Abstrakt

Aptamery są nową klasą cząsteczek, które odkryto w latach 90 ubiegłego wieku. Są to najczęściej oligonukleotydy DNA bądź RNA, których długość waha się między 20 a 80 nt. Wytwarzane są z wykorzystaniem metod SELEX, które pozwalają na uzyskanie aptamerów wiążących się z teoretycznie dowolną badaną cząsteczką, zapewniając bardzo dobrą swoistość. Aptamery mogą być wykorzystywane zamiast przeciwciał ponieważ ich czułość jest na podobnym, a niekiedy wyższym poziomie i nie wykazują immunogenności oraz można je syntetyzować in vitro. Dotąd przedstawiono wiele różnych zastosowań aptamerów: od składników biosensorów po wykorzystanie w różnych technikach laboratoryjnych, takich jak mikromacierze czy chromatografii. Jedną z najważniejszych jest wykorzystanie aptamerów w medycynie, a zwłaszcza w walce z nowotworami. Mogą służyć zarówno do diagnostyki nowotworów jak i do ich zwalczania, zwłaszcza w sposobie dostarczania leków. Najwięcej badań związanych z transportem leków poświęcono dostarczaniu chemioterapeutyków, np. doksorubicyny. Znalazło to zastosowaniew badaniach nad komórkami raka wątroby, stercza, czy komórek ostrej białaczki limfoblastycznej. Inną możliwością jest wykorzystanie aptamerów do dostarczania cząsteczek siRNA. W taki sposób możliwa jest inhibicja procesu kontroli jakości mRNA w komórkach nowotworowych. Kompleks aptameru z lekiem pozwala na bezpośrednie dostarczenie substancji aktywnej do komórek określonego typu, eliminując w znacznym stopniu działanie nieswoiste leku.

Wstęp

Aptamery są najczęściej jednoniciowymi oligonukleotydami RNA lub DNA o ściśle określonej strukturze przestrzennej. Ich odkrycie i rozwój to początek lat 90 ub.w. Miały w tym udział dwie niezależne grupy – Golda [49] i Szostaka [7]. Wykazali bowiem, że te krótkie kwasy nukleinowe cechują się zdolnością przestrzennego dopasowania się do różnych cząsteczek oraz łączenia z nimi za pomocą wiązań niekowalencyjnych. Każdy aptamer składa się z dwóch czę- ści: sekwencji losowej oraz flankujących ją sekwencji komplementarnych do starterów (ryc. 1). Sekwencja losowa jest rdzeniem całego aptameru i określa jego strukturę. Jej długość jest różna, zazwyczaj waha się między 20 a 80 nukleotydów [46], chociaż niekiedy jest wymagane zastosowanie znacznie dłuższych – 100 nukleotydowych sekwencji. Im dłuższy łańcuch, tym proces jest mniej wydajny, ale jednocześnie uzyskuje się znacznie bardziej skomplikowane struktury, co zwiększa selektywność jego wiązania z badaną cząsteczką [46]. Sekwencje komplementarne do starterów są konieczne do amplifikacji wyselekcjonowanych aptamerów metodą PCR (ryc. 1).

Aptamery mogą się wiązać z cząsteczkami o zróżnicowanej strukturze i budowie chemicznej. Mogą być to niewielkie cząsteczki, takie jak: nukleotydy [39], jony metali [23], kofaktory [36], aminokwasy [13] czy też antybiotyki [1], ale również makrocząsteczki: białka, kwasy nukleinowe, czy cukry [51]. Choć masa nie jest najważniejszym czynnikiem, to warto zaznaczyć, że wraz ze wzrostem powierzchni cząsteczki docelowej, zwiększa się szansa przyłączenia aptameru, dzięki obecności dużej liczby miejsc wiązań aptameru do cząsteczki. Czynnikiem decydującym o możliwości zaprojektowania aptameru są wiązania, które mogą powstać między kompleksem aptamer-target. Obecność donorów/akceptorów wią- zania wodorowego, czy dodatniego ładunku znacznie zwiększa zdolności wiązania aptameru. Jednak charakter hydrofobowy, czy też ujemny ładunek sumaryczny cząsteczki wpływają negatywnie na wiązanie aptameru do cząsteczki docelowej [46].

