Abstrakt

Wprawdzie od odkrycia cyklicznego AMP (cAMP) minęło już ponad 50 lat, jednak wciąż pojawiają się doniesienia o nowych, nieznanych dotąd funkcjach tego nukleotydu. cAMP powstaje z adenozyno-5’-trifosforanu w reakcji katalizowanej przez enzym cyklazę adenylową. W komórkach ssaków występuje dziewięć membranowych oraz jedna rozpuszczalna izoforma cyklazy adenylowej. Większość z nich współdziała z receptorami sprzężonymi z białkami Gs lub Gi. Jedynym sposobem degradacji cAMP jest reakcja hydrolizy katalizowana przez fosfodiesterazę. U ludzi wyróżnia się 11 rodzin tych enzymów, które różnią się powinowactwem do substratów, strukturą, miejscem występowania oraz mechanizmem regulacji. Modulacja ich aktywności jest ważnym kierunkiem w poszukiwaniu nowych leków. Efektorami cAMP są: kinaza proteinowa A (PKA), białka Epac oraz kanały jonowe zależne od cAMP. W przebiegu reakcji zapalnej, wzrost stężenia cAMP może prowadzić do wzrostu ekspresji IL-10 oraz hamowania uwalniania TNF-α, IL-12 i chemokiny MIP-1β, a także do zmniejszenia przepuszczalności naczyń. Ponadto nukleotyd ten reguluje proces fagocytozy. Natomiast działając przez PKA przeważnie przyspiesza proces apoptozy, a aktywując Epac hamuje śmierć komórki. Jak wykazano, stężenia cAMP różnią się w poszczególnych przestrzeniach wewnątrzkomórkowych, dzięki nierównomiernemu umiejscowieniu białek odpowiadających za jego syntezę i rozkład. cAMP jest transportowany na zewnątrz komórki z udziałem dwóch transporterów: ABCC4 i ABCC5. Stwierdzono występowanie ścieżki enzymatycznej odpowiedzialnej za pozakomórkowy rozkład cAMP. Po podaniu związków modulujących poziom cAMP gryzoniom, stężenia tego nukleotydu ulegają zmianom we krwi i/lub tkankach zwierząt. Postęp w badaniach nad cAMP stał się możliwy w dużym stopniu dzięki pojawieniu się nowych metod analitycznych do oznaczenia jego stężeń w materiale biologicznym.

Wstęp

Cykliczny 3’,5’-adenozynomonofosforan (cAMP) to niezwykle uniwersalny wtórny przekaźnik wewnątrzkomórkowy, uczestniczący w  regulacji wielu procesów, takich jak: metabolizm, apoptoza, ekspresja genów oraz proliferacja komórek. Mimo iż od odkrycia i opisania funkcji cAMP w mechanizmie działania hormonów peptydowych minęło już ponad 50 lat, to wciąż pojawiają się doniesienia o  nieznanych dotąd jego funkcjach. W ostatnich latach wykazano np., że cAMP może być mediatorem procesów przeciwstawnych (np. działanie pro- i przeciwapoptotyczne), co jest możliwe dzięki złożonemu systemowi precyzyjnego sterowania stężeniem tego związku w różnych obszarach komórki [47,117]. Odkrycie kompartmentalizacji białek odpowiedzialnych za rozpad, syntezę i przekazywanie sygnału cAMP stanowiło przełom w badaniach nad tym nukleotydem. Mimo intensywnej pracy badaczy, wiedza nad wieloma receptorami sprzężonymi z białkiem G oraz rolą cAMP w regulacji pewnych mechanizmów wciąż nie jest pełna.

W latach 50. XX w. Earl Sutherland podjął badania nad wyjaśnieniem mechanizmu działania adrenaliny i glukagonu w  procesie rozpadu glikogenu w  wątrobie. Wyniki badań wykazały, że regulatorową funkcję w tym procesie odgrywa fosforylaza, którą aktywują adrenalina i glukagon w wyniku fosforylacji. Inaktywacja enzymu zachodzi zaś przez defosforylację. Zauważono, że stymulacja hormonalna białek związanych z błoną komórkową doprowadza do pojawienia się odpornego na temperaturę czynnika powodującego fosforylację (aktywację) fosforylazy. Wyniki dwóch niezależnych grup badaczy: Sutherlanda i  Lipkina doprowadziły, z pomocą Heppela, do ustalenia budowy chemicznej tego czynnika jako 3’,5’-cyklicznego adenozynomonofosforanu [20,95].

Odkrycia następnych lat wykazały, że cAMP uczestniczy nie tylko w rozpadzie glikogenu, ale także w lipolizie, glukoneogenezie, ketogenezie, uwalnianiu insuliny przez trzustkę oraz wielu innych procesach metabolicznych. W komórkach bakteryjnych wzrost stężenia cAMP jest sygnałem spadku stężenia glukozy stymulują- cym ekspresję genów kodujących enzymy uczestniczące w pozyskiwaniu energii z innych źródeł [102]. W mięśniach i wątrobie ssaków nukleotyd zachował charakter sygnalizatora głodu, blokując pośrednio syntazę glikogenu oraz stymulując transkrypcję genów enzymów odpowiedzialnych za glukoneogenezę [23]. Jak wiadomo, cAMP powstaje z adenozyno-5’-trifosforanu (ATP) w reakcji katalizowanej przez cyklazę adenylową (AC). Reakcja zachodzi z udziałem jonów magnezu, z  jednoczesnym uwolnieniem pirofosforanu (PPi). Jedyną metodą degradacji cAMP jest reakcja hydrolizy katalizowana przez fosfodiesterazę (PDE) (ryc. 1) [23].

Większość izoform AC współdziała z niektórymi receptorami sprzężonymi z białkiem G (GPCRs, G protein-coupled receptors), których pobudzenie może spowodować wzrost lub zahamowanie aktywności katalitycznej tego enzymu [23].

Receptory sprzężone z białkiem G

Receptory sprzężone z białkiem G to rodzina receptorów błonowych obejmująca ponad 1000 różnych białek. Prawie połowa najczęściej stosowanych leków to ligandy GPCRs. Mimo trwających od lat intensywnych badań nad poznaniem ich budowy i funkcji, w dalszym ciągu na temat wielu z nich nie ma pełnych danych (receptory sieroce). Białko G jest ogniwem łączącym przekaźnictwo receptorów GPCR z efektorami wewnątrzkomórkowymi. Zbudowane z  trzech podjednostek: α, β i  γ, w  stanie nieaktywnym białko występuje w  postaci heterodimeru, a do podjednostki α jest przyłączony guanozyno- -5’-difosforan (GDP). Za kodowanie podjednostki α jest odpowiedzialnych szesnaście genów, pięć za kodowanie β, a dwanaście za kodowanie γ. Białka G podzielono na cztery rodziny uwzględniając ich funkcję i budowę podjednostki α: Gs , Gi , Gq i G12. Podjednostka α składa się z  dwóch domen: pierwsza wykazuje aktywność GTP-azową, natomiast druga pozwala na utrzymanie guanozyno-5’-trifosforanu (GTP) wewnątrz białka. Po aktywacji białka G przez receptor dochodzi do odszczepienia podjednostki α i odłączenia GDP. Uważa się, że receptor może używać dimeru βγ jak dźwigni, by wywołać zmiany konformacyjne powodujące uwolnienie GDP. Receptory GPCR biorą udział w wymianie GDP na GTP. Poszczególne białka G działają na różne efektory, np. podtypy Gs są kojarzone głównie ze stymulacją cyklazy adenylowej, ale uczestniczą także w regulacji GTP-azy tubuliny oraz kinazy tyrozynowej src. Gi odgrywają rolę, m.in. w hamowaniu cyklazy adenylowej oraz regulacji funkcji białka Rap, kanałów wapniowych i potasowych oraz fosfodiesterazy 3’,5’-cyklicznego guanozynomonofosforanu (cGMP). Efektorami Gq są fosfolipaza C i kinaza tyrozynowa Brutona. Fosfolipaza C katalizuje rozpad fosfatydyloinozytolo-4, 5-bisfosforanu do 1,2-diacyloglicerolu (DAG) i inozytolo-1, 4, 5-trifosforanu (IP3 ), które są istotnymi przekaźnikami drugiego rzędu [96]. Grupa G12 bierze udział w aktywacji wymiennika Na+ / H+ fosfolipazy D oraz syntazy tlenku azotu. Uważano, że tylko podjednostka α ma możliwość przekazywania sygnału (np. stymulacja i hamowanie cyklazy adenylowej). Dziś wiadomo, że dimer βγ także bierze udział w regulacji funkcji wielu innych białek, takich jak fosfolipaza C, kinaza receptorów GPCR, kalmodulina, dynamina i tubulina. Główną rolę w regulacji czasu trwania aktywnej postaci białka G odgrywa GTP-azowa domena podjednostki α. Efektory białka G (np. podjednostka γ fosfodiesterazy lub fosfolipaza Cβ) mogą zwrotnie nasilać wewnętrzną aktywność GTP-azową, skracając tym samym czas przekazywania sygnału. Oprócz czynników efektorowych opisano grupę białek regulujących przekazywanie sygnału przez białka G (RGS, regulators of G protein signaling), które także wzmacniają aktywność GTP-azową. Regulacja funkcji białek G może odbywać się także przez fosforylację, acylację i lipidację odpowiednich podjednostek. Fosforylacja przez kinazę proteinową C może osłabiać działanie podjednostki α na efektory i zapobiegać tworzeniu trimeru, nasilając działanie dimeru βγ, a także zmieniać selektywność efektorową dimeru βγ [13].

Pojawiające się dowody na istnienie ścieżek sygnałowych niezależnych od białka G doprowadziły do wprowadzenia nowej nazwy GPCRs: receptory 7TM (7 transmembrane receptors, receptory o siedmiu domenach transmembranowych). GPCRs są zbudowane z siedmiu hydrofobowych domen transmembranowych, wewnątrzkomórkowego końca karboksylowego oraz zewnątrzkomórkowego końca aminowego. Białka te wykazują dobrą homologię pod względem budowy domen transmembranowych. Największe zróżnicowanie obserwuje się w rejonie końca aminowego. Wiedza na temat budowy receptorów GPCR ma swoje źródło w badaniach nad strukturą krystaliczną rodopsyny wołowej. Jest to jedno z niewielu białek tej rodziny, którego strukturę zbadano technikami o wysokiej rozdzielczości. Rodopsyna występuje w dużych ilościach w siatkówce oka i wykazuje niezwykłą stabilność. Najnowsze badania dowodzą, że GPCR mogą tworzyć oligomery, co może być istotne dla aktywacji białka G [57]. Badania filogenetyczne pozwoliły wyróżnić pięć rodzin białek GPCR: rodzina receptorów glutaminergicznych, rodopsynopodobnych, adhezyjnych, frizzled/taste 2 i sekretynopodobnych. Od pierwszych liter rodzin powstała nazwa nowej klasyfikacji białek – GRAFS. Do rodziny glutaminergicznej zalicza się metabotropowe receptory glutaminergiczne (mGluR), receptory GABAB, receptor wrażliwy na wapń (CaSR) oraz receptory smakowe 1 (TAS1). Rodzina rodopsyny zawiera największą, bo liczącą 672, liczbę receptorów, charakteryzujących się pewnymi cechami wspólnymi, jak występowaniem motywów NSxxNPxxY oraz DRY (Asp-Arg-Tyr). Wyróżnia się ich cztery grupy: α, β, γ i δ. Grupa α została podzielona na podgrupy: prostaglandynową, aminową, podgrupę opsyn (podstawowa w odbieraniu wrażeń wzrokowych), melatoninową oraz MECA (np. receptory kanabinoidowe i adenozynowe). Wśród receptorów prostanoidów (prostaglandyn, tromboksanów i prostacyklin) zidentyfikowano cztery receptory prostaglandyny E (EP1-4), dwa receptory prostaglandyny D (DP, CRTH), jeden receptor prostaglandyny F, jeden receptor prostacykliny (IP) oraz jeden receptor tromboksanu A (TP) występujący w wariantach splicingowych α i β [41]. W skład podgrupy aminowej wchodzą bardzo istotne, z farmakologicznego punktu widzenia, receptory serotoninergiczne, dopaminergiczne, adrenergiczne, histaminowe i inne. Grupa β zawiera m.in. receptory tachykininy, neuropeptydu FF i cholecystokininy. Grupa γ składa się z trzech podgrup: SOG (somatostatin/opioid/galanin), MCH (melanin-concentrating hormone receptors) oraz podgrupy receptorów chemokinowych. W ostatniej grupie δ można wyodrębnić podgrupę receptorów związanych z MAS, glikoproteinową (receptory FSH, LH i  TSH), purynową (np. P2Y) oraz węchową. Przedstawicielami rodziny receptorów adhezyjnych są np. receptor antygenu CD97, lektomedyny i  mucynopodobne receptory zawierające moduł EGF (EMRs). Jedną z najpóźniej odkrytych rodzin jest rodzina receptorów frizzled/taste 2 składająca się z 36 przedstawicieli zebranych w dwie podgrupy: frizzled – uczestniczących w przekaźnictwie Wnt oraz taste 2 (TAS2), odpowiedzialnych za odczuwanie gorzkiego smaku. U człowieka znanych jest dziesięć receptorów frizzled (Frizzled 1-10) [86]. Receptory sekretynopodobne obejmują receptory glukagonu, hormonu uwalniającego kortykotropinę, kalcytoniny, parathormonu, sekretyny i innych peptydów [34].

