Abstrakt

Clostridium difficile jest przyczyną jednego z najczęstszych zakażeń szpitalnych, czyli biegunki poantybiotykowej, która może się rozwinąć w rzekomobłoniaste zapalenie jelit i rozdęcie okrężnicy, co w wielu przypadkach prowadzi do śmierci pacjenta. Zakażenie bakterią C. difficile (CDI – Clostridium difficile infection) jest szczególnie niebezpieczne dla ludzi starszych, u których powoduje największą śmiertelność. Infekcja zwykle jest wywoływana w wyniku kuracji antybiotykowej, która zaburza skład naturalnej mikroflory jelitowej człowieka, a to stwarza dogodne warunki do kolonizacji jelit. C. difficile dysponuje wieloma czynnikami wirulencji, przez co jest patogenem trudnym do zwalczania. Do elementów składających się na dużą zjadliwość C. difficile zalicza się: wydzielane do światła jelit toksyny A, B i binarną CDT, wić, białka warstwy S (najbardziej zewnętrzna powierzchnia C. difficile), białko Cwp66 i GroEL, proteazę Cwp84, białko wiążące fibronektynę oraz zdolność do tworzenia biofilmu i sporulacji. Wiele grup badawczych pracuje nad nowymi sposobami zwalczania CDI będącymi alternatywą dla antybiotyków. Nie wprowadzono jeszcze do sprzedaży szczepionki zapobiegającej CDI. Jednym z badanych rozwiązań jest wykorzystanie immunogennych właściwości białek wchodzących w skład warstwy powierzchniowej patogenu, jako składników szczepionki. W pracy opisano przebieg choroby z uwzględnieniem czynników ryzyka oraz czynników wirulencji bakterii. Przedstawiono najnowsze dane epidemiologiczne i osiągnięcia w leczeniu i zapobieganiu CDI.

Wprowadzenie

Clostridium difficile należy do grupy oportunistycznych bakterii anaerobowych wywołujących schorzenia układu pokarmowego ludzi i  zwierząt. Są to Gram-dodatnie laseczki wytwarzające groźne dla zdrowia toksyny (A i B) oraz spory oporne na wysokie temperatury i powszechnie stosowane środki utrzymania czystości [40]. Bakterię opisano po raz pierwszy w 1935 r. jako Bacillus difficilis (z łac. difficilis – trudny; nazwa związana z trudnościami w hodowli bakterii) [47]. Początkowo uważano, że jest jednym ze składników zdrowej mikroflory człowieka. Dopiero po czterdziestu latach potwierdzono, że jest odpowiedzialna za rozwój rzekomobłoniastego zapalenia jelit (PMC – pseudomembranous colitis) i uznano ją za bakterię patogenną [7]. Obecnie wiadomo, że C. difficile jest odpowiedzialna za zapalenie jelita grubego, występowanie biegunki o ostrym przebiegu, która może zagrażać życiu hospitalizowanych starszych osób oraz pacjentów po przebytej kuracji antybiotykowej. Narastająca liczba przypadków występowania szczepów hiperwirulentnych i  opornych na działanie antybiotyków powoduje, że zakażenia szpitalne C. difficile są poważnym problemem i wymagają opracowania nowej profilaktyki i leczenia.

W pracy omówiono wybrane aspekty dotyczące zakażeń bakterią Clostridium difficile, w tym mechanizm patogenezy, przebieg choroby, odpowiedź układu odpornościowego gospodarza oraz najnowsze osiągnięcia dotyczące możliwości zapobiegania i leczenia tego typu zakażeń.

Bakterie z rodzaju C. difficile to patogenne mikroorganizmy powodujące zakażenia szpitalne, które są przyczyną najczęściej występującej biegunki poantybiotykowej (AAD – antibiotic-associated diarrhea) oraz poantybiotykowego zapalenia okrężnicy (AAC – antibiotic-associated colitis) [7]. Do najcięższych powikłań powstałych w wyniku zakażenia zalicza się rozdęcie okrężnicy (toxic mega colon), które występuje prawie u 10% pacjentów cierpiących na CDI i czasami doprowadza do perforacji jelit i zgonu. Rozdęcie okrężnicy występuje częściej u osób zakażonych przez szczepy hiperwirulentne [76]. Choroba objawia się biegunką, silnymi bólami brzucha, złym samopoczuciem, mdłościami, wymiotami, gorączką i odwodnieniem organizmu. Czynniki mające wpływ na przebieg choroby to poziom zjadliwości danego szczepu bakterii wynikający z ilości produkowanych toksyn oraz czynniki związane ze stanem układu odpornościowego pacjenta (stan zdrowia pacjenta, skład jego mikroflory, powinowactwo toksyn do komórek nabłonka, odpowiedź gospodarza na infekcję). Najczęstszą przyczyną rozwoju zakażenia bakterią C. difficile jest kuracja antybiotykowa, która zaburza skład jakościowy i ilościowy mikroflory (dysbioza) jelita grubego. Antybiotyki, które podwyższają ryzyko zakażenia to: klindamycyna, cefalosporyny, penicylina i fluorochinolony [61]. Pierwsze objawy choroby pojawiają się w ciągu tygodnia od rozpoczęcia terapii antybiotykowej. Niekiedy choroba pojawia się po zakończonej kuracji, co utrudnia postawienie trafnej diagnozy. Do czynników znacznie podwyższających ryzyko zakażenia zalicza się: podeszły wiek, osłabiony układ odpornościowy, choroby współistniejące, hospitalizacja oraz zabiegi operacyjne [105]. Dodatkowe czynniki podwyższające ryzyko zakażenia to niedobór witaminy D, choroba Leśniowskiego-Crohna, zespoły drażliwego jelita, leki immunosupresyjne oraz chemioterapia [81]. Utrudnieniem w walce ze schorzeniem są częste nawroty choroby, na które cierpi około 30% wyleczonych pacjentów [14], a mogą być spowodowane tym samym szczepem albo innym [5].

Czynniki wirulencjiC. difficile

Liczba opisanych czynników wirulencji C. difficile stale rośnie wraz z postępem badań. Do grupy tej zalicza się: toksyny A, B i binarną CDT, wić (flagellum), białka warstwy S, białko Cwp66 i GroEL, proteazę Cwp84, białko wiążące fibronektynę (Fbp68) oraz zdolność do tworzenia biofilmu i sporulacji.