Odpowiednia selekcja to główny etap wytwarzania aptameru; najlepszym sposobem selekcji jest algorytm SELEX złożony z kilku etapów (ryc. 2):

• Przygotowanie biblioteki losowych cząsteczek DNA, syntezowanych metodą chemii kombinatorycznej. Taka biblioteka składa się zazwyczaj z 1013-1015 oligonukleotydów, które pokrywają w większym lub mniejszym stopniu całkowitą możliwą liczbę aptamerów dla danej długości sekwencji losowej. Całkowita liczba wynosi XN, gdzie X to liczba nukleotydów – zazwyczaj cztery, od A C T G, a N to długość sekwencji losowej.

• Inkubacja badanej cząsteczki z biblioteką oligonukleotydów.

• Przeprowadzenie selekcji na zasadzie frakcjonowania roztworu inkubacyjnego na dwie części: kompleksy aptamer-cząsteczka oraz niezwiązane aptamery. W tym celu stosuje się wiele różnych technik. Na przykład, zastosowanie chromatografii powinowactwa pozwala na uzyskanie aptamerów o optymalnym powinowactwie po 30 turach selekcji, a z użyciem μFFE już nawet po 4 [17]. W innych metodach stosuje się: kolumny chromatograficzne, membrany nitrocelulozowe oraz fotosieciowanie [11]. Oligonukleotydy wykazujące powinowactwo do badanej czą- steczki zostają wykorzystane w reakcji PCR jako matryca. Szczególne znaczenie w procesie powielania aptamerów odgrywają ich sekwencje flankujące.

Liczba cykli w reakcji PCR jest zmienna dla różnych aptamerów i badanych substancji. Niekiedy wystarcza kilka cykli, a czasmi może być konieczne powtórzenie selekcji kilkana- ście razy. Zazwyczaj proces zamyka się w 8-15 cyklach [48]. Warto podkreślić, że bardzo często stosowaną procedurą na tym etapie jest selekcja negatywna. Polega na dodaniu etapu inkubacji z cząsteczkami podobnymi do badanej. Dzięki temu można zwiększyć swoistość wyselekcjonowanego aptameru. W przypadku wytwarzania aptamerów RNA, konieczne jest korzystanie z biblioteki cDNA połączonej z procesem odwrotnej transkrypcji [5,37]. Istnieje bardzo wiele odmian metody SELEX, które są wykorzystywane w konkretnych badaniach. Spośród nich, do walki z nowotworami stosuje się SELEX: bezstarterowy, przełącznikowy, warunkowy, genomowy, dopasowany, komórkowy oraz tkankowy [34].

Zalety i wady aptamerów

Jak każde narzędzie, tak i aptamery mają zalety i wady, najważniejsze z nich to [44]:

• Niewielki rozmiar: umożliwia penetrację tkanki, czy przechodzenie przez bariery, takie jak bariera krew-mózg [3], ale niewielkie cząsteczki aptamerów mogą być łatwo wypłukane z organizmu. Dlatego też konieczne jest stosowanie modyfikacji, w celu przedłużenia ich przebywania w organizmie człowieka. • Swoistość wobec badanej cząsteczki, która często jest na poziomie przeciwciał. • Brak lub niewielka odpowiedź immunologiczna oraz brak toksyczności. Daje to możliwość szerokiego zastosowania aptamerów w wielu chorobach. • Niewielki koszt produkcji w porównaniu do konkurencyjnych dla nich przeciwciał. • Produkcja przebiega in vitro przez co nie ma możliwości zanieczyszczenia biologicznymi czynnikami toksycznymi mogącymi indukować odpowiedź immunologiczną, jak również eliminuje wątpliwości natury etycznej związane z wykorzystaniem zwierząt do produkcji przeciwciał. • Dzięki zastosowaniu standardowej metody – SELEX oraz automatyzacji łatwiej uzyskać powtarzalność uzyskiwanych aptamerów. • Duża stabilność cząsteczek – odporność na działanie temperatur i czynników uszkadzających białka oraz zdolność do łatwej renaturacji, po zaburzeniu struktury przestrzennej. • Bardzo duża różnorodność cząsteczek docelowych. • Wrażliwe na degradację przez nukleazy, wymusza to zastosowanie modyfikacji szkieletu fosforanowego. Najczę- ściej stosowane modyfikacje to: modyfikacje przy węglu 2’ przez dodanie –fluoropyrimidyny, ‑aminopyrimidyny [32] oraz grupy –O-metylowej [2], do końca 3’ przez dodanie odwróconej tymidyny [20] oraz biotyny [6], jak również do końca 5’ cholesterolu [26], kwasów tłuszczowych [42] czy polikationów [50].

Ogólne zastosowanie aptamerów

Biosensory

Aptamery są powszechnie stosowane jako elementy biosensorów do oznaczania różnych substancji [41]. Można je wykorzystać do oceny zanieczyszczenia środowiska takimi substancjami jak jony metali ciężkich (Pb2+, Hg2+, Cu2+) czy substancje toksyczne (pestycydy, mikotoksyny) [40]. W tym celu wykorzystuje się różne strategie, np. zaawansowanych metod w doświadczeniu Hoanga i wsp. [14], którzy zaproponowali badanie metodą FT- -SPR stężenia jonów rtęci Hg2+ w wodach jezior. W tym celu przygotowano płytki z nanocząsteczkami złota, do których wiązały się S-końcem cząsteczki aptamerów z 15 nukleotydami tyminy. Ponieważ między nanocząsteczkami złota średnia odległość wynosi około 10 nm, a łańcuchy tyminy mają dużą zdolność wiązania jonów rtęci, moż- liwe było ich uwięzienie w szczelinach między nanoczą- steczkami i zmierzenie widm IR. Taka metoda pozwala na oznaczenie 37 ppt jonów rtęci w roztworze.

Aptamery zostały również wykorzystane do oznaczania obecności różnych czynników wytwarzanych przez patogeny [53]. Jeon i wsp. przedstawili sposób kolorymetrycznego oznaczania pasożytów z rodzaju Plasmodium: P. vivax i P. falciparum – powodujących malarię [16]. W tym celu wyprodukowali aptamer – pL1, swoisty wobec dehydrogenaz mleczanowych wspomnianych gatunków. Do indukowania barwy wykorzystano nanocząsteczki złota (13 nm średnicy), które w stanie wolnym mają kolor czerwony, a po agregacji nadają roztworowi w którym się znajdują kolor niebieski. Zazwyczaj agregacja otrzymywana jest w wyniku użycia dużych stężeń różnych soli. W doświadczeniu użyto kationowych polimerów: PDDA i PAH, które oprócz wydajniejszej agregacji cząsteczek złota, potrafią elektrostatycznie wiązać się z cząsteczkami DNA. Stężenia dehydrogenaz mleczanowych oceniano następująco: do badanego roztworu dodano aptamer pL1. Gdy w roztworze obecna była dehydrogenaza aptamer tworzył kompleks z dehydrogenazą, a polimery kationowe pozostały niezwiązane. Umożliwiło to stworzenie agregatów nanocząsteczki złota-PDDA/PAH i tym samym zmianę barwy z czerwonej na niebieską. Gdy w roztworze nie było dehydrogenazy, polimery wiązały się z aptamerami, uniemożliwiając stworzenia agregatów z cząsteczkami złota. Metoda pozwala szybko i nieuzbrojonym okiem stwierdzić czy w badanej próbce krwi obecna jest dehydrogenaza mleczanowa Plasmodium vivax i Plasmodium falciparum, gdy stężenie dehydrogenaz jest co najmniej na poziomie 1 nM.