Jak wspomniano wyżej, pobudzenie receptorów sprzężonych z białkami Gs lub Gi prowadzi odpowiednio do wzrostu lub obniżenia stężenia cAMP w komórce. Przykłady takich receptorów przedstawiono w tabeli 1. Zakres ligandów receptorów GPCR jest bardzo szeroki, są to: fotony, jony (Ca2+), aminy (noradrenalina, adrenalina, dopamina, serotonina, histamina), aminokwasy (glutaminian, GABA), lipidy (LPA, PAF, prostaglandyny, leukotrieny, amandamina, S1P), peptydy i białka (angiotensyna, bradykinina, trombina, bombezyna, FSH, LH, TSH, endorfiny) oraz inne organiczne cząsteczki (feromony, nukleotydy, opioidy i  kanabinoidy). Miejscem połączenia z ligandem może być koniec aminowy (szczególnie w  przypadku peptydów), domena transmembranowa lub sekwencja zewnątrzkomórkowa. Mimo znacznego zróżnicowania ligandów (tabela 1), receptory GPCR współdziałają z białkami G o znacznej homologii. Sugeruje to duże podobieństwo w zmianach konformacyjnych wywołanych aktywacją w obrębie części cytoplazmatycznej różnych receptorów. W  stosunkowo dobrze poznanym receptorze β2 -adrenergicznym połączenie noradrenaliny z domeną 5, 6 oraz 3 prowadzi do zbliżenia tych domen i ustabilizowania postaci receptora umożliwiającej interakcję z białkiem G. Szczegółowe badania wykazały, iż azot aminowy łączy się z Asp 113 w  domenie TM3, grupy hydroksylowe katecholu z serynami w TM5, zaś pierścień aromatyczny i grupa beta hydroksylowa odpowiednio z Phe 290 oraz Asn 293 w domenie TM6 [57]. Ważne znaczenie w interakcji lek- -receptor ma układ przestrzenny ligandów. Dowiedziono np, że enancjomer (-) adrenaliny obkurcza naczynia bardziej od enancjomeru (+), co tłumaczy się jego większym powinowactwem do receptora adrenergicznego β2 . Natomiast (R,R)-fenoterol łącząc się z receptorem β2 aktywuje podjednostki białka Gs (stymulującej aktywność AC), a jego stereoizomer (S,R) pobudza zarówno Gs , jak i Gi (podjednostkę hamującą aktywność AC), co przejawia się w jego słabszym działaniu [89]. Zjawisko to tłumaczy się występowaniem różnic konformacyjnych receptorów GPCR pod wpływem danego stereoizomeru [109], a jak wiadomo, aktywacja określonych podjednostek białek G zależy od przestrzennego ułożenia receptora. Modulacja allosteryczna odbywa się również w przypadku dimeryzacji czy oligomeryzacji receptorów. Za przykład może posłużyć receptor kanabinoidowy CB1: aktywacja pojedynczego receptora hamuje AC przez podjednostkę Gi , natomiast dimeryzacja z receptorem dopaminowym D2 czy opioidowym μ, promuje oddziaływanie z podjednostką Gs , co przejawia się wzrostem cAMP w komórce. Ponadto dimeryzacja CB1 z receptorem adrenergicznym β2 nasila oddziaływanie z podjednostką Gi i blokuje aktywację Gs [77].

Funkcja receptorów GPCR może być modulowana przez wiele czynników. Kinazy GRK fosforylują receptory GPCR prowadząc do osłabienia oddziaływania z białkiem G i nasilenia wiązania z arestynami – białkami kotwiczącymi, które mają zdolność inicjowania endocytozy receptora. Poszczególne receptory mogą mieć swoje własne mechanizmy regulacji, czego przykładem jest receptor parathormomu PTH1R. Aktywuje podjednostkę Gs , jednak w obecności czynnika regulującego wymianę Na+ -H+ (NHERF) dochodzi do preferencyjnej aktywacji Gq [83].

Enzymy uczestniczące w syntezie i degradacji cA

Cyklaza adenylowa

W  komórkach ssaków występuje dziewięć membranowych izoform cyklazy adenylowej (AC) oraz jedna rozpuszczalna (sAC, soluble AC). W  tabeli 2 zebrano dostępne dane na temat rozmieszczenia i przypuszczalnej ich funkcji. Izoformy enzymu związane z  błoną komórkową są zbudowane podobnie: składają się z  dwóch domen transmembranowych M1 i M2 oraz dwóch domen cytoplazmatycznych C1 i C2 . Domeny C są podzielone na podjednostki C1a, C1b, C2a, C2b. Podjednostki C1a i C2a zawierają centra katalityczne reakcji syntezy cAMP, zaś region C1b odgrywa rolę w regulacji funkcji enzymu. Główną rolę w aktywacji AC odgrywają podjednostki αs białka G (αs -krótka, αs -długa, αs -XL) [94]. Kompleks Gs -GTP łączy się z helisami α2’ i α3’ domeny C2 i spina ją z domeną C1 przez koniec aminowy. Zmiana konformacji zwiększa aktywność wszystkich związanych z błoną komórkową izoform cyklazy. Natomiast przedstawiciele rodziny Gi (Gi1, Gi2, Gi3, G0 i Gz ) hamują aktywność AC5 i 6, prawdopodobnie w wyniku rotacji domeny C1 w przeciwnym kierunku niż czynią to białka Gs [45,94] (ryc. 2).

Istnieją także inne mechanizmy regulacji aktywności AC. Ca2+/kalmodulina (Ca2+-CaM) stymuluje AC1 przez połą- czenie z C1b. Ca2+ związany z kalmoduliną aktywuje również izoformy 3 i 8, natomiast wolny kation hamuje AC5 i 6. Kinaza proteinowa C aktywuje AC2 przez fosforylację Thr 1057 [45], a kinaza proteinowa A hamuje pobudzoną izoformę 5 i 6 (regulacja zwrotna ujemna). Hamowanie każdej z izoform może zachodzić natomiast przez analogi adeninowe i adenozynowe (P-site inhibitors). Regulatorem aktywności cyklazy są również dimery Gβγ, które mają zdolność pobudzania izoformy 2, 4 i 7 (działanie synergistyczne w stosunku do Gs ) oraz hamowania AC1 i 8 (silna inhibicja znosząca skutki działania Gs , forskoliny czy Ca2+-CaM). Dimery te aktywują również postaci rozpuszczalne cyklazy, które jak wiadomo, nie są wrażliwe na podjednostki α białka G [45,94]. Wśród substancji stymulujących AC najbardziej znana jest forskolina. Ten diterpen, wyekstrahowany z pokrzywy indyjskiej Coleus forskohlii, ma zdolność pobudzania wszystkich związanych z błoną komórkową izoform AC, z wyjątkiem AC9 oraz postaci rozpuszczalnych. Mechanizm działania tego związku polega na łączeniu domeny C1 z C2 dzięki oddziaływaniom wodorowym i hydrofobowym w miejscu wiążącym forskolinę. Izoforma 9 jest niewrażliwa na działanie tego diterpenu z powodu innych właściwości hydrofobowych miejsca wiążącego, wynikających z zamiany Ser na Ala oraz Leu na Tyr [45,94]. Forskolina, dzięki zdolności do pobudzania syntezy cAMP, wywołuje wiele zmian w organizmie ssaków, takich jak: obniżenie ciśnienia krwi, rozszerzenie naczyń krwionośnych i oskrzeli, zwiększenie siły skurczów mięśnia sercowego, regulacja metabolizmu (nasilenie cyklu Krebsa, hamowanie syntezy lipidów i pobudzenie lipolizy) oraz modulacja układu immunologicznego [5]. Z  powodu słabej rozpuszczalności w wodzie oraz małej biodostępności, a także nieselektywnego działania wobec różnych izoform cyklazy adenylowej, forskolina nie jest powszechnie stosowana w lecznictwie. Natomiast jej pochodna, rozpuszczalna postać – kolforsyna została wprowadzona do terapii ostrej niewydolności serca w  Japonii [78]. Obecnie poszukiwane są związki selektywnie oddziałujące na poszczególne izoformy AC oraz charakteryzujące się takimi właściwościami farmakokinetycznymi, które zapewnią ich celowaną dystrybucję do tkanek efektorowych, co powinno ograniczyć występowanie działań niepożądanych. Z farmakologicznego punktu widzenia, obiecujące mogłyby być selektywne inhibitory izoformy AC5 w leczeniu bólu czy niewydolności serca oraz AC1 – w chorobach neurodegeneracyjnych [78]. Przykładowe aktywatory i inhibitory AC przedstawiono w tabeli 3.

Fosfodiesterazy

Fosfodiesterazy (PDE) kontrolują stężenie cAMP i cGMP przez degradację tych przekaźników. Niektóre z nich są swoiste tylko dla cAMP (PDE4, 7, 8) lub cGMP (PDE5, 6, 9), inne mają zdolność hydrolizy obydwu nukleotydów. Wyróżnia się 11 rodzin PDE, których przedstawiciele różnią się nie tylko powinowactwem do substratów, ale także strukturą, miejscem występowania oraz mechanizmem regulacji (tabela 4).

Centra aktywne wszystkich PDE składają się z konserwatywnych reszt aminokwasowych. Badania nad trójwymiarową strukturą domeny katalitycznej PDE4B2B ujawniły, że składa się z 17 helis tworzących 3 subdomeny. Na styku subdomen występuje hydrofobowa kieszeń zawierająca dwa jony metali, która prawdopodobnie jest centrum aktywnym enzymu [113]. Ważną rolę w swoistości substratowej odgrywa reszta glutaminy Q817. W przypadku PDE hydrolizujących cAMP reszta ta ustawiona jest inaczej, niż w przypadku enzymów katalizujących rozkład cGMP. W izoenzymach o podwójnej swoistości reszta glutaminy ma dużą swobodę ruchu i może ustawiać się tak, aby pasować zarówno do cAMP, jak i cGMP [7]. Enzymy rodziny PDE1 mają dwa miejsca wiążące Ca2+/kalmodulinę, której przyłączenie zwiększa szybkość hydrolizy cyklicznych mononukleotydów. PDE2 są allosterycznie stymulowane przez cGMP przyłączające się do domen GAF. Izoenzymy rodziny PDE3 mogą hydrolizować zarówno cAMP jak i cGMP, jednak in vivo cGMP hamuje ich zdolność rozkładu cAMP. Regulacja aktywności PDE3 zachodzi również w wyniku fosforylacji, w której uczestniczą kinazy proteinowe (PKA i PKB) [7,116]. Modulacja aktywności fosfodiesteraz jest waż- nym kierunkiem w poszukiwaniu nowych leków. Jako pierwsze do lecznictwa wprowadzono ich nieselektywne inhibitory, jakimi są metyloksantyny (kofeina, teofilina, teobromina, aminofilina czy pentoksyfilina). Ich działanie wynika nie tylko z hamowania rozpadu cAMP i cGMP w komórkach, ale również z antagonistycznego oddzia- ływania wobec receptorów adenozynowych. Cząsteczki tych leków wykazują zróżnicowane powinowactwo i siłę oddziaływania w stosunku do określonych rodzin fosfodiesteraz oraz receptorów adenozynowych, przez co mają odmienne właściwości farmakologiczne. Dla przykładu, teobromina jest stosowana w terapii przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc i  astmy oskrzelowej, ponieważ rozszerza oskrzela, hamuje proces zapalny i wykazuje działanie przeciwkaszlowe, pentoksyfilina znalazła zastosowanie w poprawie jakości życia pacjentów cierpiących na chromanie przestankowe, z powodu jej korzystnego działania na plastyczność erytrocytów, hamowania agregacji płytek krwi i zwiększania przepływu w naczyniach włosowatych. Aktywny metabolit pentoksyfiliny znany pod nazwą lizofilina, będący podobnie jak lek macierzysty inhibitorem PDE jest od kilku lat testowany pod kątem zapobiegania i leczenia cukrzycy typu 1, ze względu na jego zdolność hamowania uwalniania IL-12 oraz aktywacji czynnika transkrypcyjnego STAT4 w komórkach β trzustki.

