) błony komórkowej. Różnorodność oddziaływań ART z wieloma substratami wyjaśnia w jaki sposób oddziaływanie ART-Rsp5 nadaje ligazie Rsp5 swoistość substratową. Wciąż nie wyjaśniono jednak w jaki sposób poszczególne substraty błonowe są rozpoznawane przez białka adaptorów. Adaptory Bsd2, Ear1, Tre1, Art1, Art2, Art3, Art6, Art8 same ulegają zależnej od Rsp5 ubikwitynacji. Nie ustalono, czy w tym przypadku ubikwitynacja potrzebna jest do regulacji aktywności tych adaptorów; wykazano jednak, że ta modyfikacja wpływa na prawidłową ich lokalizację [65].

W badaniach komórek ssaczych [8,9,91] zauważono, że w kontrolę jakości białek błony komórkowej są zaangażowane te same elementy, które biorą udział w kontroli białek cytoplazmatycznych. Pierwszą identyfikację chaperonów biorących udział w PM QC umożliwiła konstrukcja chimery CD4 z temperaturowo wrażliwym wariantem domeny faga λ, który ulega rozfałdowaniu w podwyższonej temperaturze [9]. Rozwijanie zlokalizowanego w błonie cytoplazmatycznej chimerycznego białka CD4tl-λc wywoływało rekrutację białek opiekuńczych Hsp40/Hsp70/Hsp90 oraz kompleksów E2- E3 (w tym CHIP); nie działo się tak w dzikiej wersji domeny λ. Podobna kontrola jakości obejmowała zmutowane formy receptorów wazopresyny V2 i dopaminy D2.2 [9]. Główną rolę chaperonów wykazano również w należącym do rodziny ABC transporterów receptorze CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), kanału chlorkowego, którego mutacje są przyczyną mukowiscydozy [59]. Rekrutacja Hsp70 i Hsp90 okazała się niezbędna do ubikwitynacji przez ligazę CHIP (C-terminus of Hsc70-interacting protein) i eliminacji niefunkcjonalnego wariantu ΔF508-CFTR z błony cytoplazmatycznej [91]. Białka chaperonów Hsp i ligaza ubikwityny CHIP nie wchodzą w interakcje z natywnymi formami CFTR, uczestniczą natomiast w cytoplazmatycznej kontroli jakości rozpoznając i kierując do degradacji wadliwe postaci białka błony komórkowej [8,22,82,91]. Wykazano w ten sposób, że ligaza CHIP jest głównym elementem łączącym chaperony z systemem kontroli jakości [82]. N-końcowa część białka CHIP zawiera domenę TPR (tetratricopeptide repeat), która umożliwia wiązanie do sekwencji EEVD chaperonów Hsp70 i Hsp90, a po stronie C-końca znajduje się domena U-box, która jest odpowiedzialna za interakcje CHIP z koniugującymi ubikwitynę enzymami E2 [135]. Wydaje się więc, że również w przypadku błony komórkowej białko eksponujące reszty hydrofobowe do cytoplazmy jest wiązane przez Hsp70/Hsp90. Jeśli nie powiedzie się powtórne fałdowanie do kompleksu przyłącza się przez TPR ligaza CHIP, która rekrutuje E2 i ubikwitynuje białko, kierując je tym samym do degradacji. Różnica tkwi w preferencji CHIP do poliubikwitynacji – w przypadku białek błony cytoplazmatycznej głównie tworzy łańcuchy poli-Ub łączone przez K63 [8,9], co jest sygnałem sortowania do MVB i degradacji lizosomalnej, a w przypadku białek cytozolowych łańcuchy ubikwityn są tworzone przez K48 [131], a to kieruje substrat do proteasomu. Podobnego systemu QC angażującego chaperony nie udało się zidentyfikować w komórkach drożdżowych. W badaniach wyizolowano temperaturowrażliwe mutanty Ura3 i podobnie jak CD4tl-λc w komórkach ssaczych [9], wykorzystano zmutowaną domenę faga λ [70]. Mimo rozwiniętych domen cytoplazmatycznych badane białka (po opuszczeniu ER i ulokowaniu w błonie komórkowej) nie zostawały rozpoznane i nie ulegały degradacji. Obserwacja jest zaskakująca o tyle, że uszkodzone rejony hydrofobowe potencjalnie były narażone na działanie cytoplazmatycznego systemu QC. Choć drożdże nie mają homologa białka CHIP, podobne funkcje pełnią dwie ligazy ubikwityny – Ubr1 i San1, współpracując z chaperonami w obrębie cytoplazmy i jądra [44]. Być może więc w komórkach drożdżowych występuje odrębny system kontroli jakości białek błony komórkowej, niezależny od rekrutacji białek opiekuńczych. Wykazano, że za ubikwitynację większości białek PM u drożdży S. cerevisiae odpowiada ligaza Rsp5, która nie oddziałuje z białkami chaperonowymi [24].