Narzędzia w metodach laboratoryjnych

Aptamery z powodzeniem mogą zastąpić niektóre stosowane obecnie metody laboratoryjne wykorzystujące przeciwciała lub sondy oligonukleotydowe [34].

Mikromacierze są jedną z technik, w której wykorzystuje się aptamery. Sosic i wsp. zaproponowali utworzenie SAM zdolnej do wykrycia dwóch antygenów: VEGF165 oraz trombiny, które strukturalnie charakteryzują się podobnymi domenami [18,45]. Szklaną płytkę pokryto odpowiednimi aptamerami wyłapującymi: Vap7(12T)NH2 dla VEGF165 oraz TBA1(12T)NH2 dla trombiny, po czym naniesiono mieszaninę wspomnianych białek. Do detekcji użyto odpowiednio aptamery: Alexa555-VEa5 i Alexa647-TBA2, które były sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym Alexa 555 (kolor czerwony) i Alexa 647 (kolor zielony). Uzyskano jednolite barwy wskazujące na swoistą detekcję odpowiednich białek. W dalszej części eksperymentu zastosowano barwnik cyjaninę 5 z aptamerami detekcyjnymi i zestawiono je z odpowiednimi białkami bez znacznika oraz wyznakowane Alexa-555. Pozwoliło to uzyskać w przypadku białek wyznakowanych Alexa-555, kolor żółty.

Innym coraz częstszym zastosowaniem aptamerów, jest użycie ich w chromatografii [43]. Takie wykorzystanie aptamerów opisali Han i wsp. [12] w badaniu stworzyli kolumnę monolityczną do HPLC, w której immobilizowano aptamery swoiste wobec lizozymu – białka występującego w dużych ilościach w białku jaja kurzego. Uzyskano gę- stość immobilizacji aptameru na poziomie 290 pmol/μl. Pozwoliło to na bardzo wydajne i swoiste wyekstrahowanie i oznaczenie lizozymu pochodzącego z kurzego jaja.

Aptamery w terapii nowotworowej

Jak już wspomniano wcześniej, podstawą działania aptamerów jest ich przestrzenne dopasowanie się do wybranej cząsteczki. Mechanizm umożliwia blokowanie interakcji między różnymi czynnikami, które są istotne dla metabolizmu, a także pozwala na ograniczenie migracji komórek nowotworowych. Jednocześnie mechanizm wią- zania aptameru jest na tyle swoisty, że nie wpływa negatywnie na zdrowe komórki. Zdolność migracji komórek nowotworowych jest bardzo istotnym czynnikiem rozwoju choroby oraz jej diagnozy. Wraz ze wzrostem tej zdolności, rokowania pacjentów drastycznie spadają. Do ograniczenia migracji komórek nowotworowych, Zueva i wsp. [54], zaproponował użycie aptamerów. W tym celu stworzono linię komórek nowotworowych chomiczych fibroblastów, która po infekcji wirusem Schmidt-Ruppina D charakteryzowała się różnym stopniem przerzutowania. Selekcja tak uzyskanych komórek nowotworowych pozwoliła na wyodrębnienie z nich linii charakteryzującej się wysokim stopniem przerzutowania HM oraz niskim stopniem migracji LM. W oparciu o tak uzyskane komórki nowotworowe w następnym etapie badań przeprowadzono komórkowy SELEX w celu stworzenia aptamerów swoiście wiążących się do komórek HM. Wynikiem tych badań było opracowanie aptamerów RNA: E10 oraz E37, które dwukrotnie obniżały stopień migracji badanych komórek nowotworowych. Na podstawie zaobserwowanych zmian fenotypowych, przypuszczano, że wspomniane aptamery obniżają stężenie pięciu ufosforylowanych kinaz tyrozynowych (Fak, Alk, Zap70, Syk oraz Frk), co zostało potwierdzone na mikromacierzach białkowych.