Następnym etapem poszukiwań nowych leków w grupie inhibitorów PDE była synteza związków selektywnie hamujących daną rodzinę tych enzymów, co miało zwiększyć skuteczność i bezpieczeństwo terapii. Do lecznictwa włączono selektywne inhibitory PDE3: amrinon (stosowany w USA i Chinach), wesnarinon i olprinon (stosowane w Japonii) oraz milrinon (zarejestrowany również w Polsce – Corotrope). Leki te mają największe powinowactwo do izoformy 3A, co odpowiada za ich działanie sercowo-naczyniowe: powodują rozkurcz naczyń krwionośnych oraz zwiększają kurczliwość mięśnia sercowego. Stosowane są w krótkotrwałym leczeniu niewydolności serca [69]. W badaniach na zwierzętach wykazano także korzystne działanie olprinonu w zespole aspiracji smółki [68]. Lek ten zapobiegał obrzękowi płuc, obniżał liczebność neutrofilów w płucach oraz zmniejszał nasilenie stresu oksydacyjnego. Innym lekiem wprowadzonym do lecznictwa, który hamuje aktywność PDE3 jest cilostazol. Znalazł zastosowanie w terapii chromania przestankowego. Cilostazol hamuje agregację płytek krwi oraz zwiększa przepływ w drobnych naczyniach krwionośnych. Ponadto w warunkach eksperymentalnych wykazywał działanie przeciwkaszlowe [69].

Najsilniejsze działanie przeciwzapalne mają związki hamujące PDE4. Warto zaznaczyć, że wszystkie fosfodiesterazy tej rodziny, z wyjątkiem podrodziny 4C, są obecne w  komórkach immunologicznych, takich jak: limfocyty T i B, eozynofile, neutrofile i makrofagi oraz w  śródbłonku. Przedstawicielem pierwszej generacji związków selektywnie hamujących tę rodzinę enzymów jest rolipram. Cząsteczka ta, mimo korzystnego działania przeciwzapalnego, nie została wprowadzona do lecznictwa z  powodu częstych nudności i  wymiotów, które występowały po podaniu tego związku. Dlatego też opracowano inhibitory drugiej generacji, które wykazują podobne powinowactwo do obu miejsc wiążących na cząsteczce PDE4, przez co nie wywołują działań niepożądanych. W tej grupie nowych związków znalazły się roflumilast i cilomilast. Pierwszy został zarejestrowany do stosowania w terapii przewlekłej obturacyjnej choroby płuc. Wykazuje działanie przeciwzapalne podobne do teofiliny, ale nie bronchospazmolityczne, przy czym charakteryzuje się lepszym profilem bezpieczeństwa i nie wymaga monitorowania stężenia we krwi. Natomiast cilomilast był testowany w badaniach klinicznych (faza III), ale do tej pory nie został zarejestrowany [69]. Ważną rodziną fosfodiesteraz kontrolujących stężenie cAMP w komórkach immunologicznych są także PDE7. W badaniach in vitro wykazano przeciwzapalne działanie inhibitora PDE7, przez hamowanie aktywności monocytów, makrofagów oraz limfocytów CD8+ [93]. Jednak w badaniach na zwierzętach obserwowano stosunkowo słabą ich aktywność farmakologiczną stosowanych w monoterapii i zaproponowano łączne podawanie inhibitorów PDE7 i PDE4, celem zwiększenia efektywności i bezpieczeństwa leczenia w wyniku stosowania mniejszych dawek [31]. Skuteczność łącznego podawania leków hamujących poszczególne rodziny PDE jest obecnie obiektem prowadzonych badań na całym świecie. Poszukiwane są tzw. podwójne inhibitory, a proponowane połączenia to: PDE3/4 oraz PDE4/7 [36].

Efektory cA

Kinaza proteinowa A

Głównym wewnątrzkomórkowym efektorem cAMP jest kinaza proteinowa A (PKA). Jest to enzym zbudowany z dwóch podjednostek katalitycznych (C) oraz z dwóch podjednostek regulatorowych (R). Wyróżnia się dwa izoenzymy: PKAI oraz PKAII. Wśród podjednostek katalizujących i regulatorowych obserwuje się dobrą heterogenność (RIα, RIβ, RIIα, RIIβ, Cα, Cβ, Cγ). Co więcej, odkrywane są nowe warianty splicingowe, co jeszcze bardziej pogłębia zróżnicowanie budowy podjednostek. Podjednostka katalityczna zawiera niewielką domenę przy końcu aminowym, zbudowaną głównie z β nitek, odpowiedzialną za przyłączanie ATP oraz dużą domenę złożoną z helis, znajdującą się przy końcu karboksylowym, odpowiedzialną za wiązanie substratu białkowego. Jednostka regulatorowa ma dwa miejsca wiążące cAMP, domenę D/D wiążącą białka AKAP oraz miejsce wiążące podjednostkę katalityczną. Nieaktywna postać PKA występuje jako tetramer. Wzrost stężenia wewnątrzkomórkowego cAMP powoduje dysocjację podjednostek katalitycznych i  jednoczesne uaktywnienie enzymu. Białka kotwiczące kinazę A (AKAP) umiejscawiają PKA w pobliżu substratów enzymu, tworząc mikrodomeny sygnalizacji zależnej od cAMP. PKA może fosforylować białka zawierające motyw arginina-arginina-X-seryna/ treonina, gdzie X jest aminokwasem hydrofobowym. Reszta fosforowa jest przyłączana do seryny lub treoniny [97]. Lista białek regulowanych przez PKA jest bardzo długa i obejmuje kilka podstawowych grup, takich jak:

• enzymy uczestniczące w metabolizmie, np. lipaza hormonowrażliwa, syntaza glikogenu i kinaza fosforylazy,

• kanały potasowe, np. kanał potasowy zależny od ATP,

• kanały jonowe bramkowane ligandem, np. GABA, AMPA i NMDA,

• białka odpowiedzialne za apoptozę, np. Bad,

• histony, np. H1c i H3,

• regulatory transkrypcji, np. białko wiążące się z elementem odpowiedzi na cAMP (CREB), czynnik jądrowy κB, czynnik jądrowy aktywowanych komórek T3,

• fosfolipazy,

• białka uczestniczące w ścieżce sygnałowej cAMP, np. receptor β2 -adrenergiczny, receptor dopaminowy D1 oraz fosfodiesterazy PDE4D3 i PDE3B [92].

Dotąd poznano kilka aktywatorów i inhibitorów PKA, są to związki stosowane jedynie w badaniach eksperymentalnych. Do najważniejszych inhibitorów PKA należą: H89 i KT5720, które silnie i selektywnie hamują PKA, przyłączając się do jej podjednostki katalitycznej [70]. Aktywacja PKA może natomiast nastąpić pod wpływem analogów cAMP, np. 6-Bnz-cAMP [11].

Białka Epac

Oprócz PKA odkryto także inne efektory cAMP, np. wymieniacze cGMP zależne od cAMP (Epac, the exchange protein activated by cAMP). Są to białka łączące się z cAMP i aktywujące małe GTPazy Rap1 i Rap2. Istnieją dwie izoformy Epac: Epac1 i Epac2. Obie mają N-końcowy fragment regulatorowy oraz C-końcowy region katalityczny. Białka Epac biorą udział w adhezji, regulacji połączeń międzykomórkowych, egzocytozie, proliferacji, apoptozie, ekspresji genów i fagocytozie. Epac i  PKA mogą działać niezależnie lub synergistycznie stymulując pewne funkcje lub wywoływać przeciwne działania w zależności od umiejscowienia i otoczenia wewnątrzkomórkowego [17]. W ostatnich latach otrzymano swoisty analog cAMP – 8-(4-chloro-fenyltio)-2’- O-metyloadnenozyno-3’,5’-cykliczny monofosforan (8-pCPT-2’-O-Me-cAMP), który okazał się użytecznym narzędziem w badaniach nad Epac [9].

Kanały zależne od cAMP

cAMP ma również zdolność łączenia się z kanałami jonowymi bramkowanymi cyklicznymi nukleotydami (CGN) modulując ich funkcję. Białka te składają się czterech podjednostek, które są kodowane przez sześć różnych genów: CNGA1, CNGA2, CNGA3, CNGA4, CNGB1 i CNGB3. Na przykład kanały w pręcikach siatkówki składają się z trzech podjednostek CNGA1 i jednej podjednostki CNGB1. Poza siatkówką, CGN występują także w węchowych neuronach receptorowych, mózgu, sercu, nerkach i gonadach. Mają zdolność reagowania zarówno z cAMP, jak i z cGMP, mogą się różnić jednak selektywnością ligandową. CGN przepuszczają nieselektywnie jony sodowe, potasowe, wapniowe i magnezowe. Wapń stymuluje kinazy zależne od Ca2+-CaM i zwrotnie reguluje stężenie cAMP [88]. Ciekawą cechą CGN jest brak występowania zjawiska odwrażliwiania receptorów wobec stałej obecności liganda [55].

Rola cAMP w odpowiedzi zapalnej i nocycepcji

Zapalenie jest złożonym, dynamicznym i uporządkowanym procesem zachodzącym w  żywych tkankach, w odpowiedzi na bodziec uszkadzający (zewnątrz- lub wewnątrzpochodny). Prowadzi do uruchomienia wrodzonych oraz nabytych mechanizmów odporności, których celem jest neutralizacja i usunięcie czynnika sprawczego i naprawa uszkodzonych tkanek. Przebieg procesu zapalnego zależy nie tylko od aktywności leukocytów, które kumulują się w miejscu uszkodzenia, ale również od działania innych komórek i tkanek, takich jak: płytki krwi, śródbłonek, fibroblasty, czy mikroglej.

Jak wykazują liczne badania, główną rolę w odporności wrodzonej oraz regulacji odporności nabytej odgrywa ścieżka sygnałowa receptora Toll-podobnego (TLR). Receptor TLR aktywowany przez ligand (LPS, lipopolisacharyd) przekazuje sygnał przez molekuły MyD88 oraz TRIF. Powoduje to aktywację czynników transkrypcyjnych NF-κB oraz IRF3, co zwiększa transkrypcję cytokin prozapalnych (TNF-α, IL-6, IL-12). Natomiast IL-10 hamuje indukcję cytokin prozapalnych wywołaną przez LPS, z  udziałem czynnika transkrypcyjnego STAT3. Czynniki, takie jak prostaglandyna E2, histamina, pozakomórkowy ATP, wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP) oraz przysadkowy peptyd aktywujący cyklazę adenylową (PACAP) zwiększają wewnątrzkomórkowe stężenie cAMP i tym samym blokują odpowiedź na LPS. cAMP może zwiększać ekspresję IL-10, ale znane są też inne mechanizmy regulacji odpowiedzi zapalnej przez ten przekaźnik. Wykazano, że wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia cAMP nasila ekspresję c-Fos, a stymulacja LPS zwiększa aktywność kinazy IKKβ, która stabilizuje strukturę c-Fos. c-Fos blokuje przyłączenie się białka p65 (członka rodziny NF-κB) do regionu promotorowego TNF-α hamując tym samym jej ekspresję [58]. Ponadto cAMP hamuje aktywację receptora TCR/CD3 na limfocytach T przez ścieżkę zależną od PKA. Odkryto, iż PKA aktywuje kinazę Csk, która blokuje aktywność kinazy Lck. Lck odpowiada za fosforylację łańcucha ζ obecnego w  receptorze TCR/CD3 i  tym samym aktywację limfocytów T [104]. W innej pracy wykazano supresyjne działanie cAMP na limfocyty T przez aktywację transkrypcji antygenu CTLA4 zależną od drogi cAMP/PKA/ CREB. CTLA4 wiąże CD80 lub CD86 i w ten sposób blokuje sygnały stymulujące aktywność tych komórek immunologicznych. Prowadzi to do hamowania progresji cyklu komórkowego i wytwarzania IL-2 [62].

W  badaniach in vitro prowadzonych na monocytach dodatek selektywnego aktywatora PKA (6-Bnz-cAMP) powodował blokowanie wydzielania TNF-α, IL-12 oraz chemokiny MIP-1β [11]. Hamowanie wydzielania cytokin, a zwłaszcza TNF-α, dodatkowo zmniejszało przepuszczalność naczyń, która jest stwierdzana podczas zapalenia. Podobnie, w badaniach in vivo dowiedziono, że leki zwiększające stężenie cAMP, znacznie osłabiają indukowaną podaniem LPS przepuszczalność włośniczek [48].

Inne efektory cAMP, jakim są białka Epac zdają się odgrywać rolę w hamowaniu wydzielania interferonu-β, regulacji adhezji przez integryny αLβ2 i αLβ4, sterowaniu procesem apoptozy limfocytów B, adhezji do fibronektyny oraz migracji monocytów [39]. Cykliczny AMP reguluje także proces fagocytozy. Dowiedziono, iż wzrost cAMP działa hamująco na fagocytozę zachodzącą przez receptory zmiatacze (scavenger receptors), receptory Fcγ oraz zależne od opsoniny receptory dopełniacza. Badania ostatnich lat wykazują supresyjny wpływ cAMP na uwalnianie reaktywnych form tlenu w komórkach żernych, osłabiając ich zdolność do zabijania drobnoustrojów [91]. Makrofagi, w których doszło do wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia cAMP w wyniku oddziaływania prostaglandyny PGE2 na receptory EP2 oraz EP4 (silniejsze pobudzenie AC) były niezdolne do fagocytozy bakterii szczepu Clostridium sordelli w badaniach in vitro. Zjawisko to prawdopodobnie jest odpowiedzialne za rozwój wstrząsu toksycznego u kobiet po porodzie, u których doszło do infekcji szczepem tej bakterii. Obecna w macicy kobiet ciężarnych PGE2 hamuje aktywność makrofagów, a więc pierwszą linię obrony przed tym drobnoustrojem [84]. Ponadto dowiedziono, że fosfokinaza PKA aktywowana cAMP bezpośrednio lub pośrednio (przez aktywację innej kinazy) nasila przeciwzapalne działanie glikokortykosteroidów, zarówno w komórkach immunologicznych, jak i śródbłonku, mięśniówce gładkiej czy fibroblastach. Działanie to jest złożone i wynika m.in. ze wzrostu stabilności receptora glikokortykosteroidowego (GR) oraz z jego zwiększonej translokacji do jądra komórkowego wskutek fosforylacji seryny w części regulatorowej N-końca tego receptora. Prowadzi to do wzrostu wydajności transkrypcji białek przeciwzapalnych. Zjawisko to jest powszechnie wykorzystywane w leczeniu astmy przez łączenie glikokortykosteroidów z β2 -mimetykami, które zwiększają wewnątrzkomórkowe stężenie cAMP [99].