C. difficile wytwarza dwa główne rodzaje toksyn A (TcdA) i  B (TcdB), a  wybrane szczepy wydzielają dodatkowo toksynę binarną CDT (Clostridium difficile transferase). Szczepy, które nie wytwarzają toksyn, nie wywołują choroby. Toksyny A  i  B odpowiadają za nadmierne wydzielanie wody i elektrolitów do światła jelit, apoptozę kolonocytów oraz za wywołanie ostrego zapalenia jelit. Oba białka mają aktywność glukozylotransferazy [22,91]. Działanie toksyn prowadzi do inaktywacji białek rodziny Rho (białka zaangażowane m.in. w przekazywanie sygnałów w komórce, rearanżację cytoszkieletu, regulację transkrypcji), co powoduje dezintegrację włókien aktynowych, zerwanie połączeń międzykomórkowych, a nawet śmierć komórki [54]. U ludzi, jak dotąd, nie zidentyfikowano ich receptorów. Sugeruje się, że jest to glikoproteina zawierająca cukrowy antygen I, X lub Y [113]. Zidentyfikowano natomiast receptor toksyny A u królików [90]. Jest to enzym, sacharaza-izomaltaza, umiejscowiony w rąbku szczoteczkowym. Każda z toksyn składa się z czterech domen: domena N-końcowa – enzymatyczna, proteaza cysteinowa, domena translokacyjna i domena C-końcowa – receptorowa. Po wejściu do wnętrza komórki toksyna ulega autokatalitycznemu cięciu, po którym aktywna pozostaje tylko N-końcowa część enzymatyczna. Następnie dochodzi do glikozylacji GTPaz Rho (m.in. RhoA, Rac1, Cdc42) i do zatrzymania kaskady przekazywania sygnałów w atakowanej komórce, co zaburza podstawowe czynności komórki, takie jak transkrypcja genów, czy cykl komórkowy [99]. Toksyna B prawdopodobnie ma większe znaczenie w przebiegu choroby [74], jednak pełne objawy chorobowe może wywołać każda z  tych toksyn [65]. Podwójna mutacja wprowadzona w genomie wirulentnej bakterii, która doprowadziła do zaniku wytwarzania toksyn A i B, spowodowała utratę zjadliwości patogenu. Toksyna A jest enterotoksyną o działaniu cytotoksycznym. Natomiast toksyna B jest prawie 1000 razy bardziej cytotoksyczna niż toksyna A [73]. Toksyna binarna (CDT) należy do grupy binarnych ADP-rybozylujących toksyn. CDT składa się z dwóch komponentów, biologicznie aktywnego o aktywności ADP-rybozylotransferazy i odpowiedzialnego za wiązanie się do komórek gospodarza i wnikanie do cytosolu komórki. Strukturę toksyny poznano dzięki rentgenografii strukturalnej [108]. Jest to jedyna toksyna C. difficile, dla której zidentyfikowano receptor obecny na ludzkich komórkach [83]. Tym receptorem jest lipoproteinowy receptor stymulowany lipolizą (LSR – lipolysisstimulated lipoprotein receptor), który występuje na powierzchni jelita cienkiego i grubego oraz na powierzchni innych komórek, takich jak: komórki wątroby, budujące płuca, nerki, nadnercza, jądra i jajniki. Toksyna CDT po przedostaniu się do wnętrza komórki modyfikuje aktynę przez ADP-rybozylację [46], a to niszczy cytoszkielet aktynowy. Toksyna CDT jest wydzielana przez szczepy o zwiększonej patogenności [76]. W ostatnich latach pojawiły się szczepy hiperwirulentne np. 027/BI/NAP1, które wykazują 10-20 razy większe wytwarzanie toksyn A i B, wydzielają toksynę binarną oraz znacznie większą liczbę spor [79].

Wszystkie, jak dotąd zbadane, szczepy zawierają gen kodujący wić [110]. Badania z  wykorzystaniem elektronowego mikroskopu transmisyjnego wykazały dużą zmienność w liczbie wici u poszczególnych szczepów. Szczep 630Δerm ma wiele wici na powierzchni, szczep R20291 tylko jedną wić [2], a  niektóre szczepy nie wytwarzają wici, mimo obecności odpowiednich genów. Wić umożliwia bakterii poruszanie się w  gęstej warstwie śluzu pokrywającego powierzchnię błony śluzowej jelit i dotarcie do komórek nabłonkowych jelit, które są miejscem docelowym bakterii. Wici C. difficile są filogenetycznie konserwatywne, a jednocześnie silnie wzbudzają humoralną odpowiedź odpornościową gospodarza skierowaną przeciw białkom FliC (monomer budujący wić) i FliD (białko czapeczki) [87]. Mutacje w genach fliC i fliD bakterii uniemożliwiają poruszanie się, ale wzmagają adhezję patogenu [33]. Przywieranie do komórek gospodarza jest krytycznym elementem procesu infekcji. Adhezja komórek C. difficile wzmaga się w warunkach stresowych wywołanych podwyższoną temperaturą i kwasowością otoczenia, szokiem osmotycznym oraz brakiem jonów żelaza [116]. W badaniach in vitro wykazano wiązanie się komórek C. difficile do ludzkich linii komórkowych, takich jak Caco2 i HT29-MTX [38]. W procesie przywierania uczestniczą białka adhezyjne, takie jak białko szoku cieplnego GroEL czy białko powierzchniowe Cwp66 [52,117]. Białko GroEL wykazuje zwiększoną ekspresję nie tylko w odpowiedzi na podwyższenie temperatury, lecz także w chwili zetknięcia się bakterii z komórkami nabłonkowymi. Do czynników wirulencji należą również składniki zewnętrznej powierzchni bakterii, czyli białka warstwy S (SLP, S-layer proteins), które składają się głównie z dwóch białek – o małej masie cząsteczkowej (LMW – low molecular weight) oraz o dużej masie cząsteczkowej (HMW – high molecular weight) (ryc. 1).

Oba białka są kodowane przez jeden gen (slpA), którego białkowy produkt jest następnie cięty enzymatycznie na dwa mniejsze białka. LMW wykazuje dużo większe zróżnicowanie w składzie aminokwasowym między szczepami niż HMW [20]. Białka łączą się ze sobą niekowalencyjnymi wiązaniami i tworzą ścisłą powłokę na powierzchni bakterii [39]. Między LMW i HMW występują w  mniejszej ilości również inne białka. Składniki warstwy S odpowiadają za przywieranie bakterii do ścian jelit [37]. Białka stymulują humoralny układ odpornościowy gospodarza, co potwierdza obecność przeciwciał skierowanych przeciw białku LMW we krwi zakażonych osób [82]. Do białek wchodzących w skład warstwy powierzchniowej bakterii zalicza się adhezynę – białko Cwp66 [117]. Jest to białko wykazujące bardzo dużą zmienność w  składzie aminokwasowym między poszczególnymi izolatami klinicznymi, ale zmienność ta nie koreluje ze zwiększoną zjadliwością bakterii, czy trudniejszym przebiegiem choroby. Do czynników wirulencji zalicza się także proteazę Cwp84 – białko niekowalencyjnie związane z warstwą S, które bierze udział w budowaniu warstwy S [63]. Wykazano silną stymulację układu odpornościowego przez proteazę, co sugeruje udział tego białka w patofizjologii zakażeń C. difficile [85]. Jest to białko wysoce konserwatywne, niemal identyczna sekwencja aminokwasowa występuje u wielu izolatów klinicznych C. difficile. Białko Cwp84 ulega przycięciu w komórce, z tego powodu powstaje wiele jego typów, prawdopodobnie o różnej aktywności proteolitycznej. Proteaza może trawić składniki macierzy zewnątrzkomórkowej gospodarza, przez co narusza integralność komórek nabłonka [55]. C. difficile wiąże się do składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak: fibronektyna, fibrynogen, kolagen i  witronektyna [24] za pomocą białka wiążącego fibronektynę Fbp68 (fibronctin binding protein) [51]. Wiązanie fibronektyny umożliwia przywieranie patogenu bezpośrednio do komórek nabłonka, zakłóca to proces prawidłowego rozpoznawania patogenu przez komórki układu odpornościowego gospodarza. Białko zablokowane swoistymi przeciwciałami powodowało jedynie częściową utratę możliwości przylegania C. difficile do komórek Vero, co wskazuje, że w procesie tym biorą udział także inne białka.