Aptamery wykorzystano również do ograniczenia migracji komórek nowotworowych w sposób pośredni, tzn. celem ich wiązania stały się białka receptorowe. Jako przykład może posłużyć integryna ανβ3, która bierze udział w procesach migracji, wzrostu, angiogenezy, przerzutowania i proliferacji komórek nowotworowych. Dotychczas integryna ανβ3 była blokowana za pomocą przeciwciał monoklonalnych oraz tripeptydu RGD, obecnie stosuje się do tego celu aptamer Apt-ανβ3 [29]. Badania przeprowadzono na liniach komórek HUVEC, gdzie stwierdzono wzrost apoptozy komórek nowotworowych. Przyczyną tego zjawiska był TNF-α, którego działanie było tym silniejsze, im wyższe zastosowano stężenie aptameru.

Inny przykład aptameru RNA, który działa jako inhibitor, przedstawili Kim i wsp. [19]. W pierwszych badaniach opisali nowe białko sekrecyjne, które ulegało nadekspresji w gruczolakoraku trzustki – PAUF. Białko to ma duże znaczenie diagnostyczne, gdyż jego nadekspresja wzmaga wzrost, migrację i inwazję komórek raka. Następnie przeprowadzono SELEX puli cząsteczek RNA względem PAUF, uprzednio eliminując aptamery swoiste względem białek ludzkiej IgG Fc lub białka G. Do oceny działania aptameru wobec PAUF, wykorzystano linie komórkowe ludzkiego raka trzustki (PANC-1 i CFPAC-1) oraz myszy BALB/c, którym zaszczepiono komórki CFPAC-1. Po podaniu aptameru, zarówno u myszy jak i w liniach komórkowych uzyskano jednoznaczne zablokowanie wzrostu nowotworu.

W ostatnich kilku latach połączono technologię produkcji aptamerów z systemami ekspresji białek w układach heterologicznych. Na przykład wytwarzanie ludzkiej α-fetoproteiny w komórkach Escherichia coli. Alfa-fetoproteina jest białkiem, które ulega ekspresji głównie w życiu płodowym ludzi i gwałtownie spada po narodzinach. U dorosłych osób jest obecna w krwiobiegu w czasie choroby nowotworowej (głównie w raku wątrobowokomórkowym) oraz w przypadkach wad rozwoju układu nerwowego. Zwłaszcza w tym pierwszym przypadku dopatrywano się wykorzystania aptamerów jako czynnika blokującego aktywność α-fetoproteiny. Opisane sposoby okazały się sukcesem i w badaniach na nowotworowych liniach komórek wątroby ograniczono ich proliferację [22].

Aptamery służące jako system transportu leków

Istnieje wiele leków do walki z nowotworami, jednak użycie większości z nich wiąże się z problemem nieswoistości działania. Zastosowanie aptamerów jako systemu dostarczania leków do określonych komórek pozwala na zminimalizowanie bądź wyeliminowanie negatywnych skutków używania leków antynowotworowych.

Chemioterapeutyki

Chemioterapia jest jedną z najważniejszych metod leczenia nowotworów. Jednak jej główną wadą jest brak swoistego działania w stosunku do komórek nowotworowych, co powoduje powstawanie ogólnoustrojowych działań niepożądanych. Możliwym rozwiązaniem tego problemu jest połączenie chemioterapeutyku z cząsteczką rozpoznającą określone struktury. Tym samym aptamery są bardzo atrakcyjnymi cząsteczkami, które pozwalają na bezpośrednie dostarczanie leku do komórek nowotworowych.