Jak wykazują badania, cAMP jest głównym przekaź- nikiem w  procesie nocycepcji, również w  przebiegu zapalenia. Zaobserwowano, że wzrost stężenia cAMP w neuronach zwiększa odczuwanie bólu, a leki obniżające poziom tego nukleotydu w komórkach nerwowych wykazują działanie analgetyczne [78]. Głównymi czynnikami aktywującymi cyklazę adenylową w neuronach obwodowych są prostaglandyny (w  tym PGE2 przez receptor EP2 i EP4 czy PGI przez receptor IP), uwalniane w dużych ilościach w miejscu zapalenia. Badania wykazują, iż aktywacja receptorów związanych z białkiem Gs w zakończeniu pierwotnego włókna afferentnego, prowadzi do wzrostu pobudliwości tych neuronów, głównie w wyniku fosforylacji kanałów sodowych TTX-R INa czy kanałów jonowych bramkowanych ligandem TRPV1 przez PKA zależną od cAMP [8,27]. Ponadto przewodzenie sygnałów bólowych przez obwodowe komórki nerwowe nasila mechanizmy zależne od kinazy PKC, która zostaje pobudzona działaniem białek EPAC [44]. cAMP jest ważnym przekaźnikiem uczestniczącym nie tylko w transmisji bólu, ale również w powstawaniu i utrzymywaniu zjawiska nadwrażliwości bólowej. W rogach tylnych rdzenia kręgowego dochodzi do przekazania sygnału bólowego z neuronu obwodowego na neuron II rzędu. Wzrost stężenia cAMP w komórce nerwowej II rzędu aktywuje PKA, co pobudza (prawdopodobnie pośrednio przez fosfatazę STEP61) kinazę Fyn, która fosforyluje tyrozynę (Tyr 1472) w podjednostce GluN2B receptora NMDA, w wyniku czego dochodzi do odłączenia się białka AP-2 (odpowiedzialnego za internalizację receptora) i przyłączenia się receptorów do błony postsynaptycznej. Pojawienie się tych receptorów w błonie postsynaptycznej w rogach tylnych rdzenia kręgowego odpowiada za zjawisko hiperalgezji [115]. Tak więc leki przeciwbólowe, stosowane w bólu zapalnym to przede wszystkim związki obniżające stężenie cAMP w neuronach. Są to obwodowo działające niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSAIDs), które hamują wytwarzanie prostaglandyn (w tym najsilniej działającą PGE2) oraz opioidy, których receptory znajdują się zarówno w obwodowym, jak i centralnym układzie nerwowym, a których aktywacja hamuje aktywność cyklazy adenylowej (z udziałem białka Gi ).

Rola cAMP w apoptozie komórek

Apoptoza to naturalny proces związany z programowaną śmiercią komórki w organizmach wielokomórkowych. Odgrywa także rolę w przebiegu procesów chorobowych, takich jak sepsa i wstrząs septyczny [53]. Zarówno w eksperymentalnych modelach sepsy u zwierząt, jak i u krytycznie chorych obserwowano zwiększoną apoptozę w organach limfatycznych i niektórych tkankach parenchymalnych. U pacjentów, którzy zmarli z powodu sepsy stwierdzono nasiloną apoptozę w śledzionie, węzłach limfatycznych, jelicie grubym i krętym [43]. Jak wiadomo, główną rolę w procesie apoptozy odgrywają proteazy cysteinowe, zwane kaspazami [47]. Wyniki badań ostatnich lat dowodzą, że spośród wielu czynników, także cAMP może brać udział w kontrolowaniu apoptozy [107]. Jeden z mechanizmów tego działania jest związany z peptydem podobnym do glukagonu-1 (GLP-1) wytwarzanym przez jelitowe komórki L, który działa przez receptor sprzężony z białkiem G. Badania mające na celu określenie wpływu GLP-1 na stres oksydacyjny i apoptozę w mikronaczyniowych komórkach śródbłonkowych serca w warunkach hiperglikemii wykazały, że analog GLP-1 działając hamująco na ekspresję Rho i ROCK (regulatorów stresu oksydacyjnego) przez mechanizm zależny od cAMP i  PKA, obniżał poziom wolnych rodników w komórkach. Komórki hodowane w obecności analogu GLP-1 wykazywały mniejszy stopień apoptozy (badany metodą TUNEL) oraz cechowały się obniżoną ekspresją kaspazy-3 [107]. Miller i wsp. podjęli próbę wyjaśnienia mechanizmu hamowania apoptozy w komórkach kanalików zbiorczych nerek przez wazopresynę. W obecności 1-dezamino-8-D-arginino wazopresyny (dDAVP) markery apoptozy ulegały obniżeniu w mysiej linii komórek kanalików zbiorczych poddanych działaniu czynników proapoptotycznych (staurosporyny, aktynomycyny D i cykloheksymidu). Działanie zostało zablokowane przez dodatek antagonisty receptora V2. Inkubacja komó- rek z analogiem cAMP (8-cpt-cAMP) obniżyła poziom apoptozy, a  dodatek selektywnego aktywatora EPAC doprowadził do wzrostu aktywnych kaspaz. Sugeruje to występowanie przeciw- i proapoptotycznego działania cAMP w tej samej komórce, przy czym nasilenie skutku przeciwapoptotycznego było znacznie większe. Wykazano, że wazopresyna hamuje apoptozę przez receptor V2, aktywację PKA i fosforylację Bad i Bok [66]. Aktywacja receptora β-adrenergicznego wywoływała apoptozę w  komórkach mysiej linii chłoniaka T-limfatycznego S49 zależnie od białka Gs i  PKA. Nadekspresja Bcl-2 niwelowała apoptozę zależną od cAMP w tych komórkach [114]. W komórkach linii ostrej białaczki limfoblastycznej (podtyp B komórkowy) forskolina hamowała proapoptotyczny wpływ promieniowania jonizującego przez obniżenie stężenia przeciwnowotworowego białka p53. Nie dochodziło do indukcji białek Puma i Bax, niezbędnych do aktywacji kaspaz [71]. Wyniki te nie znalazły potwierdzenia w badaniach innych autorów, które wskazują, że cAMP może podnosić poziom spontanicznej apoptozy i potęguje proapoptotyczny potencjał chlorambucylu w komórkach przewlekłej białaczki B-limfocytowej [64]. Nowo odkryty mechanizm stawia więc pod znakiem zapytania możliwość wprowadzeniem czynników indukujących cAMP w  terapii przeciwnowotworowej [71]. W  komórkach białaczkowych cAMP stymuluje białka HDAC i SIRT1, które utrzymują p53 w stanie hipoacetylacji. Ułatwia to interakcję p53 z ligazą ubikwitynową HDM2 i przyspiesza eliminację p53. Sugeruje się możliwość terapeutycznego zastosowania inhibitorów deacetylaz histonowych u chorych na ostrą białaczkę limfoblastyczną [56]. Najnowsze badania wykazały, iż resolwina D1 (mediator lipidowy syntezowany z kwasu dokozaheksaenowego, działający przez GPCR) hamuje apoptozę w makrofagach uczestniczących w przeciwbakteryjnej odpowiedzi zapalnej. Resolwina aktywuje PKA, co prowadzi do zahamowania oksydazy NADPH i wzrostu ekspresji białek Bcl-xl oraz Bcl-2, skutkując blokowaniem apoptozy [61]. W neutrofilach cAMP wykazuje działanie przeciwapoptotyczne niezależnie od PKA [38]. Działanie cAMP przez PKA w większości przypadków przyspiesza proces apoptozy, zaś aktywacja Epac hamuje śmierć komórki. Nie jest to jednak sztywną regułą [47]. Selektywna aktywacja Epac blokuje apoptozę wywołaną TNF-α oraz cykloheksymidem i staurosporyną w ludzkich liniach monocytarnych [38], choć istnieją doniesienia o udziale tego białka w nasilaniu apoptozy. PKA również nie ma jednoznacznego działania proapoptotycznego. Odkryto, iż PKA może wpływać na aktywność kinazy Akt, powiązanego z dynaminą białka 1 oraz kinazy PI3, spowalniając tym samym śmierć komórki [47].

Rozmieszczenie cAMP w komórce – koncepcja kompartmentalizacji

Jak już wspomniano, cAMP jest syntetyzowany przez związaną z  błoną komórkową cyklazę adenylową po wpływem różnych związków, które mogą aktywować receptory sprzężone z  białkiem G. Mimo to, że jest cząsteczką, która przenika przez błony biologiczne, jej dystrybucja wewnątrz komórki jest raczej ograniczona z powodu szybkiego rozkładu przez PDEs. Zaobserwowano, że pobudzenie wielu rodzajów receptorów GPCR prowadzi do podobnego wzrostu stężenia cAMP w komórce, lecz może wywoływać bardzo różne skutki. Okazuje się, że stężenia cAMP często różni się w poszczególnych przestrzeniach (kompartmentach) wewnątrzkomórkowych, co możliwe jest dzięki nierównomiernemu rozmieszczeniu białek odpowiadających za syntezę i rozkład tego przekaźnika. Szczególnie ważną rolę odgrywają tu PDEs, które nie dopuszczają do dyfuzji cAMP w miejsca niepożądane, tworząc pewnego rodzaju przestrzenny gradient stężeń cyklicznego AMP. Nierzadko enzymy regulujące stężenie cAMP oraz białka efektorowe położone są blisko siebie i  formują kompleksy z udziałem białek kotwiczących [26].

Rozwój nowych technik mikroskopii fluorescencyjnej wykorzystującej zjawisko transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (fluorescence resonance energy transfer – FRET) umożliwił obrazowanie gradientów stężeń cAMP oraz precyzyjne określenie umiejscowienia konkretnych białek wewnątrz żywej komórki. FRET to zjawisko występujące, gdy dwa fluorofory (zazwyczaj białka o fluorescencji cyjanowej i żółtej) są umiejscowione blisko siebie oraz gdy widmo emisji pierwszego fluoroforu pokrywa się z widmem absorpcji drugiego. Podczas pobudzenia pierwszego fluoroforu (donora) dochodzi do emisji charakterystycznej długości fali elektromagnetycznej. Fala pobudza drugi fluorofor (akceptor), co powoduje emisję akceptora. Zjawisko to można wykorzystać do badania zmian konformacyjnych białek oraz rozszczepienia holoenzymu na podjednostki [26]. Z użyciem tej techniki wykazano, iż pobudzenie receptorów β-adrenergicznych prowadziło do pojawienia się odrębnych mikrodomen o dużym stężeniu cAMP, aktywującego PKA. Dodatek nieswoistego inhibitora PDEs zaburzył gradienty stężeń cAMP, co nasuwa przypuszczenie, iż PDEs odpowiadają za wyznaczanie granic przestrzennych „chmur” cyklicznego AMP [117].

Dzięki sondom FRET odkryto, iż PKAI i PKAII łączą się z  odmiennymi białkami AKAP w  różnych miejscach w komórce miocytu. Ponadto wykazano, że odmienne izoformy PDE uczestniczą w  regulacji stężenia cAMP w pobliżu obu typów PKA. Stymulacja różnych receptorów GPCR może zmieniać stężenia cAMP w różnych kompartmentach komórki. Dla przykładu, działanie izoproterenolu na receptory β spowodowało powstawanie cAMP w kompartmencie PKAII, podczas gdy stymulacja receptorów prostaglandynowych wywoływała wzrost cAMP w obszarach występowania PKAI [24].