Sugeruje się udział biofilmu bakteryjnego w procesie nawrotu choroby. Komórki C. difficile wytwarzają biofilm, w którym tworzą się spory oraz następuje zahamowanie ich kiełkowania [102]. Wytwarzany przez bakterie biofilm jest stosunkowo gruby (30-45 µm) i wielowarstwowy, może wpływać na lekooporność [30]. Bakterie wykazywały większą oporność na tę samą dawkę wankomycyny, kiedy rosły w biofilmie, niż w całej objętości probówki. Zdolność do wytwarzania biofilmu jest zależna od szczepu bakterii i od składników odżywczych obecnych w środowisku. Bakterie tworzą macierz biofilmu wydzielając białka, DNA i polisacharydy, dzięki czemu oddzielają komórki mikroorganizmu od środowiska zewnętrznego. Zjawisko to udokumentowano za pomocą przeciwciał nakierowanych na C. difficile – przeciwciała dotarły tylko do nielicznych komórek bakteryjnych. Dodatek proteinazy K oraz DN-azy I powodował zaburzenie makrokolonii. Do tego typu wzrostu jest nie zbędna prawidłowo wytworzona warstwa S. Mutanty pozbawione enzymu zaangażowanego w dojrzewanie warstwy S nie były zdolne do wzrostu w biofilmie. Wici prawdopodobnie są niezbędne w początkowej fazie tworzenia się makrokolonii. Mutacja wprowadzona w gen wici powodowała znaczne zmniejszenie przyrostu biofilmu, jednak dopiero w piątym dniu wzrostu, co oznacza, że ten element bierze udział w późniejszym etapie tworzenia makrokolonii.

Zwierzęce modele CD

Liczne modele zwierzęce są wykorzystywane w badaniach nad C. difficile. Jednym z najczęściej wykorzystywanych jest chomik syryjski, ponieważ przebieg infekcji C. difficile u tych zwierząt w dużym stopniu przypomina zakażenie u ludzi. W modelu chomiczym choroba jest indukowana przez podanie antybiotyku, który zaburza naturalną mikroflorę jelita, a następnie zakażenie zwierzęcia sporami. Objawy oraz przebieg choroby są podobne jak u człowieka, z tym wyjątkiem, że zakażenie u chomików kończy się śmiercią już po kilku dniach od infekcji, uniemożliwiając dłuższą obserwację przebiegu choroby. Pracę z tym modelem utrudnia również brak odpowiednich odczynników do badań immunologicznych (przeciwciał do pracy z materiałem uzyskanym od chomika). Jako mysie modele CDI wykorzystuje się myszy mające naturalną mikroflorę, pozbawione mikroflory, monokolonizowane oraz myszy o składzie mikroflory przybliżonym do ludzkiej. Za pomocą mysich modeli choroby badano mechanizm zakażenia, wytwarzanie toksyn przez bakterię, przenoszenie i  nawrót choroby oraz wpływ środowiska zewnętrznego na infekcję. Zdrowe myszy są odporne na zakażenie, w  tym przypadku do wywołania CDI jest niezbędna uprzednia kuracja antybiotykowa. Stosowanie antybiotyków jest zbędne u myszy od urodzenia pozbawionych mikroflory jelitowej, jednak jest to model rzadziej używany. Myszy od urodzenia pozbawione mikroflory nie odwzorowują sytuacji jaka zachodzi u pacjentów. U zakażonych myszy rzadko rozwija się choroba o gwałtownym przebiegu. Oprócz myszy w badaniach wykorzystuje się również szczury, świnki morskie, zające, króliki, świnie i inne gatunki zwierząt [29,112,121].

Potencjalne antygeny szczepionkowe

Jedną z metod prewencji zakażeń C. difficile mogą być swoiste przeciwciała skierowane przeciwko cząsteczkom zaangażowanym w proces adhezji, ponieważ zablokowanie miejsc wiążących na powierzchni bakterii uniemożliwiałoby przyleganie patogenu do komórek nabłonkowych pacjenta i tym samym nie dochodziłoby do rozwinięcia się stanu zapalnego. Wykazywane działanie immunomodulacyjne składników powierzchni C. difficile stwarza możliwość wykorzystania ich w szczepionkach. Za wykorzystaniem tych białek w szczepionkach przemawia również to, że część z nich ma regiony konserwatywne. Przeprowadzono eksperymenty mające na celu wzbudzenie odporności na toksyny oraz białka powierzchniowe C. difficile [42,43,84,86]. Skuteczność antygenów zbadano na chomikach syryjskich i myszach pozbawionych flory bakteryjnej. Do zbadania ich skuteczności wykorzystano testy ochronne polegające na zakażeniu ściśle określoną liczbą komórek bakteryjnych myszy lub chomika po jego wcześniejszej immunizacji.

Trwają jeszcze badania kliniczne III fazy nad szczepionką opartą na najlepiej poznanych składnikach wirulencji C. difficile, czyli toksynach. Fragmenty toksyn A i B podane jako antygeny wzbudzają odpowiedź systemową, która neutralizuje działanie toksyn, jednak indukcja odpowiedzi miejscowej w jelicie jest bardzo słaba [118]. Udowodniono działanie ochronne szczepionek opartych na toksynach A i B [42,111]. Na zdrowych ochotnikach wykazano, że szczepionki są bezpieczne i immunogenne oraz że zapobiegają nawrotom choroby u osób cierpiących na nawracające CDI [64]. Istnieją jednak doniesienia o dużej zmienności wytwarzanych przez bakterię toksyn, zwłaszcza w rejonie najsilniej wzbudzającego odpowiedź odpornościową C-końca tych białek [96]. Nie wiadomo, czy wytworzenie aktywnych przeciwciał skierowanych na toksyny wyeliminuje nosicielstwo oraz przenoszenie zakażenia przez spory między pacjentami.