Powszechnie stosowanym lekiem w walce z nowotworami jest doksorubicyna, która stała się modelem w pracach nad systemem transportu leków z wykorzystaniem aptamerów. Jest to związek z rzędu antracyklin, który działa cytostatycznie przez wiązanie z DNA, blokując możliwość podziału komórki i jej śmierć. Zaproponowano kilka róż- nych sposobów połączenia doksorubicyny z aptamerami. Jednym z najprostszych sposobów jest wykorzystanie właściwości doksorubicyny do interkalacji z fragmentami DNA, szczególnie bogatymi w regiony GC. W badaniu nad aptamerami swoistymi wobec komórek raka wątroby [28], do selekcji aptamerów użyto komórkowe SELEX, dzięki któremu uzyskano aptamer TLS11a. Następnie przeprowadzono łączenie długich łańcuchów GC do tego aptameru. Dzięki temu do jednego aptameru mogło dołączyć się do 28 cząsteczek leku (ryc. 3).

W celu weryfikacji skuteczności takiego kompleksu przeprowadzono dwie próby działania aptameru z lekiem oraz wolnej doksorubicyny na liniach komórkowych i myszach [28]. Zaobserwowano działanie doksorubicyny zarówno związanej z aptamerem jak i wolnej. Kompleks doksorubicyny z aptamerem był znacznie mniej cytotoksyczny niż sam lek. Podobny mechanizm zastosowano również w badaniu komórek raka piersi [24]. Nieco odmienną technikę zastosowano w linii komórkowej ostrej białaczki limfoblastycznej [52], gdzie zastosowano polimery aptamerów skierowanych przeciwko białaczce, między którymi umieszczono sekwencje wydajnie wiążące doksorubicynę. Inną możliwością związania oligonukleotydu z lekiem jest zastosowanie między nimi łącznika. Huang i wsp. zaproponowali w tym celu użycie EMCH i aptameru z dołączoną do końca 5’ grupą tiolową uzyskanego za pomocą komórkowego SELEX [15]. W odpowiednich warunkach powstaje trójskładnikowa cząsteczka: doksorubicyna-EMCH-aptamer. Porównano działanie tej cząsteczki z działaniem czystego leku na trzech liniach: ludzkie komórki T ostrej białaczki limfoblastycznej, komórki B chłoniaka Burkitta oraz komórki ostrej białaczki promielocytowej [15]. W każdym przypadku, uzyskano obniżoną żywotność linii komórek nowotworowych.

Innym, bardzo interesującym przykładem wykorzystania aptamerów i doksorubicyny, jest dimer działający przeciw rakowi stercza [31]. Jednym z najczęstszych markerów służących do wykrywania i zwalczania raka stercza, jest swoisty jego antygen błonowy (PSMA). Odnotowano istnienie dwóch linii tego nowotworu – PSMA dodatnia i ujemna. W celu dostarczenia doksorubicyny do obu typów, stworzono dwa aptamery – RNA swoisty dla linii dodatniej i peptydowy dla linii ujemnej. Zosta- ły sprzęgnięte z biotyną, które połączono z kompleksem streptowidyny. Po dodaniu doksorubicyny, która interkaluje w aptamer RNA, zbadano skuteczność tego leku. Stwierdzono skuteczność u obu linii na poziomie użycia czystego chemioterapeutyku, jednocześnie eliminując nieswoiste oddziaływania wobec komórek zdrowych [31].

Doksorubicyna nie jest jedynym chemioterapeutykiem, który może być wykorzystywany z aptamerami. Innym opisanym lekiem jest dołączenie gemcytabiny. Jest to analog nukleotydu cytozyny, który może zostać wbudowany w nić DNA, co zaburza proces replikacji i wywołuje śmierć komórki. Gemcytabina została użyta w połączeniu z aptamerem specyficznym wobec EGFR przeciw rakowi trzustki [35]. Ponieważ EGFR jest nadmiernie wytwarzana w tym typie nowotworu, możliwe jest znaczne obniżenie przyjmowania leku przez zdrowe komórki.