W miocytach serca receptory β1 oraz β2 współdziałają z białkiem Gs , jednak ich selektywna stymulacja prowadzi do odmiennych odpowiedzi. Aktywacja receptora β2 związana jest z fosforylacją białek kurczliwych przez PKA oraz może, w pewnych warunkach, prowadzić do przerostu mięśnia sercowego i  apoptozy. Za pomocą technik wykorzystujących FRET ustalono, że receptory β2 są umiejscowione w  pobliżu tubuli poprzecznych miocytów. W komórkach pochodzących z serc szczurów cierpiących na przewlekłą niewydolność mięśnia sercowego zaobserwowano redystrybucję receptorów β2 z tubul poprzecznych, co skutkowało szerszym i mniej ograniczonym przestrzennie wzrostem wewnątrzkomórkowego stężenia cAMP [72]. Swoiste dla mięśnia białko kotwiczące kinazę A (mAKAP) jest rusztowaniem dla kompleksu białek odpowiedzialnych za przekazywanie sygnału z receptora adrenergicznego w miocycie. mAKAP łączy się bezpośrednio z AC5, PKA, PDE4D3, receptorem rianodynowym oraz fosfatazami PP2B i PP2A tworząc układ regulujący stężenie cAMP na zasadzie sprzężenia zwrotnego ujemnego [25]. Odkryto wiele innych białek kotwiczących, które umiejscawiają PKA w pobliżu ich substratów. Białka Yotiao, AKAP15/18δ oraz AKAP79/150 ułatwiają fosforylację odpowiednio kanału potasowego KCNQ1, fosfolambanu oraz kanałów wapniowych typu L [26].

Innym aspektem przestrzennej organizacji przekaźnictwa przez cAMP jest internalizacja receptorów GPCR. Okazuje się, że endocytoza receptora wcale nie musi się wiązać z przerwaniem jego funkcji. Receptor parathormonu (PTHR) może być aktywowany przez parathormon (PTH) lub peptyd PTH-podobny (PTHrP). Po aktywacji przez PTH receptor ulega internalizacji, lecz dalej wysyła sygnał docierający w głąb komórki. Aktywacja przez PTHrP prowadzi do wzrostu cAMP jedynie przy powierzchni błony komórkowej [30]. Jak wykazano, różne izoformy Epac są umiejscowione w osobnych kompartmentach komórki: np. Epac1 znajduje się w pobliżu mitochondriów, Epac2A przy błonie cytoplazmatycznej, a Epac2B w cytosolu (opisano w [26]). Istotną rolę w przestrzennym umiejscowieniu Epac odgrywają białka ERM (ezrin/radixin/moesin) [10]. Wiele uwagi w ostatnich latach poświęca się wyjaśnieniu mechanizmu dzia- łania cAMP na przepuszczalność bariery śródbłonkowej płuc. Odkryto, iż cAMP działając poprzez Epac lub PKA w  pobliżu błony komórkowej zwiększa integralność bariery, a przenikanie przekaźnika w głąb cytoplazmy uruchamia mechanizmy zależne od PKA, które zmieniają układ mikrotubul, zwiększając przepuszczalność tej bariery [81].

Zewnątrzkomórkowa ścieżka sygnałowa cAMP i jego transport na zewnątrz komórki

Wyniki badań przeprowadzonych na hodowlach tkankowych komórek mięśni szkieletowych szczura wskazują na istnienie ścieżki enzymatycznej odpowiedzialnej za pozakomórkowy rozkład cAMP [18]. Aktywacja AC za pomocą różnych stężeń forskoliny (1-300 mM) w obecności nieselektywnego inhibitora PDE – IBMX prowadziła do wzrostu stężenia pozakomórkowego cAMP proporcjonalnie do wzrostu stężenia wewnątrzkomórkowego tego nukleotydu po 30 min inkubacji. Stężenia pozakomórkowe wahały się w granicach 16,4-23,9% całkowitego stężenia cAMP. Jak wykazano, zewnątrzkomórkowy cAMP jest rozkładany za pomocą PDE znajdującej się po zewnętrznej stronie błony komórkowej. Co więcej, powstający w wyniku tej reakcji 5’-AMP ulega dalszej przemianie do adenozyny. Obecność zewnątrzkomórkowych PDE wykazano in vitro w wielu komórkach i tkankach, np.: w wątrobie, limfocytach, neuronach, adipocytach i komórkach nerkowych [18].

Dodatek inhibitora transporterów – probenecydu do hodowli tkankowych komórek mięśni szkieletowych powoduje zahamowanie zewnątrzkomórkowego wzrostu stężenia cAMP indukowanego obecnością izoprenaliny i forskoliny [18]. Jak wykazano, transport cAMP na zewnątrz komórki odbywa się z udziałem dwóch transporterów z rodziny MRP (multidrug resistance proteins) – MRP4 i 5 (ABCC4 i ABCC5) [87]. MRP4 transportuje ponadto PGE1 i PGE2, a transport ten ulega wysyceniu (KM wynosi odpowiednio 3,2 i 3,4 M) i może ulec zahamowaniu pod wpływem m.in. indometacyny i ibuprofenu [82]. Zarówno MRP4, jak i MRP5 należą do rodziny ABC (ATP-binding cassette) i mogą transportować wiele substancji egzo- i endogennych wbrew gradientowi stężeń, dzięki energii uzyskanej z hydrolizy ATP. Badania wykazały, że transportery te mają także znaczne powinowactwo do cGMP [49,60,103]. Występują w wielu narządach i tkankach, przy czym MRP5 nie występuje w oku. Największą ekspresję MRP4 obserwowano w nerce i sterczu, nieco mniejszą w wątrobie, jądrach, jajnikach, płucach, nadnerczach, neuronach i komórkach krwi, takich jak: ludzkie erytrocyty, płytki krwi i limfocyty [74]. Zjawisko aktywnego transportu cAMP z komórki pod wpływem np. stymulacji hormonalnej obserwowano w wielu badaniach in vitro. Na przykład dodatek glukagonu do perfuzatu wątroby szczura, czy podanie parathormonu w postaci wlewu dożylnego zdrowym osobnikom powodowały wzrost stężenia cAMP odpowiednio w perfuzacie i moczu badanych osobników [87]. Podanie parathormonu w większej dawce (40 mU/kg m.c./min) prowadziło do niewielkiego wzrostu cAMP także w osoczu. Podobny skutek występował w komórkach zwoju szyjnego, perfundowanym sercu, komórkach tłuszczowych i retikulocytach w obecności agonisty receptora β [87].

cAMP jako marker odpowiedzi na lek

Wyniki badań dowodzą, że po podaniu leków modulujących poziom cyklicznego AMP, stężenie tego nukleotydu ulega zmianom we krwi i/lub tkankach zwierząt. Dla przykładu, po podaniu nowego inhibitora PDE4, CP-80,633 myszom drogą dożołądkową stwierdzono istotny, zależny od dawki wzrost stężenia cAMP w osoczu w krótkim czasie. Ponadto u myszy z indukowaną podanym dootrzewnowo LPS sepsą, CP-80,633 hamował syntezę TNF-α, a działanie to również nasilało się wraz ze wzrostem dawki [16]. Natomiast po podaniu kortykosteroidu szczurom obserwowano wzrost stężenia cAMP w  wątrobie [51]. Autorzy tej pracy, testując różne modele farmakokinetyczno-farmakodynamiczne wykazali, że wzrost stężenia cAMP w tkance wątrobowej jest wynikiem hamującego działania kompleksu lek-receptor w jądrze komórkowym na proces degradacji cAMP. Po podaniu dożylnie jednorazowej dawki 10 i 50 mg/kg metyloprednizolonu obserwowano wzrost stężenia tego nukleotydu odpowiednio z 654 do 883 oraz z 656 do 951 pmol/g wątroby. Stężenie maksymalne cAMP obserwowano 6 h od chwili podania kortykosteroidu. Podczas podawania metyloprednizolonu w postaci wlewu ze stałą szybkością 0,1 i 0,3 mg/kg/h za pomocą wszczepionych podskórnie pomp osmotycznych, w ciągu 24 h stężenie cAMP wzrosło z 278 do 2671 i 2716 pmol/g wątroby po podaniu odpowiednio niskiej i wysokiej dawki leku. Po kilku dniach trwania wlewu obserwowano obniżenie stężenia cAMP, co może wskazywać na wystąpienie zjawiska tolerancji na podawany lek.

Wyniki wstępnych badań prowadzonych w naszym laboratorium wskazują, że stężenia cAMP mogą wzrastać pod wpływem leków modulujących poziom tego nukleotydu tylko w wybranych tkankach. Na przykład po podaniu dożylnie nieselektywnego inhibitora fosfodiesterazy – pentoksyfiliny szczurom w dawce 80 mg/kg obserwowano istotny wzrost stężenia cAMP w osoczu w krótkim czasie, tj. po 15 min od chwili podania leku, a stężenie maksymalne występowało między 30 a 60 min (ryc. 3). Natomiast zmiany w stężeniach cAMP w wątrobie, nerce i płucach po upływie 1 i 4 h od chwili podania badanego leku były znacznie mniejsze. Podana w tej samej dawce cyprofloksacyna spowodowała ponad trzykrotny wzrost stężenia tego nukleotydu, ale tylko w płucach zwierząt [wyniki nieopublikowanych badań własnych]. Obserwowany wzrost cAMP w płucach po podaniu cyprofloksacyny był prawdopodobnie spowodowany aktywacją receptora EP2, którego ekspresja w tym narządzie jest wysoka.

Jak już wspomniano, cykliczny AMP może hamować ekspresję prozapalnych cytokin, m.in. przez czynnik transkrypcyjny NF-κB [67]. Istnieją doniesienia, które dowodzą, że występuje korelacja między hamowaniem aktywności PDE a supresją wytwarzania TNF-α po stymulacji LPS komórek jednojądrzastych otrzymanych z krwi zdrowych ochotników. W  badaniach tych wykazano liniową zależność między wartościami IC50 dla hamowania PDE i TNF-α w obecności inhibitorów PDEs, pochodnych 3,7-dimetyloksantyny, takich jak: pentoksyfilina, jej hydroksylowa pochodna – lizofilina oraz wybranych pochodnych 3-metyloksantyny [90]. Wyniki wcześniejszych badań przeprowadzonych w naszym laboratorium wykazały, że pentoksyfilina i lizofilina w sposób zależny od dawki obniżały stężenia TNF-α u myszy z indukowaną LPS endotoksemią w surowicy [111] i, w mniejszym stopniu, tkankach badanych zwierząt [112]. Może to dowodzić, że jednym z  głównych mechanizmów działania przeciwzapalnego pochodnych metyloksantyny jest zwiększenie stężenia cAMP w tkance.

Podobne obserwacje odnoszą się do leków będących agonistami GPCRs [29]. Po podaniu adrenaliny we wlewie kroplowym trwającym 30 min zaobserwowano wzrost stężenia cAMP w  osoczu pacjentów chirurgicznych i  zdrowych ochotników już po 20 min od rozpoczęcia wlewu. Obserwowane działanie może wynikać z pobudzenia receptorów β2 -adrenergicznych obecnych w róż- nych narządach i tkankach (tabela 1) oraz na powierzchni komórek krwi, takich jak: erytrocyty (a zwłaszcza retikulocyty), leukocyty, limfocyty T i B oraz makrofagi. Inne receptory sprzężone z  białkiem Gs , czyli pobudzające cyklazę adenylową, które występują na powierzchni elementów morfotycznych to m.in.: receptory EP2 i EP4, adenozynowe A2A, czy receptor IP [32,85].

Jak omówiono wcześniej, wiele inhibitorów PDE było lub jest obecnie testowanych w badaniach przedklinicznych lub klinicznych pod kątem leczenia chorób o pod- łożu zapalnym. W tego typu badaniach istnieje potrzeba poszukiwania markerów odpowiedzi, które będą zmieniać swoje stężenia wraz z dawką badanego związku i korelować z działaniem klinicznym. Najczęściej stosowanymi markerami odpowiedzi po podaniu związków o działaniu przeciwzapalnym były: TNF-α, IL-6 lub tlenek azotu [15,37,111]. Ze względu na to, że pojawiają się z pewnym opóźnieniem we krwi w stosunku do zadziałania bodźca, ich stężenia obserwowane np. w eksperymentalnej sepsie różnią się znacznie międzygatunkowo oraz u różnych osobników tego samego gatunku, a koszt analizy tych markerów jest wysoki, są rzadko stosowane przez autorów prac z zakresu analizy farmakokinetyczno-farmakodynamicznej i przemysł farmaceutyczny. Istnieje więc potrzeba poszukiwania nowych biomarkerów, które w sposób zależny od dawki będą korelować z obserwowanym działaniem farmakologicznym. cAMP wydaje się doskonałym kandydatem na taki marker dla związków, których mechanizm działania jest związany ze wzrostem stężenia cAMP na różnych drogach, także ze względu na dostępność wielu metod analitycznych, które mogą być stosowane do oznaczenia stężeń tego nukleotydu w materiale biologicznym.

Metody oznaczania cAMP w materiale biologicznym

Jak wiadomo, wybór optymalnej metody analitycznej jest podstawowym etapem w badaniach farmakokinetyczno-farmakodynamicznych, zapewniającym uzyskanie precyzyjnych i rzetelnych wyników. W przypadku oznaczania cAMP w materiale biologicznym największe znaczenie mają obecnie: wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) z detekcją fluorymetryczną lub spektrofotometryczną, metody immunoenzymatyczne (EIA, enzyme immuno assay), wśród których najszerzej stosowane są testy ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) oraz metody radioimmunologiczne (RIA, radioimmuno assay). W tabeli 5 przedstawiono najważniejsze metody oznaczania stężeń cAMP w materiale biologicznym.