Badacze poszukują wciąż nowych antygenów do użycia w szczepionkach. Najbardziej obiecujące wyniki uzyskano dla białek Cwp66, Cwp84, FliC i FliD oraz Fbp68 [85,87,120]. Przeprowadzono eksperymenty na zwierzętach, w których wykazano właściwości immunogenne białek Cwp84 i FliD [84,86]. Uzyskano istotną statystycznie różnicę w liczbie chomików, które przeżyły zakażenie C. difficile, między grupą zaszczepioną białkiem Cwp84 a grupą kontrolną [84]. Wykazano zmniejszoną kolonizację jelit przez C. difficile w przypadku myszy zaszczepionych białkami FliD i Cwp84. Zbadano odpowiedź układu odpornościowego ludzi chorych i zdrowych względem toksyny A i B oraz białek powierzchniowych C. difficile: FliD, FliC, końca N- i C- białka Cwp66 i białka Fbp68 [85]. Stężenie przeciwciał u tych osób zmierzono za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). W grupie chorej na CDI stężenie przeciwciał było najwyższe względem C-końca białka Cwp66 i spadało dla Fbp68, FliD, toksyny B i  A, N-końca białka Cwp66 i  FliC. Stężenie przeciwciał nakierowanych na N-koniec białka Cwp66, FliC, FliD i Fbp68 było wyższe w grupie kontrolnej od tego w grupie chorych. Stężenie przeciwciał swoistych dla toksyn nie różniło się istotnie statystycznie między obiema grupami. Badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych 17 klinicznych szczepów C. difficile wykazało duże podobieństwo sekwencji białek FliD i FliC między poszczególnymi izolatami [87]. Oba białka były rozpoznawane przez przeciwciała zawarte w surowicach pobranych od pacjentów. Wymienione antygeny, a zwłaszcza FliD, FliC i Cwp84, ze względu na wywoływaną silną odpowiedź układu odpornościowego oraz konserwatywny charakter, są dobrymi kandydatami do zastosowania w  szczepionkach w  połączeniu z  odpowiednimi adiuwantami.

Dane epidemiologiczne

C. difficile zasiedla układ pokarmowy prawie u 3% zdrowych dorosłych oraz do 80% zdrowych noworodków, nie dając żadnych objawów chorobowych [6]. Nosicielstwo C. difficile zwiększa się o 16-35% u osób leczonych w szpitalach i wzrasta proporcjonalnie do długości pobytu w szpitalu oraz w czasie kuracji antybiotykowej [1]. Prawie 30% zakażonych pacjentów wykazuje objawy chorobowe. Chorzy zakażają się od siebie sporami, które wydalają pacjenci z CDI. Wydalane spory znajdują się na urządzeniach szpitalnych np. basenach, toaletach, pościeli. Są oporne na wysychanie, wysokie temperatury i  wiele środków odkażających [40]. Właściwości spor różnią się między poszczególnymi szczepami klinicznymi, np. zdolnością do przywierania do metalowych powierzchni [59]. W razie pozytywnej diagnozy standardowym działaniem jest kuracja antybiotykowa pacjenta, jeżeli nie ma przeciwwskazań. Na ogół towarzyszy temu natychmiastowa izolacja pacjenta, zastosowanie dodatkowych reżimów higienicznych oraz szkolenie personelu szpitala dotyczące opieki nad zakażonym pacjentem [40]. Stwierdza się obecność bakterii w próbkach stolca po zakończonej kuracji antybiotykowej u 10-40% osób cierpiących na CDI [77].

Częstość występowania chorób związanych z zakażeniem C. difficile u mieszkańców USA w ciągu 9 lat uległa prawie potrojeniu (z 31/100 000 do 84/100000) [94]. W skali roku jest to około 300 000 przypadków. W szczycie epidemii w 2008 r. 93% chorych to byli ludzie powyżej 65 roku życia, co stawia zakażenia C. difficile na 18 miejscu wśród głównych przyczyn śmiertelności w tej grupie wiekowej [71]. Epidemie zakażeń wywołanych przez C. difficile są również obecne w Europie, Azji, Australii i Ameryce Środkowej [27,66]. W Polsce częstość zakażeń bakterią C. difficile wynosi 76 przypadków na 10 000 szpitalnych przyjęć, gdzie średnia dla szpitali w zachodnich krajach Europy wynosi 23 na 10000 przyjęć [9]. Poziom śmiertelności u chorych na CDI, u których stwierdzono rzekomobłoniaste zapalenie jelit, wynosi 6-30% i utrzymuje się również na wysokim poziomie u pacjentów, u których nie zdiagnozowano wcześniej rzekomobłoniastego zapalenia jelit [1,6]. W Stanach Zjednoczonych koszty leczenia jednego pacjenta zakażonego C. difficile wynoszą 2 000-72 000 $ [34,41], a walka z biegunkami wywołanymi zakażeniem C. difficile wynosi rocznie około 1,1 miliarda dolarów [67]. Warto odnotować, że coraz więcej chorych zakaża się poza jednostkami opieki medycznej.

Przebieg infekcjiC. difficile

Spory, które dostały się do organizmu pacjenta w sposób fekalno-oralny, kiełkują w  chwili wystąpienia dysbiozy przewodu pokarmowego u pacjentów leczonych antybiotykami i zaczynają się masowo namnażać w jelitach. Komórki bakterii po przejściu w stan wegetatywny i  osiągnięciu fazy stacjonarnej wytwarzają toksyny, które powodują nadmierne wydzielanie wody i elektrolitów do światła jelit, apoptozę kolonocytów, co doprowadza do ostrego zapalenia jelit [35]. Głównym elementem w aktywacji odpowiedzi odpornościowej jest rozpoznanie przez receptory TLR (Toll-like receptors) gospodarza bakterii i aktywacja odpowiedzi odpornościowej przez szlak sygnałowy z udziałem białka MyD88 (ryc. 1). Myszy pozbawione białka adaptorowego wykazywały zwiększoną podatność na ostre zakażenie bakterią C. difficile [69]. W doświadczeniach z wykorzystaniem linii komórkowych wykazano, że toksyny A i B aktywują wytwarzanie prozapalnego czynnika NF-κB [62,98], w wyniku czego neutrofile przemieszczają się do miejsca zakażenia i wywołują stan zapalny, który może uszkadzać powierzchnię jelit. Odpowiedź odpornościowa u pacjentów może przybierać różne postaci. W osoczu krwi większości chorych znajdują się przeciwciała skierowane przeciw C. difficile typu IgA, prawdopodobnie są to ślady po kontakcie z bakterią we wczesnych latach życia. W krwi leczących się osób krążą przeciwciała IgA i IgG. Pacjenci cierpiący na nawracające zakażenia C. difficile nie wykazują skutecznej odpowiedzi przeciwciałami, prawdopodobnie z powodu zbyt małego stężenia swoistych przeciwciał IgG [42]. W razie zakażenia, pierwszą linią obrony jest warstwa śluzu, przez którą bakterie muszą się przedostać, aby móc się związać do komórek nabłonka jelit. C. difficile oprócz wici, która umożliwia jej poruszanie się w śluzie, potrafi również obniżyć stężenie wydzielanego śluzu [16]. Na powierzchni komórek nabłonka jelit znajdują się receptory rozpoznające wzorce (PRR – pattern recognition receptors), do których należą receptory Toll-podobne (TLR) oraz NOD- -podobne (NLR, NOD-like receptors) [68]. Receptory powierzchniowe gospodarza rozpoznają mikroorganizmy po konserwatywnych molekularnych wzorcach mikroorganizmów (MAMPs – microbe associated molecular patterns) [32]. Przyłączenie się wzorca (ligandu) do receptora indukuje odpowiedź odpornościową w postaci wydzielania cytokin, defensyn, substancji o działaniu antybakteryjnym, cząsteczek sygnałowych i mucyn [72]. Mechanizmem zapobiegającym nadmiernej aktywacji receptorów jest słaba konstytutywna oraz selektywna ekspresja. W 2011 r. pojawiły się pierwsze doniesienia na temat rozpoznawania komórek C. difficile przez gospodarza z użyciem swoistych receptorów. Badania przeprowadzone pod kierownictwem Hasegawy sugerują udział w tym procesie białka NOD1 [49]. NOD1 jest to wewnątrzkomórkowa cząsteczka, która rozpoznaje związki peptydoglikanu. Następstwem stymulacji NOD1 jest wzmożone wytwarzanie CXCL1 – chemokiny przyciągającej neutrofile w miejsce zakażenia. Na temat rozpoznania C. difficile przez organizm gospodarza pisali również Ryan i wsp. Sugerują, że bakteria jest identyfikowana za pomocą TLR4, który reaguje na obecność bakteryjnych struktur SLP [97]. Białka warstwy S powodują dojrzewanie komórek dendrytycznych oraz wywołują odpowiedź limfocytów Th1 i Th17 przez interakcje z TLR4.