System LID – degron w rozpoznawaniu substratu przez Rsp5-adaptor

Podstawowym i najgroźniejszym problemem narastającym przy akumulacji uszkodzonych lub zbędnych białek PM, jest tworzenie się porów w komórce. Rozfałdowane białka zawierające wiele domen transmembranowych mogą tworzyć pory powodujące utratę integralności błony komórkowej, co prowadzi do śmierci komórki. Wykazano, że omówione wcześniej chaperonowe systemy mogą rozpoznawać długie rozfałdowane regiony eksponowane do cytoplazmy [9,91], ale nie wiadomo w jaki sposób miałyby kontrolować jakość transmembranowych (lub zewnątrzkomórkowych) domen, które nie zostały do niej wycofane. W drożdżowym systemie Rsp5-ARTs regulacją niektórych transporterów błonowych w warunkach prawidłowych (np. obecności substratu) i stresowych zajmują się te same adaptory – np. Art2 reguluje degradację transportera uracylowego Fur4 w obecności uracylu, ale także po ekspozycji na cykloheksymid (choć inne ARTs mogą komplementować brak jego aktywności) [89]. Dalsze badania Fur4 doprowadziły do odkrycia tzw. systemu LID-degron.

Fur4 zawiera 12 domen transmembranowych i jest transporterem wtórnym. Operuje wykorzystując mechanizm naprzemiennego dostępu (AAM, alternating acces mechanism) – przyłączenie substratu powoduje niewielkie zmiany konformacyjne, ale podczas translokacji dochodzi do przesuwania się rejonów transbłonowych względem siebie [32]. W tym przypadku uracyl jest wiązany po stronie zewnątrzkomórkowej, zamykany w transporterze i następnie uwalniany do cytoplazmy tak, by nie doprowadzić do otwarcia transportera po obu stronach błony. Wysokie stężenie uracylu indukuje szybkie zmniejszenie ilości białka Fur4 w błonie i degradację wakuolarną [106], do czego jest potrzebna (katalizowana przez Rsp5) ubikwitynacja dwóch reszt lizynowych po stronie N-końca, sąsiadujących z sekwencją PEST [78]. Te same reszty podlegają ubikwitynacji również w warunkach stresowych (np. obecność cykloheksymidu; reakcja również katalizowana przez Rsp5) i w obu przypadkach w indukcji endocytozy Fur4 mogą brać udział te same ARTs. Wytłumaczeniem tego, w jaki sposób system ART-Rsp5 rozpoznaje zarówno natywne, jak i rozfałdowane postaci białka Fur4, wydaje się system LID-degron [58].

LID (loop interaction domain) jest domeną zbudowaną z 20 reszt aminokwasowych poprzedzających pierwszą domenę transmembranową transportera Fur4. Na podstawie analizy strukturalnej homologicznego transportera wtórnego u Microbacterium liquefaciens – Mhp1 [127] – zbudowano model, w którym LID tworząc wiązania wodorowe wchodzi w interakcje z wszystkimi pętlami cytoplazmatycznymi Fur4, w chwili kiedy z transporterem nie jest związany substrat. Wychwycenie cząsteczki uracylu powoduje zmiany konformacyjne w regionach transmembranowych, indukując zerwanie wiązań między LID a pętlami. Dzięki temu odsłonięty zostaje degron, ligaza Rsp5 uzyskuje dostęp do reszt lizynowych i możliwa staje się ich ubikwitynacja [58]. Działanie mechanizmu LID–degron tłumaczy również degradację indukowaną uszkodzeniami; szok cieplny i inne czynniki proteotoksyczne mogą zaburzać strukturę transporterów PM, przez co utracone zostają interakcje LID z pętlami. Taki model można przypisać nie tylko transporterom, ale właściwie każdemu białku błonowemu, które przechodzi funkcjonalne zmiany konformacyjne i degradowane jest przy dużej aktywności (koncentracji substratu) [13]. Rsp5 może bezpośrednio rozpoznawać sygnał do degradacji – jak wykazano może wiązać białka cytoplazmatyczne w czasie szoku cieplnego, bez udziału mediatorów [28]. Choć Fur4 nie zawiera motywu PY nie można wykluczyć, że wchodzi w innego rodzaju interakcje z Rsp5. Rekrutacja Rsp5 po odsłonięciu degronu prawdopodobnie odbywa się za pośrednictwem białek ART lub innych, związanych z błoną mediatorów [13].