Istotą detekcji fluorescencyjnej jest pomiar intensywności emisji światła o określonej długości fali, emitowanego przez wykrywany związek w  wyniku jego wzbudzenia światłem o wyższej energii niż światło emitowane. Jednak większość związków, w  tym cAMP, nie wykazuje naturalnej fluorescencji i warunkiem analizy ich stężeń tą metodą jest ich derywatyzacja. Proces opiera się na przeprowadzeniu związku, w następstwie reakcji chemicznej, w określone pochodne o swoistych właściwościach, umożliwiających ich oznaczenie. Najczęściej stosowaną metodą derywatyzacji cAMP jest jego reakcja z 2-chloroacetaldehydem w buforze octanowym. Metoda była stosowana do oznaczeń cAMP w materiale ludzkim (osocze, sperma), zwierzęcym (osocze: psów, kotów, świnek morskich, szczurów, królików; hipokamp świnek morskich; mózg szarańczy wędrownej Locusta migratoria) oraz roślinnym (kultury rzęsy Lemna paucicostata) [35,54,108,118,119]. Reakcję przeprowadza się w okre- ślonych warunkach czasu i temperatury derywatyzacji, a  powstająca pochodna cAMP, 1,N6 -eteno-cykliczny-cAMP, jest oznaczana fluorymetrycznie przy długości fali wzbudzenia wynoszącej 280 nm i długości fali emisji równej 380, 400 lub 420 nm [35,54,118,119]. Na rycinie 4 przedstawiono przykładowe chromatogramy cAMP uzyskane w  naszym laboratorium z  wykorzystaniem techniki HPLC z detekcją fluorymetryczną oraz derywatyzacją z użyciem 2-chloroacetaldehydu.

Ze względu na to, że reakcja derywatyzacji cAMP może nie przebiegać w sposób ilościowy, niektórzy autorzy stosowali standard wewnętrzny, którym najczęściej była etenoadenozyna [119] lub widarabina [54]. Reakcja derywatyzacji z użyciem 2-chloroacetaldehydu w buforze octanowym może znaleźć również zastosowanie do oznaczania innych pochodnych 6-amino nukleotydów lub nukleozydów w materiale biologicznym, takich jak: adenozyna, adenina, ATP, ADP lub AMP. Niekiedy do oznaczania cAMP wykorzystuje się również inne, mniej popularne odczynniki derywatyzujące, jak np. bromoacetaldehyd [35,108]. Metoda oznaczania cAMP z wykorzystaniem techniki HPLC z detekcją fluorymetryczną nie jest jedyną, która znalazła zastosowanie w badaniach nad tym nukleotydem. W niektórych pracach stosowano metodę HPLC z detekcją UV. Okazało się jednak, że ten typ detekcji wymaga użycia większej ilości materiału biologicznego i charakteryzuje się czułością około 50 razy mniejszą niż w  przypadku wykorzystania detektora fluorymetrycznego [6,42]. Analizując dane literaturowe można napotkać także kilka prac poświęconych zastosowaniu metody HPLC z  detekcją masową (HPLC/MS) lub układem tandemowym (HPLC/MS/MS) do analizy i identyfikacji cAMP [73,118]. W metodach tych często wykorzystuje się dimetylo-L-homoargininę (DMHA) lub sól tetraalkiloamoniową jako odczynniki par jonowych. Co więcej, próby z wykorzystaniem ujemnej i dodatniej jonizacji wskazały, że ujemna jonizacja jest bardziej odpowiednia do oznaczania cAMP. Okazało się jednak, że uzyskane tymi metodami wartości limitu oznaczalności nie były niższe od wartości uzyskanej metodą HPLC z detekcją fluorymetryczną [118].

Do szybkiego ilościowego oznaczania cAMP można również zastosować metody immunoenzymatyczne, które mogą być wykorzystane dla każdego rodzaju materiału biologicznego. Testy immunoenzymatyczne do oznaczania cAMP, dostępne komercyjnie, są produkowane przez kilka firm (tabela 6). Ich zasada działania jest podobna i można ją przedstawić na przykładzie zestawu firmy Cell Biolabs [14]. W tym zestawie dołek płytki reakcyjnej jest opłaszczony poliklonalnym przeciwciałem antykróliczym. W  środowisku reakcji są obecne królicze przeciwciało anty- -cAMP, cAMP znakowane enzymem oraz wolne cAMP pochodzące z próbki badanej. cAMP znakowane konkuruje o ograniczoną liczbę miejsc wiążących na przeciwciałach anty-cAMP z wolnym cAMP. Kompleksy „wolne cAMP + przeciwciało anty-cAMP” oraz „znakowane cAMP + anty-cAMP” wiążą się z przeciwciałem antykróliczym w dołku. Po odpłukaniu kompleksów niezwiązanych, dodaje się substratu, który zostaje przekształcony przez enzym w produkt oznaczany luminometrycznie.

Im więcej wolnego cAMP znajduje się w badanej próbce, tym silniej wypierane jest znakowane enzymatycznie cAMP, czego skutkiem jest proporcjonalny do stężenia wolnego nukleotydu spadek luminescencji. W zależności od producenta, enzymy wykorzystywane w tej metodzie to: peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna albo acetylocholinoesteraza (AChE), przy czym ten ostatni jest uważany za enzym o najlepszych właściwościach w  tego typu testach. W  porównaniu z  peroksydazą chrzanową, AChE nie ulega samoistnej dezaktywacji w czasie analizy, jest stabilna w zakresie pH 5-10, a jej aktywność nie jest hamowana przez powszechnie stosowane bufory i konserwanty. Dzięki znacznej stabilności AChE, nie ma potrzeby stosowania odczynników hamujących reakcję, a pomiar absorbancji nie musi być wykonany natychmiast po skończeniu analizy. Wśród zalet metod immunoenzymatycznych należy zwrócić uwagę na stosunkowo krótki czas analizy (3-4 h), przy możliwości przeprowadzenia oznaczeń w 96 lub nawet 480 próbkach jednocześnie. Metody charakteryzują się również największą czułością i swoistością spośród wszystkich opisanych metod oznaczania cAMP. Ich wykorzystanie jest ograniczone jedynie wysoką ceną dostępnych komercyjnie zestawów.

Do ilościowego oznaczania cAMP stosuje się niekiedy metodę radioimmunologiczną (RIA). Wśród producentów testów RIA można wymienić: Immuno-Biological Labolatories™, Institutes of Isotopes lub PerkinElmer®. Testy RIA mogą być wykorzystane do oznaczania cAMP w moczu i osoczu, zawiesinach komórkowych, a objętość próbki potrzebna do analizy wynosi, w zależności od producenta, 20-100 μl. Jak zapewniają producenci, w przyszłości metoda będzie mogła być wykorzystywana do oznaczania cAMP w każdym materiale biologicznym. Porównanie metody HPLC z detekcją fluorymetryczną z metodą RIA wykorzystującą konwersję α-[32P]-ATP do 32P-cAMP wykazało, że obydwie metody charakteryzują się porównywalną czułością [108].

Podsumowanie

Jak wynika z  przeglądu danych literaturowych, rola cAMP w wielu procesach fizjologicznych i patofizjologicznych nie została jeszcze do końca poznana. Wciąż nie wyjaśniono funkcji niektórych receptorów GPCR, nie wszystko wiadomo na temat udziału cAMP w modulacji apoptozy w wielu komórkach. Rozwój biologii molekularnej i związanych z nią technik, jak również pojawienie się nowoczesnych, bardzo czułych metod analitycznych pozwalają na uzyskiwanie coraz więcej informacji o tej ciekawej cząsteczce. Między innymi stało się możliwe poznanie skomplikowanego układu przestrzennego elementów ścieżki sygnałowej cAMP. Z roku na rok przybywa doniesień o  nowych mechanizmach regulacji przekaźnictwa cAMP na niemal każdym etapie jego syntezy i działania. Koncepcja kompartmentalizacji cAMP, badania nad transporterami dla tego nukleotydu oraz pozakomórkową ścieżką degradacji cAMP, teorie na temat jego roli w procesie zapalnym i apoptozie, to tylko wybrane aspekty współczesnych badań nad tym wtórnym przekaźnikiem. W ostatnich latach bardzo ważnym kierunkiem w badaniach nad cAMP jest poszukiwanie selektywnych inhibitorów i  aktywatorów enzymów zaangażowanych w syntezę i degradację cAMP. Związki te są testowane pod kątem ich zastosowania jako potencjalne leki o działaniu przeciwzapalnym, przeciwbólowym, sercowo-naczyniowym oraz w  leczeniu chorób neurodegeneracyjnych. Wiele nadziei budzą również efektory cAMP jako potencjalne cele terapeutyczne nowych leków. Wzrost stężenia cAMP obserwowany we krwi po podaniu inhibitorów fosfodiesterazy wskazuje na możliwość zastosowania tej cząsteczki jako markera odpowiedzi na lek w badaniach farmakokinetyczno-farmakodynamicznych nad tymi związkami.