W 90% przypadków objawy zakażenia C. difficile pojawiają się między pierwszym a  ósmym tygodniem po rozpoczęciu kuracji antybiotykowej. Choroba objawia się wodnistą biegunką w połączeniu ze skurczami mię- śni brzucha. U starszych osób pojawia się niemożność utrzymania kału. U pacjentów z ciężką postacią choroby lub z gwałtownym jej przebiegiem, może dojść do niedrożności jelit, objawów otrzewnowych (silny ból, obrona mięśniowa, brak szmerów perystaltycznych) lub wystąpienia objawów wstrząsu septycznego. Zakażenie może mieć czasem przebieg inwazyjny i może spowodować reaktywne zapalenie stawów, zakażenie skóry, krwi lub kości. Obraz kliniczny jest nieswoisty i  obejmuje stany podgorączkowe, rozlaną tkliwość jamy brzusznej i odwodnienie [53]. Diagnostyka opiera się na teście wykrywającym dehydrogenazę glutaminianową (GDH) oraz teście na obecność toksyn A i B. W przypadku obu wyników dodatnich pacjenta uznaje się za zakażonego toksynotwórczą bakterią C. difficile. W przypadku dodatniego testu GDH i ujemnego testu na obecność toksyn przeprowadza się dodatkowe badanie w postaci testu amplifikacji kwasów nukleinowych (metoda PCR) lub posiewu bakterii C. difficile z oznaczeniem toksynotworzenia. Oba testy potwierdzają obecność lub brak toksynotwórczego szczepu [53].

Leczenie – metody standardowe

W  przypadku stwierdzenia obecności toksynotwórczego szczepu C. difficile u  pacjenta należy odstawić antybiotyki, które spowodowały dysbiozę, a następnie nadmierną kolonizację jelita bakterią C. difficile. Zwykle takie działanie wystarcza u 23% pacjentów. Lekiem pierwszego rzutu jest podawany doustnie metronidazol lub wankomycyna [28], czasem stosuje się teikoplaninę, rifaksyminę. Niestety, kuracja najczęściej stosowanym metronidazolem nie jest skuteczna w przypadku 16-38% chorych [88]. Obecnie wprowadza się również fidaksomycynę, lek bardziej skuteczny niż dotychczas stosowane przeciwko C. difficile, o mniejszym wpływie na mikroflorę jelit oraz osiągający wysokie stężenie w jelitach przy jednocześnie niskiej absorpcji [57]. W najcięższych przypadkach jednak niezbędne jest chirurgiczne usuwanie powikłań (kolektomia). Wzrastająca oporność bakterii na antybiotyki zmusza do poszukiwania alternatywnych terapii. Potrzebne są szybsze i skuteczniejsze sposoby walki z zakażeniami wywoływanymi przez C. difficile.

Leczenie – metody alternatywne

Przeszczep flory bakteryjnej (FMT – fecal microbiome transplantation) to metoda znana od wielu lat i z powodzeniem stosowana w zakażeniach wywołanych C. difficile i innych schorzeniach, takich jak zapalenie jelit, zespół jelita drażliwego, zatwardzenia, a nawet niektórych schorzeń układu nerwowego [12]. Polega na pobraniu próbek zawartości jelita grubego od zdrowego dawcy i przeniesieniu ich do jelit biorcy za pomocą lewatywy. Donorami zwykle są osoby z rodziny, ponieważ podobieństwo pod względem genetycznym odzwierciedla się również w składzie mikroflory jelitowej. W literaturze opisano około 100 przypadków nawracającego CDI leczonych za pomocą FMT w latach 1958-2008, a skuteczność terapii oszacowano na 89% [4]. W 2012 r. przeprowadzono pierwsze, randomizowane badanie skuteczności terapii FMT w leczeniu nawracającego CDI [115]. Porównano trzy grupy: pacjenci leczeni podawaną doustnie wankomycyną, a następnie przechodzący płukanie jelit i FMT, pacjenci leczeni tylko doustnie wankomycyną, pacjenci leczeni doustnie wankomycyną, a następnie płukaniem jelit. W  grupie pierwszej 93% pacjentów zostało wyleczonych, w grupie drugiej 30,7%, a trzeciej jedynie 23% (P<0,001). Niski koszt, skuteczność metody oraz łatwość przeprowadzenia procedury powodują, że FMT może się stać dobrą alternatywą dla antybiotyków. Metoda ma również wady, istnieje duże prawdopodobieństwo przeniesienia patogenów dawcy flory bakteryjnej do biorcy, nie ma możliwości weryfikacji metody, bo za każdym razem przeszczepiana flora będzie mieć inny skład. Zdarza się też, że pacjenci nie akceptują takiej terapii.