Najnowsze badania wskazują, że zależna od Rsp5 degradacja permeazy metioniny Mup1 jest regulowana przez interakcje białka Mup1 z arestyną Art1. Rozpoznawany przez Art1 degron znajduje się na N-końcowej cytoplazmatycznej części białka Mup1, tuż przy lizynie K27 i K28, ulegającej Rsp5-zależnej ubikwitynacji. Region rozpoznawany przez Art1 obejmuje grupę kwaśnych aminokwasów (D43, Q49, L54), których zmiana na pozytywnie naładowaną argininę blokuje internalizację Mup1 [38]. Podobny system regulacji zaobserwowano w przypadku zależnej od Art1 degradacji i endocytozy permeazy argininy Can1, gdzie degron zidentyfikowano w obrębie grupy kwaśnych aminokwasów na N-końcu białka [38].

Ubikwitynacja w terapii

Odkrycie ubikwityny i wyjaśnienie procesu ubikwitynacji było ważnym procesem w biologii molekularnej (Nagroda Nobla, 2004). Szybko zaobserwowano, że jakiekolwiek zaburzenia procesów ubikwitynacji prowadzą do zaburzeń w homeostazie proteasomu komórkowego i w konsekwencji wielu chorób. Ubikwitynacja wpływa na regulowanie czasu obecności danego białka w błonie, bezpośrednio reguluje aktywność takich białek jak kanały jonowe, transportery aminokwasów czy receptory. Zaburzenia regulacji wpływają na aktywację wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych i mają różny wpływ na fizjologię komórki. Obecnie wskazano wiele patologii związanych z zaburzeniami ubikwitynacji białek błonowych doprowadzających do nowotworzenia, rozwoju chorób neurodegeneracyjnych i układu krążenia, nadciśnienia czy mukowiscydozy [31]. Upośledzenie aktywności ligazy ubikwityny FBW7 w komórkach ludzkich powoduje nadaktywność onkogenów: cykliny E, Myc, Jun i Notch. Mutacja ligazy ubikwityny c-Clb powoduje inhibicję ubikwitynacji białka FLT3, doprowadzając do transformacji nowotworowej i białaczki [126]. Zablokowanie w wyniku mutacji ubikwitynacji nabłonkowego kanału sodowego ENaC, który odgrywa główną rolę w regulacji stężenia sodu, powoduje nadaktywność tego białka, co jest głównym czynnikiem rozwoju nadciśnienia tętniczego i zespołu Liddle’a [113,114]. Mutacja kinazy PINK1 blokująca jego ubikwitynację doprowadza do zablokowania mitofagii i rozwoju wczesnej postaci choroby Parkinsona [96]. Wykazano, że ubikwitynacja odgrywa główną rolę w regulacji APP i α-amyloidu, białek odpowiedzialnych za rozwój choroby Alzheimera. Ligaza ubikwityny Nedd4 jest związana z regulacją transportera błonowego ABCB1, który eksportuje α-amyloid z komórek śródbłonka [1].

System ubikwitynacji jest obecnie wykorzystywany do walki z chorobami. Dotychczas zastosowane terapeutyki mające na celu inhibicję ubikwitynacji celują w zablokowanie proteasomu. Brak jednak środków swoiście działających na ubikwitynację i degradację białek błonowych. Badania wykazały, że zmutowana postać błonowego kanału chlorkowego CFTR(ΔF508) nie podlega sortowaniu do błony komórkowej, ale ulega szybkiej degradacji w systemie ERAD, co doprowadza do rozwoju mukowiscydozy. Zaobserwowano, że usunięcie ligaz ubikwityny RNF5 i RNF185 blokuje degradację CFTR(ΔF508) i pozwala na ponowne prawidłowe wprowadzanie CFTR do błony, bez wpływu na inne substraty ERAD [26,121]. Ukierunkowane blokowanie ligaz ubikwityny mogłoby stworzyć szansę na leczenie np. chorych z mukowiscydozą, dlatego tak ważne jest ustalenie mechanizmów regulujących ubikwitynację i degradację białek błonowych. Większość informacji o tym systemie czerpie się z badań prowadzonych na modelowym organizmie, drożdżach S. cerevisiae.

Pełna treść artykułu