Przypisy

• 1. A randomized, 24-week, double-blind, placebo-controlled, parallel-groupstudy to evaluate the efficacy, safety and tolerability ofARIFLO® (15mg BID) in patients with chronic obstructive pulmonarydisease (COPD). http://www.gsk-clinicalstudyregister.com/study/CIL103657#ps (07.01.2014)
  Google Scholar
• 2. A study of LY2409021 in participants with type 2 diabetes mellitus.https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02111096 (05.01.2015) 3 Abcam™ immunoassays products: cAMP ELISA. http://www.abcam.com/camp-direct-immunoassay-kit-ab65355.html(18.02.2014)
  Google Scholar
• 3. inhibitor olprinone attenuates meconium-inducedoxidative lung injury. Pulm. Pharmacol. Ther., 2012; 25: 216-222
  Google Scholar
• 4. Abnova™ cAMP ELISA Kit. http://www.abnova.com/products/products_detail.asp?Catalog_id=KA3388 (18.02.2014)
  Google Scholar
• 5. Alasbahi R.H., Melzig M.F.: Plectranthus barbatus: a review ofphytochemistry, ethnobotanical uses and pharmacology – part 2.Planta Med., 2010; 76: 753-765
  Google Scholar
• 6. Anderson F.S., Murphy R.C.: Isocratic separation of some purinenucleotide, nucleoside, and base metabolites from biologicalextracts by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr.,1976; 121: 251-262
  Google Scholar
• 7. Bender A.T., Beavo J.A.: Cyclic nucleotide phosphodiesterases:molecular regulation to clinical use. Pharmacol Rev., 2006; 58: 488-520
  Google Scholar
• 8. Bhave G., Zhu W., Wang H., Brasier D.J., Oxford G.S., Gereau R.W.IV:cAMP-dependent protein kinase regulates desensitization of thecapsaicin receptor (VR1) by direct phosphorylation. Neuron, 2002;35: 721-731
  Google Scholar
• 9. Bos J.L.: Epac: a new cAMP target and new avenues in cAMP research.Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2003; 4: 733-738
  Google Scholar
• 10. Bretscher A., Edwards K., Fehon R.G.: ERM proteins and merlin:integrators at the cell cortex. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2002; 3: 586-599
  Google Scholar
• 11. Bryn T., Mahic M., Enserink J.M., Schwede F., Aandahl E.M., TaskenK.: The cyclic AMP-Epac1-Rap1 pathway is dissociated fromregulation of effector functions in monocytes but acquires immunoregulatoryfunction in mature macrophages. J. Immunol., 2006;176: 7361-7370
  Google Scholar
• 12. c-AMP Screen® ELISA TEST Kit. http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4412183 (18.02.2014)
  Google Scholar
• 13. Cabrera-Vera T.M., Vanhauwe J., Thomas T.O., Medkova M., PreiningerA., Mazzoni M.R., Hamm H.E.: Insights into G protein structure,function, and regulation. Endocr. Rev., 2003; 24: 765-781
  Google Scholar
• 14. Cell Biolabs products: cyclic AMP assays. http://www.cellbiolabs.com/cyclic-amp-assays(18.02.2014)
  Google Scholar
• 15. Chakraborty A., Yeung S., Pyszczynski N.A., Jusko W.J.: Pharmacodynamicinteractions between recombinant mouse interleukin-10and prednisolone using a mouse endotoxemia model. J. Pharm. Sci.,2005; 94: 590-603
  Google Scholar
• 16. Cheng J.B., Watson J.W., Pazoles C.J., Eskra J.D., Griffiths R.J., CohanV.L., Turner C.R., Showell H.J., Pettipher E.R.: The phosphodiesterasetype 4 (PDE4) inhibitor CP-80,633 elevates plasma cyclic AMP levelsand decreases tumor necrosis factor-α (TNFα) production in mice:effect of adrenalectomy. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1997; 280: 621-626
  Google Scholar
• 17. Cheng X., Ji Z., Tsalkova T., Mei F.: Epac and PKA: a tale of twointracellular cAMP receptors. Acta Biochim. Biophys. Sin., 2008;40: 651-662
  Google Scholar
• 18. Chiavegatti T., Costa V.L.Jr., Araujo M.S., Godinho R.O.: Skeletalmuscle expresses the extracellular cyclic AMP-adenosine pathway.Br. J. Pharmacol., 2008; 153: 1331-1340
  Google Scholar
• 19. Civantos Calzada B., Aleixandre de Artinano A.: Alpha-adrenoceptorsubtypes. Pharmacol. Res., 2001; 44: 195-208 20 Cook W.H., Lipkin D., Markham R.: The formation of a cyclicdianhydrodiadenylic acid (I) by the alkaline degradation of adenosine-5’-triphosphoricacid (II). J. Am. Chem. Soc., 1957; 79: 3607-3608
  Google Scholar
• 20. years after the discovery. Pharmacol. Rev., 2009; 61: 283-357
  Google Scholar
• 21. Crowe M.S., Nass S.R., Gabella K.M., Kinsey S.G.: The endocannabinoidsystem modulates stress, emotionality, and inflammation.Brain Behav. Immun., 2014; 42: 1-5
  Google Scholar
• 22. Cunha P., Romao A.M., Mascarenhas-Melo F., Teixeira H.M., ReisF.: Endocannabinoid system in cardiovascular disorders-new pharmacotherapeuticopportunities. J. Pharm. Bioallied. Sci., 2011; 3:350-360
  Google Scholar
• 23. Daniel P.B., Walker W.H., Habener J.F.: Cyclic AMP signaling andgene regulation. Annu. Rev. Nutr., 1998; 18: 353-383
  Google Scholar
• 24. Di Benedetto G., Zoccarato A., Lissandron V., Terrin A., Li X.,Houslay M.D., Baillie G.S., Zaccolo M.: Protein kinase A type I andtype II define distinct intracellular signaling compartments. Circ.Res., 2008; 103: 836-844
  Google Scholar
• 25. Dodge-Kafka K.L., Soughayer J., Pare G.C., Carlisle Michel J.J.,Langeberg L.K., Kapiloff M.S. Scott J.D.: The protein kinase A anchoringprotein mAKAP coordinates two integrated cAMP effectorpathways. Nature, 2005; 437: 574-578
  Google Scholar
• 26. Edwards H.V., Christian F., Baillie G.S.: cAMP: novel conceptsin compartmentalised signalling. Semin. Cell Dev. Biol., 2012; 23:181-190
  Google Scholar
• 27. England S., Bevan S., Docherty R.J.: PGE2 modulates the tetrodotoxin-resistantsodium current in neonatal rat dorsal root ganglionneurones via the cyclic AMP-protein kinase A cascade. J. Physiol.,1996; 495: 429-440
  Google Scholar
• 28. Enzo® Life Sciences Products: cAMP ELISA Kit. http://www.enzolifesciences.com/ADI-900-067/camp-eia-kit/(18.02.2014)
  Google Scholar
• 29. Ewaldsson C.A., Hahn R.G.: β2-adrenergic responsiveness in vivoduring abdominal surgery. Br. J. Anaesth., 1998; 81: 343-347
  Google Scholar
• 30. Ferrandon S., Feinstein T.N., Castro M., Wang B., Bouley R., PottsJ.T., Gardella T.J. Vilardaga J.P.: Sustained cyclic AMP productionby parathyroid hormone receptor endocytosis. Nat. Chem. Biol.,2009; 5: 734-742
  Google Scholar
• 31. Fortin M., D’Anjou H., Higgins M.E., Gougeon J., Aube P., MoktefiK., Mouissi S., Seguin S., Seguin R., Renzi P.M., Paquet L. Ferrari N.:A multi-target antisense approach against PDE4 and PDE7 reducessmoke-induced lung inflammation in mice. Respir. Res., 2009; 10: 39
  Google Scholar
• 32. Foudi N., Gomez I., Benyahia C., Longrois D., Norel X.: ProstaglandinE2 receptor subtypes in human blood and vascular cells.Eur. J. Pharmacol., 2012; 695: 1-6
  Google Scholar
• 33. Fredholm B.B., IJzerman A.P., Jacobson K.A., Linden J., MullerC.E.: International union of basic and clinical pharmacology. LXXXI.Nomenclature and classification of adenosine receptors – an update.Pharmacol. Rev., 2011; 63: 1-34
  Google Scholar
• 34. Fredriksson R., Lagerstrom M.C., Lundin L.G., Schioth H.B.: TheG-protein-coupled receptors in the human genome form five mainfamilies. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints.Mol. Pharmacol., 2003; 63: 1256-1272
  Google Scholar
• 35. Gangwani L., Tamot B.K., Khurana J.P., Maheshwari S.C.: Identificationof 3’,5’-cyclic AMP in axenic cultures of Lemna paucicostataby high-performance liquid chromatography. Biochem. Biophys. Res.Commun., 1991; 178: 1113-1119
  Google Scholar
• 36. Giembycz M.A.: Life after PDE4: overcoming adverse events withdual-specificity phosphodiesterase inhibitors. Curr. Opin. Pharmacol.,2005; 5: 238-244
  Google Scholar
• 37. Gozzi P., Pahlman I., Palmer L., Gronberg A., Persson S.: Pharmacokinetic-pharmacodynamicmodeling of the immunomodulatingagent susalimod and experimentally induced tumor necrosisfactor-α levels in the mouse. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1999; 291:199-203
  Google Scholar
• 38. Grandoch M., Bujok V., Fleckenstein D., Schmidt M., Fischer J.W.,Weber A.A.: Epac inhibits apoptosis of human leukocytes. J. Leukoc.Biol., 2009; 86: 847-849
  Google Scholar
• 39. Grandoch M., Roscioni S.S., Schmidt M.: The role of Epac proteins,novel cAMP mediators, in the regulation of immune, lung andneuronal function. Br. J. Pharmacol., 2010; 159: 265-284
  Google Scholar
• 40. Harmar A.J., Fahrenkrug J., Gozes I., Laburthe M., May V., PisegnaJ.R., Vaudry D., Vaudry H., Waschek J.A., Said S.I.: Pharmacologyand functions of receptors for vasoactive intestinal peptide andpituitary adenylate cyclase-activating polypeptide: IUPHAR review 1 Br. J. Pharmacol., 2012; 166: 4-17
  Google Scholar
• 41. Hata A.N., Breyer R.M.: Pharmacology and signaling of prostaglandinreceptors: multiple roles in inflammation and immunemodulation. Pharmacol. Ther., 2004; 103: 147-166
  Google Scholar
• 42. Hoffman N.E., Liao J.C.: Reversed phase high performance liquidchromatographic separations of nucleotides in the presence ofsolvophobic ions. Anal. Chem., 1977; 49: 2231-2234
  Google Scholar
• 43. Hotchkiss R.S., Swanson P.E., Freeman B.D., Tinsley K.W., CobbJ.P., Matuschak G.M., Buchman T.G. Karl I.E.: Apoptotic cell death inpatients with sepsis, shock, and multiple organ dysfunction. Crit.Care Med., 1999; 27: 1230-1251
  Google Scholar
• 44. Hucho T., Levine J.D.: Signaling pathways in sensitization: towarda nociceptor cell biology. Neuron, 2007; 55: 365-376
  Google Scholar
• 45. Hurley J.H.: Structure, mechanism, and regulation of mammalianadenylyl cyclase. J. Biol. Chem., 1999; 274: 7599-7602
  Google Scholar
• 46. Ikeda-Matsuo Y., Tanji H., Narumiya S., Sasaki Y.: Inhibition ofprostaglandin E2 EP3 receptors improves stroke injury via anti–inflammatory and anti-apoptotic mechanisms. J. Neuroimmunol.,2011; 238: 34-43
  Google Scholar
• 47. Insel P.A., Zhang L., Murray F., Yokouchi H., Zambon A.C.: CyclicAMP is both a pro-apoptotic and anti-apoptotic second messenger.Acta Physiol., 2012; 204: 277-287
  Google Scholar
• 48. Irie K., Fujii E., Ishida H., Wada K., Suganuma T., Nishikori T.,Yoshioka T. Muraki T.: Inhibitory effects of cyclic AMP elevatingagents on lipopolysaccharide (LPS)-induced microvascular permeabilitychange in mouse skin. Br. J. Pharmacol., 2001; 133: 237-242
  Google Scholar
• 49. Jedlitschky G., Burchell B., Keppler D.: The multidrug resistanceprotein 5 functions as an ATP-dependent export pump for cyclicnucleotides. J. Biol. Chem., 2000; 275: 30069-30074
  Google Scholar
• 50. Jiang J., Dingledine R.: Prostaglandin receptor EP2 in the crosshairsof anti-inflammation, anti-cancer, and neuroprotection.Trends Pharmacol. Sci., 2013; 34: 413-423
  Google Scholar
• 51. Jin J.Y., DuBois D.C., Almon R.R., Jusko W.J.: Receptor/gene-mediatedpharmacodynamic effects of methylprednisolone on phosphoenolpyruvatecarboxykinase regulation in rat liver. J. Pharmacol.Exp. Ther., 2004; 309: 328-339
  Google Scholar
• 52. Jones R.L., Giembycz M.A., Woodward D.F.: Prostanoid receptorantagonists: development strategies and therapeutic applications.Br. J. Pharmacol., 2009; 158: 104-145
  Google Scholar
• 53. Joshi V.D., Kalvakolanu D.V., Cross A.S.: Simultaneous activationof apoptosis and inflammation in pathogenesis of septic shock: a hypothesis.FEBS Lett., 2003; 555: 180-184
  Google Scholar
• 54. Katayama M., Matsuda Y., Shimokawa K., Tanabe S., Kaneko S.,Hara I., Sato H.: Simultaneous determination of six adenyl purinesin human plasma by high-performance liquid chromatography withfluorescence derivatization. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl.,2001; 760: 159-163
  Google Scholar
• 55. Kaupp U.B., Seifert R.: Cyclic nucleotide-gated ion channels.Physiol. Rev., 2002; 82: 769-824
  Google Scholar
• 56. Kloster M.M., Naderi E.H., Haaland I., Gjertsen B.T., BlomhoffH.K., Naderi S.: cAMP signalling inhibits p53 acetylation and apoptosisvia HDAC and SIRT deacetylases. Int. J. Oncol., 2013; 42: 1815-1821
  Google Scholar
• 57. Kobilka B.K.: G protein coupled receptor structure and activation.Biochim. Biophys. Acta, 2007; 1768: 794-807
  Google Scholar
• 58. Koga K., Takaesu G., Yoshida R., Nakaya M., Kobayashi T., KinjyoI., Yoshimura A.: Cyclic adenosine monophosphate suppresses thetranscription of proinflammatory cytokines via the phosphorylatedc-Fos protein. Immunity, 2009; 30: 372-383
  Google Scholar
• 59. Kumar K., Sharma S., Kumar P., Deshmukh R.: Therapeutic potentialof GABAB receptor ligands in drug addiction, anxiety, depressionand other CNS disorders. Pharmacol. Biochem. Behav., 2013;110: 174-184