Inną metodą leczenia CDI jest wykorzystanie probiotyków. Nie wiadomo jednak w jaki sposób probiotyki wpływają na mikroflorę jelitową oraz jak modulują odpowiedź układu odpornościowego na zakażenia. Szczepy probiotyczne muszą być dostosowane do warunków panujących w układzie pokarmowym oraz oporne na substancje bakteriobójcze wydzielane przez inne składniki mikroflory. Probiotyki mogą modulować odpowiedź komórek układu odpornościowego i tym samym wpływać na skuteczność leczenia zakażeń C. difficile. Część z już znanych mikroorganizmów ma te właściwości, są to np. bakterie z rodzaju Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus CL1285, Lactobacillus casei LBC80R) oraz Saccharomyces boulardii [58]. Użycie probiotyków w celach prewencyjnych, jak i w połączeniu z antybiotykami uznano za jeden z możliwych sposobów walki z CDI. Najlepiej przebadanym pod względem możliwości stosowania w leczeniu pacjentów z CDI jest S. boulardii. Jest to mikroorganizm, który przywiera do ścian jelit, natychmiast po podaniu kolonizuje je, a po 5 dniach od zaprzestania podania znika z układu pokarmowego. Zapobiega działaniu toksyny A bakterii C. difficile przez wydzielanie proteazy trawiącej toksynę A i ograniczającej wiązanie się toksyny do jej receptorów znajdujących się na powierzchni jelita cienkiego szczurów [23]. L. acidophilus LA-5 podany myszom pozbawionym komensali znacznie zmniejszył nasilone objawy CDI [60], obniżył m.in. stężenie toksyn i polepszył obraz histopatologiczny. Inkubacja C. difficile z supernatantem hodowli Lactococcus lactis SL3 znacznie obniżała żywotność patogenu. Inne probiotyki, takie jak: Lactobacillus rhamnosus LR5, Bifidobacterium breve BR3, Bifidobacterium lactis BL3 dały bardzo zbliżone wyniki, jak L. lactis SL3 [70]. Saccharomyces cerevisiae szczep 905 chronił jelito ślepe myszy pozbawionych mikroflory przed patologicznymi zmianami wywołanymi przez C. difficile [75]. Przeprowadzona wnikliwa analiza wyników badań dotyczących stosowania probiotyków w leczeniu biegunki poantybiotykowej wykazała działanie następujących szczepów: Lactobacillus GG, Saccharomyces boulardii, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium lactis Bb12, Streptococcus thermophilus. W tej samej analizie wzięto również po uwagę następujące szczepy: Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum PL03, Lactobacillus plantarum PL02, które jednak nie wykazały tak skutecznego działania jak: Lactobacillus GG, Saccharomyces boulardii, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium lactis Bb12, Streptococcus thermophilus [109]. Takie analizy na dużą skalę mają jednak swoje ograniczenia biorąc pod uwagę eksperymenty różniące się sposobem przeprowadzenia i opisem. Nie we wszystkich badaniach są podane wszystkie potrzebne dane, a przyjęte definicje różnią się, np. biegunki. Poza tym, badacze posługują się grupami kontrolnymi różnej wielkości, a wiek badanych różni się diametralnie między badanymi grupami. Niektóre artykuły przeglądowe wskazują na problem z jednoznacznym potwierdzeniem skuteczności probiotyków w leczeniu schorzeń związanych z zakażeniem bakterią C. difficile. Zaproponowano probiotyki jako środek prewencyjny CDI, ale tylko u osób zdrowych oraz u osób z podwyższonym ryzykiem zachorowania na CDI. Ograniczenia te wynikają z pojedynczych przypadków grzybic wśród pacjentów, wynikających z nadmiernej kolonizacji przez S. boulardii [21]. Mimo wielu pozytywnych przesłanek literaturowych nie zarekomendowano probiotyków do rutynowego stosowania w leczeniu CDI.

Uzupełnieniem terapii z wykorzystaniem probiotyków mógłby być dodatek specjalnie wyselekcjonowanych bakterii probiotycznych wytwarzających bakteriocyny, małe peptydy antybakteryjne. Wykazano in vitro działanie przeciwbakteryjne bakteriocyn laktycyny 3147 oraz nizyny wytwarzanych przez Lactococcus lactis, przeciwko C. difficile. Niestety oba peptydy mają szeroki zakres działania, szczególnie przeciw bakteriom Gram-dodatnim [8,92]. Innym peptydem antybakteryjnym jest LFF571, który wykazuje hamujące działanie na wzrost C. difficile, a jednocześnie mniejsze działanie hamujące na szczepy Lactobacillus i  Bifidobacterium [26]. Inną bakteriocyną jest półsyntetyczna pochodna aktagardyny A o wąskim zakresie działania i aktywna względem C. difficile [11]. Wśród bakterii, które zamieszkują ludzkie jelito, odnaleziono Bacillus thuringiensis, który wydziela substancję o nazwie thuricin CD o minimalnym stężeniu hamują- cym względem C. difficile porównywalnym do metronidazolu i wankomycyny [93]. Peptyd ten nie wykazuje toksycznego działania na resztę mikroflory.

Interesujących rozwiązań w  walce z  C. difficile może dostarczyć nowa dyscyplina naukowa – patobiotechnologia, która zajmuje się wykorzystaniem właściwości patogenów w przemyśle spożywczym i medycynie. Jedną z idei jest zastosowanie bakterii, które na powierzchni zawierają receptory podobne do tych na powierzchni komórek jelit gospodarza. Mogą to być receptory toksyn wytwarzanych przez patogeny lub dla samych patogenów, których wiązanie spowoduje ich inaktywację. Prowadzone są badania nad rozwiązaniami, w których bakterie probiotyczne otrzymują geny odpowiedzialne za przetrwanie warunków stresowych wywołanych przez bakterie patogenne, dzięki czemu stają się bardziej oporne. W taki sposób udało się zmienić Lactobacillus salivarius UCC118 [103], bakterię o właściwościach probiotycznych, na mniej wrażliwą na niekorzystne warunki środowiska. Naukowcom udało się wprowadzić do L. salivarius gen BetL pochodzący z Listeria monocytogenes odpowiedzialny za wytwarzanie białek, które uodparniają patogen na zasolenie, niską temperaturę [119] i umożliwiają przeżywanie w niektórych przetworzonych pokarmach [106]. Taką samą modyfikację przeprowadzono z Bifidobacterium breve UCC2003 [104]. Badania z wykorzystaniem modelu zwierzęcego wykazały zwiększoną przeżywalność modyfikowanego szczepu bakteryjnego podawanego do jamy ustnej po przejściu przez układ pokarmowy myszy w porównaniu do szczepu niemodyfikowanego oraz działanie ochronne przed zakażeniem L. monocytogenes. Wadą takiego rozwiązania jest to, że są to organizmy modyfikowane genetycznie, przez co muszą spełniać wiele norm bezpieczeństwa, a z ich stosowaniem wiąże się wiele zagrożeń, np. możliwość przeniesienia genów oporności na patogenne bakterie. Dotychczas tylko jedna zmodyfikowana bakteria Lactococcus lactis (LL-Thy12) jest testowana w badaniach klinicznych jako potencjalny lek [15].