Bardzo interesującym rozwiązaniem jest połączenie z aptamerem kropki kwantowej (QD), nanocząsteczki, będącej półprzewodnikiem. Znajduje zastosowanie jednocześnie jako barwnik fluorescencyjny, również jako nośnik dostarczający różne czynniki. Pozwala to na znaczne rozszerzenie zastosowań wielu modeli leczenia. Przykładem użycia kropki kwantowej, jest jej wykorzystanie do dostarczania doksorubicyny do komórek z nadekspresją genu MUC-1 [44]. Uzyskanie QD-COOH pozwoliło na dołączenie zarówno aptameru swoistego wobec MUC-1, jak i doksorubicyny. Następnie wykorzystując wielolekooporną ludzką linię raka jajnika A2780/AD, a także myszy z zaszczepioną wspomnianą linią komórkową, zbadano internalizację i działanie QD. Stwierdzono, że sprzężone cząsteczki bardzo wydajnie były pobierane do wnętrza komórki i powodowały niewielką cytotoksyczność wobec zdrowych (głównie dlatego, że w QD są obecne jony kadmu i selenu) [38].

Niskocząsteczkowy interferujący RNA

Do 1980 r. RNA było powszechnie uważane za pasywne medium, uczestniczące tylko w przenoszeniu informacji genetycznej między DNA a białkiem [30]. Przez kolejne lata poczynając od 1980 r., odkrywano inne funkcje tego polimeru, z jego rolą katalityczną, która stanowi podwaliny pod koncepcję „świata RNA” [10]. W 1998 r. poznano inne rodzaje kwasów rybonukleinowych zdolne do degradacji cząsteczek mRNA określonego genu [9].

Natura cząsteczek siRNA pozwala na bardzo precyzyjne wyciszanie genów, jednak sposobem do użycia jej w celach leczenia nowotworów jest wyodrębnienie dobrego narzę- dzia, które pozwoli na uwolnienie siRNA tylko w określonym typie komórek. W innym przypadku, podobnie jak w przypadku chemioterapeutyków, działanie toksyczne będzie widoczne również w zdrowych komórkach. Najprostszym sposobem dostarczania siRNA, jest stworzenie chimery aptamer-siRNA. Taki mechanizm zastosowano do wyciszania ekspresji komórek raka stercza [27]. Celem działania kompleksu stały się dwa geny: Bcl-2 oraz PLK1, należące do genów podstawowego metabolizmu (housekeeping gens). Użyty aptamer był skierowany przeciwko swoistemu antygenowi błonowemu stercza (PSMA).

Po związaniu części aptamerowej chimery z PSMA, następowała jej endocytoza do wnętrza komórki. Po uwolnieniu z endosomu, cząsteczka aptamer-siRNA podlegała cięciu za pomocą endonukleazy Dicer, powodując uwolnienie siRNA. Następnie była przetwarzana i wbudowana w kompleks wyciszający RISC, pozwalając na wyciszanie tych genów. Uzyskano w ten sposób regresję raka stercza. Dassie i wsp., opierając się na pracy McNamary i wsp. [27], zmodyfikowali chimerę aptamer-siRNA wobec PLK1 w taki sposób, aby zwiększyć wyciszenie oraz przedłużyć czas występowania chimery w organizmie [4]. Zmianie uległy trzy elementy: aptamer skrócono z 71 nukleotydów do 39 przy zachowaniu jego funkcjonalności, dodano dwa nukleotydy do ds siRNA, co wzmocniło rozpoznanie przez enzym Dicer. Wreszcie do drugiej nici w ds siRNA dołączono 20 kDa łańcuch PEG, który podnosił masę całego układu i poprawiał właściwości farmakokinetyczne kompleksu.