  Google Scholar
• 60. Lai L., Tan T.M.: Role of glutathione in the multidrug resistanceprotein 4 (MRP4/ABCC4)-mediated efflux of cAMP and resistance topurine analogues. Biochem. J., 2002; 361: 497-503
  Google Scholar
• 61. Lee H.N., Surh Y.J.: Resolvin D1-mediated NOX2 inactivation rescuesmacrophages undertaking efferocytosis from oxidative stress–induced apoptosis. Biochem. Pharmacol., 2013; 86: 759-769
  Google Scholar
• 62. Li J., Lin K.W., Murray F., Nakajima T., Zhao Y., Perkins D.L., Finn,P.W.: Regulation of cytotoxic T lymphocyte antigen 4 by cyclic AMP.Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2013; 48: 63-70
  Google Scholar
• 63. Marino F., Cosentino M.: Adrenergic modulation of immunecells: an update. Amino Acids, 2013; 45: 55-71
  Google Scholar
• 64. Mentz F., Mossalayi M.D., Ouaaz F., Baudet S., Issaly F., KtorzaS., Semichon M., Binet J.L., Merle-Beral H.: Theophylline synergizeswith chlorambucil in inducing apoptosis of B-chronic lymphocyticleukemia cells. Blood, 1996; 88: 2172-2182
  Google Scholar
• 65. Merck Milipore Elisa Kit. http://www.merckmillipore.com/poland/life-science-research/creb-elisa-kit/EMD_BIO-CBA071/p_uLGb.s1O98sAAAEnlo85SfM4 (18.02.2014)
  Google Scholar
• 66. Miller R.L., Sandoval P.C., Pisitkun T., Knepper M.A., Hoffert J.D.:Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. Am. J.Physiol. Renal. Physiol., 2013; 304: F177-F188
  Google Scholar
• 67. Minguet S., Huber M., Rosenkranz L., Schamel W.W., Reth M.,Brummer T.: Adenosine and cAMP are potent inhibitors of the NF-κB pathway downstream of immunoreceptors. Eur. J. Immunol.,2005; 35: 31-41
  Google Scholar
• 68. Mokra D., Drgova A., Pullmann R.Sr., Calkovska A.: Selective phosphodiesterase
  Google Scholar
• 69. Mokry J., Mokra D.: Immunological aspects of phosphodiesteraseinhibition in the respiratory system. Respir. Physiol. Neurobiol.,2013; 187: 11-17
  Google Scholar
• 70. Murray A.J.: Pharmacological PKA inhibition: all may not bewhat it seems. Sci. Signal., 2008; 1: re4
  Google Scholar
• 71. Naderi E.H., Findley H.W., Ruud E., Blomhoff H.K., Naderi S.: Activationof cAMP signaling inhibits DNA damage-induced apoptosisin BCP-ALL cells through abrogation of p53 accumulation. Blood,2009; 114: 608-618
  Google Scholar
• 72. Nikolaev V.O., Moshkov A., Lyon A.R., Miragoli M., Novak P., PaurH., Lohse M.J., Korchev Y.E., Harding S.E., Gorelik J.: β2-adrenergicreceptor redistribution in heart failure changes cAMP compartmentation.Science, 2010; 327: 1653-1657
  Google Scholar
• 73. Oeckl P., Ferger B.: Simultaneous LC-MS/MS analysis of the biomarkerscAMP and cGMP in plasma, CSF and brain tissue. J. Neurosci.Methods, 2012; 203: 338-343
  Google Scholar
• 74. Oevermann L., Scheitz J., Starke K., Kock K., Kiefer T., Dolken G.,Niessen J., Greinacher A., Siegmund W., Zygmunt M., Kroemer H.K.,Jedlitschky G., Ritter C.A.: Hematopoietic stem cell differentiationaffects expression and function of MRP4 (ABCC4), a transport proteinfor signaling molecules and drugs. Int. J. Cancer, 2009; 124: 2303-2311
  Google Scholar
• 75. O’Keefe L., Simcocks A.C., Hryciw D.H., Mathai M.L., McAinch A.J.:The cannabinoid receptor 1 and its role in influencing peripheralmetabolism. Diabetes Obes. Metab., 2014; 16: 294-304
  Google Scholar
• 76. Omori K., Kotera J.: Overview of PDEs and their regulation. Circ.Res., 2007; 100: 309-327
  Google Scholar
• 77. Pamplona F.A., Takahashi R.N.: Psychopharmacology of theendocannabinoids: far beyond anandamide. J. Psychopharmacol.,2012; 26: 7-22
  Google Scholar
• 78. Pierre S., Eschenhagen T., Geisslinger G., Scholich K.: Capturingadenylyl cyclases as potential drug targets. Nat. Rev. Drug Discov.,2009; 8: 321-335
  Google Scholar
• 79. Piomelli D.: The molecular logic of endocannabinoid signalling.Nat. Rev. Neurosci., 2003; 4: 873-884
  Google Scholar
• 80. R&D Systems ELISA TEST Kit. http://www.rndsystems.com/product_detail_objectname_elisa_assay_product.aspx
  Google Scholar
• 81. Rampersad S.N., Ovens J.D., Huston E., Umana M.B., Wilson L.S., NethertonS.J., Lynch M.J., Baillie G.S., Houslay M.D., Maurice D.H.: CyclicAMP phosphodiesterase 4D (PDE4D) tethers EPAC1 in a vascular endothelialcadherin (VE-Cad)-based signaling complex and controls cAMP–mediated vascular permeability. J. Biol. Chem., 2010; 285: 33614-33622
  Google Scholar
• 82. Reid G., Wielinga P., Zelcer N., van der Heijden I., Kuil A., de HaasM., Wijnholds J., Borst P.: The human multidrug resistance proteinMRP4 functions as a prostaglandin efflux transporter and is inhibitedby nonsteroidal antiinflammatory drugs. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 2003; 100: 9244-9249
  Google Scholar
• 83. Ritter S.L., Hall R.A.: Fine-tuning of GPCR activity by receptor–interacting proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2009; 10: 819-830
  Google Scholar
• 84. Rogers L.M., Thelen T., Aronoff D.M.: Macrophage phagocytosisof clostridium sordellii is suppressed by prostaglandin E2 andintracellular cAMP signaling. Am. J. Reprod. Immunol., 2013; 69(Suppl. 2): 45
  Google Scholar
• 85. Sachdeva S., Gupta M.: Adenosine and its receptors as therapeutictargets: an overview. Saudi. Pharm. J., 2013; 21: 245-253
  Google Scholar
• 86. Sagara N., Toda G., Hirai M., Terada M., Katoh M.: Molecularcloning, differential expression, and chromosomal localization ofhuman Frizzled-1, Frizzled-2, and Frizzled-7. Biochem. Biophys. Res.Commun., 1998; 252: 117-122
  Google Scholar
• 87. Sampath J., Adachi M., Hatse S., Naesens L., Balzarini J., FlatleyR.M., Matherly L.H., Schuetz J.D.: Role of MRP4 and MRP5 in biologyand chemotherapy. AAPS PharmSci., 2002; 4: E14
  Google Scholar
• 88. Sassone-Corsi P.: The cyclic AMP pathway. Cold Spring Harb.Perspect. Biol., 2012; 4: a011148
  Google Scholar
• 89. Seifert R., Dove S.: Functional selectivity of GPCR ligand stereoisomers:new pharmacological opportunities. Mol. Pharmacol.,2009; 75: 13-18
  Google Scholar
• 90. Semmler J., Gebert U., Eisenhut T., Moeller J., SchonhartingM.M., Allera A., Endres S.: Xanthine derivatives: comparison betweensuppression of tumour necrosis factor-α production and inhibitionof cAMP phosphodiesterase activity. Immunology, 1993; 78: 520-525
  Google Scholar
• 91. Serezani C.H., Ballinger M.N., Aronoff D.M., Peters-Golden M.:Cyclic AMP: master regulator of innate immune cell function. Am.J. Respir. Cell Mol. Biol., 2008; 39: 127-132
  Google Scholar
• 92. Shabb J.B.: Physiological substrates of cAMP-dependent proteinkinase. Chem. Rev., 2001; 101: 2381-2411
  Google Scholar
• 93. Smith S.J., Brookes-Fazakerley S., Donnelly L.E., Barnes P.J., BarnetteM.S., Giembycz M.A.: Ubiquitous expression of phosphodiesterase7A in human proinflammatory and immune cells. Am. J. Physiol.Lung Cell. Mol. Physiol., 2003; 284: L279-L289
  Google Scholar
• 94. Sunahara R.K., Taussig R.: Isoforms of mammalian adenylylcyclase: multiplicities of signaling. Mol. Interv., 2002; 2: 168-184
  Google Scholar
• 95. Sutherland E.W., Rall T.W.: Fractionation and characterizationof a cyclic adenine ribonucleotide formed by tissue particles. J. Biol.Chem., 1958; 232: 1077-1091
  Google Scholar
• 96. Szumiło M., Rahden-Staroń I.: Fosfolipaza C zależna od fosfatydyloinozytoluw komórkach ssaków – budowa, właściwości i funkcja.Postępy Hig. Med. Dośw., 2008; 62: 47-54
  Google Scholar
• 97. Taylor S.S., Yang J., Wu J., Haste N.M., Radzio-Andzelm E., AnandG.: PKA: a portrait of protein kinase dynamics. Biochim. Biophys.Acta, 2004; 1697: 259-269
  Google Scholar
• 98. Thermo Scientific Cyclic AMP Competitive ELISA Kit, Multispecies(18.02.2014)
  Google Scholar
• 99. Theron A.J., Steel H.C., Tintinger G.R., Feldman C., Anderson R.:Can the anti-inflammatory activities of β2-agonists be harnessedin the clinical setting? Drug Des. Devel. Ther., 2013; 7: 1387-1398
  Google Scholar
• 100. Tresguerres M., Levin L.R., Buck J.: Intracellular cAMP signalingby soluble adenylyl cyclase. Kidney Int., 2011; 79: 1277-1288
  Google Scholar
• 101. TT401 for type 2 diabetes and obesity. http://www.transitiontherapeutics.com/technology/tt401.php(05.01.2015)
  Google Scholar
• 102. Ullmann A., Danchin A.: Role of cyclic AMP in regulatory mechanismsin bacteria. Trends Biochem. Sci., 1980; 5: 95-96
  Google Scholar
• 103. van Aubel R.A., Smeets P.H., Peters J.G., Bindels R.J., Russel F.G.:The MRP4/ABCC4 gene encodes a novel apical organic anion transporterin human kidney proximal tubules: putative efflux pumpfor urinary cAMP and cGMP. J Am. Soc. Nephrol., 2002; 13: 595-603
  Google Scholar
• 104. Vang T., Torgersen K.M., Sundvold V., Saxena M., Levy F.O.,Skalhegg B.S., Hansson V., Mustelin T., Tasken K.: Activation of theCOOH-terminal Src kinase (Csk) by cAMP-dependent protein kinaseinhibits signaling through the T cell receptor. J. Exp. Med., 2001;193: 497-507
  Google Scholar
• 105. Vaudry D., Falluel-Morel A., Bourgault S., Basille M., Burel D.,Wurtz O., Fournier A., Chow B.K., Hashimoto H., Galas L., Vaudry H.:Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide and its receptors:
  Google Scholar
• 106. Vuguin P.M., Charron M.J.: Novel insight into glucagon receptoraction: lessons from knockout and transgenic mouse models.Diabetes Obes. Metab, 2011; 13 (Suppl.1): 144-150
  Google Scholar
• 107. Wang D., Luo P., Wang Y., Li W., Wang C., Sun D., Zhang R., Su T.,Ma X., Zeng C., Wang H., Ren J., Cao F.: Glucagon-like peptide-1 protectsagainst cardiac microvascular injury in diabetes via a cAMP/PKA/Rho-dependent mechanism. Diabetes, 2013; 62: 1697-1708
  Google Scholar
• 108. Wojcik W., Olianas M., Parenti M., Gentleman S., Neff N.H.:A simple fluorometric method for cAMP: application to studies ofbrain adenylate cyclase activity. J. Cyclic Nucleotide Res., 1981; 7:27-35
  Google Scholar
• 109. Woo A.Y., Wang T.B., Zeng X., Zhu W., Abernethy D.R., WainerI.W., Xiao R.P.: Stereochemistry of an agonist determines couplingpreference of b2-adrenoceptor to different G proteins in cardiomyocytes.Mol. Pharmacol., 2009; 75: 158-165
  Google Scholar
• 110. Woodward D.F., Jones R.L., Narumiya S.: International unionof basic and clinical pharmacology. LXXXIII: classification of prostanoidreceptors, updating 15 years of progress. Pharmacol. Rev.,2011; 63: 471-538
  Google Scholar
• 111. Wyska E.: Pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling ofmethylxanthine derivatives in mice challenged with high-dose lipopolysaccharide.Pharmacology, 2010; 85: 264-271
  Google Scholar
• 112. Wyska E.: Pretreatment with R(+)-verapamil significantly reducesmortality and cytokine expression in murine model of septicshock. Int. Immunopharmacol., 2009; 9: 478-490
  Google Scholar
• 113. Xu R.X., Hassell A.M., Vanderwall D., Lambert M.H., HolmesW.D., Luther M.A., Rocque W.J., Milburn M.V., Zhao Y., Ke H., NolteR.T.: Atomic structure of PDE4: insights into phosphodiesterase mechanismand specificity. Science, 2000; 288: 1822-1825
  Google Scholar
• 114. Yan L., Herrmann V., Hofer J.K., Insel P.A.: β-adrenergic receptor/cAMP-mediatedsignaling and apoptosis of S49 lymphoma cells.Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2000; 279: C1665-C1674
  Google Scholar
• 115. Yang H., Yang X., Cao J., Li S., Liu Y., Suo Z.W., Cui H.B., Guo Z.,Hu X.D.: cAMP-dependent protein kinase activated Fyn in spinaldorsal horn to regulate NMDA receptor function during inflammatorypain. J. Neurochem., 2011; 116: 93-104
  Google Scholar
• 116. Zaccolo M., Movsesian M.A.: cAMP and cGMP signaling cross–talk: role of phosphodiesterases and implications for cardiac pathophysiology.Circ. Res., 2007; 100: 1569-1578
  Google Scholar
• 117. Zaccolo M., Pozzan T.: Discrete microdomains with high concentrationof cAMP in stimulated rat neonatal cardiac myocytes.Science, 2002; 295: 1711-1715
  Google Scholar
• 118. Zhang L., Zhang H., Wang J., Pan C.: Determination of trace levelof cAMP in Locusta Migratoria Manilensis Meyen by HPLC withfluorescence derivation. Int. J. Mol. Sci., 2006; 7: 266-273
  Google Scholar
• 119. Zhang Y., Geiger J.D., Lautt W.W.: Improved high-pressure liquidchromatographic-fluorometric assay for measurement of adenosinein plasma. Am. J. Physiol., 1991; 260: G658-G664
  Google Scholar
• 120. ZP2929 – Type 2 diabetes/Obesity. http://zealandpharma.com/product-pipeline/cardio-metabolic-diseases/zp2929 (05.01.2015)
  Google Scholar

Pełna treść artykułu