Innym sposobem walki z bakteriami chorobotwórczymi jest wykorzystanie przeciwciał leczniczych nakierowanych na czynniki inwazyjne bakterii np. adhezyny, wić, toksyny. W tym celu wykorzystano przeciwciała wytwarzane w jajach kurzych (IgY) swoiste względem białek FliD, FliC oraz Cwp84 [80]. Chomiki syryjskie zakażano sporami C. difficile po uprzedniej kuracji antybiotykowej, po czym podawano im przeciwciała lecznicze IgY; przeciwciało IgY anty-FliD spowodowało znaczny wzrost ich przeżywalności. Jedną z obecnie stosowanych terapii w przypadku zakażeń bakteryjnych jest fagoterapia. Fagi atakują ściśle określone bakterie, które dostają się do wnętrza komórki bakteryjnej, przejmują kontrolę nad replikacją DNA i zabijają zainfekowaną bakterię w procesie lizy towarzyszącej uwalnianiu się faga. Bakteriofagi są stosowane do zwalczania infekcji Pseudomonas u psów, myszy i ludzi [23,57]. Jest to dość dobrze poznana terapia stosowana, gdy antybiotyki zawodzą. Dotychczas wyizolowane fagi to fagi lizogeniczne, czyli trwale wbudowane w genom bakterii C. difficile. Istnieją doniesienia o prawdopodobnej roli profagów w ekspresji genów toksyny A i B C. difficile [101]. Udowodniono naturalną indukcję profaga w przebiegu CDI, co prowadziło do zabijania komórki bakteryjnej [78]. Niestety w tego typu zakażeniach, jak dotąd nie ma opracowanych terapii z wykorzystaniem fagów przeznaczonych do szerokiego zastosowania. sporami C. difficile po uprzedniej kuracji antybiotykowej, po czym podawano im przeciwciała lecznicze IgY; przeciwciało IgY anty-FliD spowodowało znaczny wzrost ich przeżywalności. Jedną z obecnie stosowanych terapii w przypadku zakażeń bakteryjnych jest fagoterapia. Fagi atakują ściśle określone bakterie, które dostają się do wnętrza komórki bakteryjnej, przejmują kontrolę nad replikacją DNA i zabijają zainfekowaną bakterię w procesie lizy towarzyszącej uwalnianiu się faga. Bakteriofagi są stosowane do zwalczania infekcji Pseudomonas u psów, myszy i ludzi [23,57]. Jest to dość dobrze poznana terapia stosowana, gdy antybiotyki zawodzą. Dotychczas wyizolowane fagi to fagi lizogeniczne, czyli trwale wbudowane w genom bakterii C. difficile. Istnieją doniesienia o prawdopodobnej roli profagów w ekspresji genów toksyny A i B C. difficile [101]. Udowodniono naturalną indukcję profaga w przebiegu CDI, co prowadziło do zabijania komórki bakteryjnej [78]. Niestety w tego typu zakażeniach, jak dotąd nie ma opracowanych terapii z wykorzystaniem fagów przeznaczonych do szerokiego zastosowania.

Antybiotyki i zaburzenia mikroflory a C. difficile

Badania prowadzone nad składem mikroflory jelit wykazały obecność tysięcy mikroorganizmów różnych gatunków, należących głównie do typów Firmicutes i Bacteroidetes. W jelicie znajdują się również mniejsze grupy bakterii należące do typów Proteobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Fusobacteria [36]. Mikroorganizmy tworzące mikroflorę przewodu pokarmowego spełniają wiele pożytecznych ról, wytwarzają witaminy K i  B, metabolizują cholesterol, wytwarzają krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, takie jak maślan, rozkładają polisacharydy z pożywienia, które nie byłyby dostępne człowiekowi [3]. Pobudzają układ odpornościowy do obrony przed patogenami, konkurują z organizmami patogennymi o miejsca wiążące na powierzchni jelit, wytwarzają substancje zwane bakteriocynami, które zabijają bakterie chorobotwórcze [95]. Mikroflora jelitowa działa również niekorzystnie. Nadmierne pobudzenie układu odpornościowego przez antygeny bakterii komensalnych może prowadzić do przewlekłego zapalenia jelit (IBD – inflammatory bowel disease) i do rozwinięcia się choroby Leśniowskiego-Crohna [13].

Układ odpornościowy związany z układem pokarmowym ma za zadanie walkę z patogenami z jednoczesną tolerancją spożywanego pokarmu oraz zasiedlających światło jelit organizmów komensalnych. Spełnia to zadanie, wykorzystując wiele swoistych oraz nieswoistych mechanizmów. Do mechanizmów nieswoistych, które tworzą pierwszą linię obrony, należy powierzchnia jelit pokryta ściśle przylegającymi do siebie komórkami nabłonkowymi wydzielającymi śluz, który jest rezerwuarem substancji o działaniu przeciwbakteryjnym w postaci peptydów o działaniu bakteriobójczym i  immunoglobulin wydzielonych przez wyspecjalizowane do walki z  patogenami komórki układu odpornościowego. System tkanki limfatycznej związanej ze śluzówką jelit nazywa się GALT (gut-associated lymphoid tissue). Do elementów budujących ten układ należą struktury limfatyczne, krezkowe węzły chłonne, kępki Peyera, grudki chłonne oraz inne struktury związane ze śluzówką jelit (ryc. 2). Szacuje się, że 80% immunoglobulin wytwarzanych w ludzkim organizmie powstaje właśnie w GALT [10].

Nabłonek jelit jest miejscem, gdzie komórki gospodarza „testują” zawartość światła jelit na obecność patogennych mikroorganizmów i wywołują odpowiedź odpornościową przez wydzielenie cząsteczek sygnałowych, takich jak cytokiny i chemokiny lub też wydzielają substancje o działaniu przeciwbakteryjnym. Następnie do miejsca kontaktu z  obcym mikroorganizmem napływają leukocyty (limfocyty T i B) [107]. Mimo ciągłego kontaktu śluzówki z organizmami komensalnymi układ reaguje jedynie niewielkim zapaleniem w odpowiedzi na ich lipopolisacharyd (LPS), lipoproteiny lub peptydoglikan. Organizm gospodarza może odróżnić niegroźne bakterie od patogennych za pomocą systemów rozpoznających antygeny. Do takich systemów należą wcześniej wspomniane receptory TLR, NOD2 i NOD1, np. TLR4 jest receptorem LPS [89], ligandem dla TLR5 jest flagelina i bakterie zaopatrzone w wić [50]. Zidentyfikowano ligandy receptorów NOD: dla NOD2 jest to swoisty dla peptydoglikanu (PGN) motyw dipeptyd muramylowy (MDP) [45], dla NOD1 jest to pochodna PGN u bakterii Gram-ujemnych [44]. Związanie receptorów z ligandem zmienia ekspresję genów komórki wchodzącej w skład układu odpornościowego śluzówki jelit oraz aktywację lub hamowanie odpowiedzi odpornościowej.