Innym możliwym wykorzystaniem siRNA w połączeniu z aptamerem jest zatrzymanie procesu kontroli jakości mRNA NMD [33]. NMD to system eliminacji cząsteczek mRNA, które w  swojej strukturze mają przedwcześnie wbudowany kodon STOP. Na ten proces wpływają różne czynniki, takie jak: SMG1 oraz UPF1, UPF2 i UPF3. Celem doświadczenia było skierowanie siRNA przeciw dwóm spo- śród wspomnianych czynników: SMG1 oraz UPF2. Następnie sprzęgnięto cząsteczki siRNA z aptamerem swoistym wobec PSMA, co pozwoliło na swoiste wniknięcie całej chimery do wnętrza komórki. W celu weryfikacji metody użyto myszy z wszczepioną nowotworową linią komórkową B16/F10, wykazującą ekspresje czynnika PSMA. Po podaniu myszom aptameru z siRNA blokującym NMD, stwierdzono, że u większości wystąpiło obniżone przerzutowanie nowotworu, a nawet nie stwierdzono jego obecności [33].

Fototerapia

Innym wykorzystaniem aptamerów jest użycie ich do dostarczania fotouczulacza, podstawowego składnika fototerapii. Polega na dostarczeniu substancji fotouczulającej do komórki nowotworowej, aktywowaniu jej światłem, po czym następuje przemiana występującego w komórce tlenu w postaci reaktywne, które uszkadzają elementy komórki (ryc. 4).

Chociaż niektóre nowotwory wykazują właściwości zwiększonego wchłaniania fotouczulaczy, zastosowanie aptamerów może zwiększyć ich wchłanianie przez komórki nowotworowe jednocześnie ograniczając wchłanianie tych substancji przez komórki zdrowe.

Taki model zastosowano w badaniu nad nabłonkowymi komórkami nowotworowymi [8]. W tym celu szukano takich antygenów, które w nieznacznym stopniu ulegają ekspresji w piersi, płucach, okrężnicy, jajnikach i trzustce, a ulegają znamiennej ekspresji w ich nowotworowych odpowiednikach. Wybrano różne warianty MUC-1. Do aptamerów DNA skierowanych przeciwko nim dodano do końca 5’ fotouczulacz – chlorynę e6. Po naświetlaniu światłem o długości 664 nm zbadano przeżywalność komórek nowotworowych. Stwierdzono, że zastosowanie terapii z fotouczulaczem było co najmniej 500-krotnie bardziej toksyczne dla komórek nowotworowych niż użycie samej chloryny e6. Podobne postępowanie zastosowano przeciwko komórkom Ramosa i Burkitta [25] czy komórkom IL-6 dodatnim [21].

Podsumowanie

Aptamery są nowym i obiecującym narzędziem w terapii nowotworowej. Chociaż zostały opisane po raz pierwszy na początku lat 90 ubiegłego wieku, leki projektowane w oparciu o nie są dopiero teraz sukcesywnie wprowadzane w leczeniu nowotworów [47]. Ich produkcja jest oparta o usystematyzowaną metodę SELEX, która choć czaso – i pracochłonna, pozwala uzyskać powtarzalne wyniki. Funkcjonalnością dorównują przeciwciałom, a kosztami produkcji, odpornością na denaturację i możliwościami zastosowań przewyższają je. Wraz z opracowaniem innych metod modyfikacji aptamerów w celu ochrony przed degradacją nukleazami, mają szansę stać się jednym z ważnych sposobów dostarczania leków o dużej swoistości. Dotąd opisano wiele prób ich wykorzystania, które można podzielić na dwie główne grupy. Pierwsza z nich, to użycie aptamerów jako bezpośrednich inhibitorów. Druga to użycie ich jako systemu dostarczania chemioterapeutyków, środków fotouczulających czy też cząsteczek siRNA.

Pełna treść artykułu