Odkrycie antybiotyków w 1928 r. przez Alexandra Fleminga było kamieniem milowym w  walce z  patogenami. Mimo iż jest to jedno z największych odkryć XX w., jego niewłaściwe wykorzystanie, a nawet nadużycie ma pewne negatywne skutki. Podanie pacjentowi antybiotyku zaburza mikroflorę jelitową i wpływa na odporność organizmu. Badania przeprowadzone na zdrowych osobnikach, którzy przyjmowali przez 5 dni doustnie ciprofloksacynę wykazały zubożenie składu mikroflory w czasie kuracji [31]. Różnorodność bakterii spadła u badanych pacjentów o 1/3. Wprawdzie mikroflora powróciła do stanu równowagi po czterech tygodniach od kuracji, to jednak w jej składzie nie wykryto kilku szczepów, co oznacza, że nawet kilkudniowe leczenie może powodować nieodwracalne zmiany w jej składzie. Inne badania dotyczące składu flory bakteryjnej kału wykazały, że po 7-dniowej kuracji klindamycyną zmniejszyła się różnorodność rodzaju Bacteroides i dochodziło do wzmożonej kolonizacji szczepami opornymi na antybiotyki. Skład bakterii z rodzaju Bacteroides nie powrócił do normy sprzed kuracji nawet po dwóch latach od zaprzestania kuracji antybiotykiem [56]. Szczepy mikroflory są od siebie zależne, oddziałują na siebie i dlatego zastosowanie antybiotyku powoduje nie tylko utratę pojedynczej klasy mikroorganizmów, ale zaburza całą równowagę. W doświadczeniu przeprowadzonym na myszach, którym podano wankomycynę – swoisty antybiotyk względem bakterii Gram-dodatnich – obserwowano w jelitach również zmniejszenie liczby Gram-ujemnych bakterii typu Bacteroidetes [100]. Inne badanie składu bakteryjnego jelit wykazało zwiększoną liczbę bakterii rodzaju Enterococcus spp., Clostridium spp. i rodziny Enetrobacteriaceae [114].

Zagadnienie antybiotykooporności ma ścisły związek z CDI, polega na nabyciu przez bakterię zdolności do inaktywacji lub unikania działania antybiotyku. C. difficile jest oporne na działanie wielu antybiotyków, w przeciwieństwie do bakterii Gram-ujemnych wchodzących w  skład mikroflory, które w  czasie leczenia w dużej części zostają zabite. Występowanie infekcji C. difficile jest związane z długotrwałym przyjmowaniem klindamycyny, cefalosporyny lub fluorochinolonów. Klindamycyna powoduje, m.in. znaczny spadek liczby bakterii beztlenowych, pojawienie się opornych na antybiotyki enterokoków i enterobakterii. Cefalosporyny powodują przerost grzybów z rodzaju Candida oraz zaburzają równowagę między liczbą bakterii tlenowych i beztlenowych w jelitach. Antybiotyki z grupy penicylin powodują oporność na antybiotyki enterobakterii, wzrost liczby bakterii tlenowych Gram-dodatnich oraz bakterii beztlenowych. Najsilniejszy wpływ na skład mikroflory mają fluorochinolony, które znacznie obniżają liczbę bakterii beztlenowych, enterobakterii, tlenowych ziarniaków Gram-dodatnich, powodują pojawienie się opornych na antybiotyki Bacteroides oraz przerost grzybów z rodzaju Candida. Mikroflora chorych na CDI ma zmniejszoną różnorodność szczepów [25]. Obserwowano, że już pojedyncza dawka klindamycyny powodowała długotrwałe zmiany w mikroflorze jelita cienkiego i grubego u myszy z około 90% utratą różnorodności zasiedlających je szczepów [18]. Zdrowe myszy po zakażeniu sporami Clostridium zostają bezobjawowymi nosicielami przez długi czas. Zakażenie myszy bakterią C. difficile po stosowaniu klindamycyny spowodowało natychmiastową kolonizację, obniżenie różnorodności składu mikroflory oraz przenoszenie choroby z jednego osobnika na drugi. Zaprzestanie kuracji antybiotykowej nie przynosiło pozytywnych wyników u części leczonych myszy [69]. O rozwinięciu zakażenia decyduje w dużej mierze stan fizjologiczny mikroflory (jej ilościowy i jakościowy skład), a także czynniki związane z układem odpornościowym (poziom pobudzenia układu, poziom wytwarzanych przeciwciał, liczbę odpowiednich receptorów na powierzchni komórek nabłonka).

Szybki wzrost liczby zakażeń bakterią Clostridium difficile, rosnąca liczba przypadków śmiertelnych wśród osób starszych, pojawianie się szczepów hiperwirulentnych oraz coraz liczniejsze przypadki zakażeń poza placówkami służby zdrowia powodują, że ten patogen staje się poważnym zagrożeniem dla zdrowia i życia pacjentów i  jest jednym z  głównych tematów badań dotyczących zakażeń szpitalnych. Brakuje bezpiecznych i szybkich sposobów leczenia. Obecnie na całym świecie odchodzi się od szerokiego stosowania antybiotyków, ze względu na oporność bakterii i powodowane trwałe zaburzenia mikroflory jelitowej pacjenta. Z wielu pomysłów, jak radzić sobie z problemem zakażeń bakteryjnych, na szczególną uwagę zasługują szczepionki oraz przeciwciała lecznicze nakierowane na elementy bakteryjne niezbędne w procesie kolonizacji gospodarza. W ten sposób nie dopuszcza się do rozwinięcia zakażenia. Mimo wielu potencjalnych antygenów, które mogą znaleźć zastosowanie w szczepionkach przeciw C. difficile wciąż istnieje uzasadniona potrzeba prowadzenia dalszych badań w tej dziedzinie. Oprócz mechanizmu kolonizacji należałoby również dokładnie poznać odpowiedź układu odpornościowego zakażonych pacjentów, jak i mechanizm bezobjawowego nosicielstwa w celu poznania czynników, które działają ochronnie i  nie pozwalają na rozwinięcie stanu chorobowego. Obecnie najskuteczniejszą terapią alternatywną jest przeszczep flory bakteryjnej od zdrowego dawcy, jednak z wielu powodów nie jest to terapia powszechnie stosowana. Do potencjalnych narzędzi profilaktycznych należy zaliczyć, oprócz będących w fazie badań klinicznych szczepionek opartych na toksynach, zastosowanie preparatów probiotycznych u osób z grupy ryzyka. Należy nieustannie szkolić pracowników szpitali i innych placówek opieki medycznej o  niebezpieczeństwie, jakie wiąże się z  CDI i  na temat dużej oporności bakterii oraz łatwości jej przenoszenia między pacjentami. Jak dotąd najlepiej rozwinięta jest diagnostyka zakażeń C. difficile. Dostępne są szybkie i pewne metody oznaczania patogenu z jednoczesnym określeniem, czy jest to szczep toksynotwórczy. Dzięki diagnostyce pacjent może zostać natychmiast odizolowany od innych chorych i poddany odpowiedniemu leczeniu.

Pełna treść artykułu