Streszczenie

Techniki biologii molekularnej znajdują coraz szersze zastosowanie w toksykologii, co spowo­dowało powstanie odrębnej dziedziny jaką jest toksykologia molekularna. Toksykologia moleku­larna zajmuje się wykrywaniem i badaniem zmian wywołanych ksenobiotykami już na poziomie molekularnym, a zwłaszcza badaniem mutacji w genomowym DNA, różnic na poziomie ekspre­sji mRNA czy genotypu warunkującego osobniczą wrażliwość.
W procesach aktywacji i detoksykacji ksenobiotyków, w tym leków oraz środowiskowych karcy­nogenów uczestniczy wiele enzymów (xenobiotic-metabolizing enzymes – XMEs). Większość substancji chemicznych wprowadzanych do naszego organizmu, niezależnie czy ma właściwości lecznicze, chorobotwórcze czy kancerogenne, wymaga aktywacji metabolicznej przez enzymy I fazy (cytochrom P-450). Kolejny proces to zwykle detoksykacja przez enzymy II fazy, głów­nie hydrolazy epoksydowe, transferazy glutationowe, N-acetylotransferazy czy sulfotransfera­zy. Techniki PCR pozwalają na precyzyjne badanie wpływu ksenobiotyków na komórki i tkanki przez badanie poziomu aktywacji genów kodujących enzymy I i II fazy, bądź przez badanie ak­tywności innych elementów transkryptomu. Istotne są też badania wrażliwości poszczególnych komórek lub tkanek oparte o badania obecności mutacji lub polimorfizmu genów.
W pracy przedstawiono możliwości zastosowania różnych technik PCR w toksykologii. Wykazano możliwość wykorzystania metod PCR w badaniach nad genetycznie uwarunkowaną wrażliwością na działanie ksenobiotyków, technik qPCR oraz qRT-PCR w wyszukiwaniu biomarkerów ekspo­zycji ze szczególnym uwzględnieniem poszczególnych izoform cytochromu P-450. Przedstawiono możliwość zastosowania techniki pokazu różnicowego w identyfikacji nowych genów aktywowa­nych czynnikami toksycznymi.

Słowa kluczowe:PCR • qRT-PCR • toksykologia molekularna • biomarkery toksyczności

Summary

Molecular biology techniques have become widely used in toxicology, leading to the creation of a new science – molecular toxicology. The goal of molecular toxicology is to detect and study the changes induced by xenobiotics at the molecular level. The research scope of molecular to­xicology includes examination of mutations in genomic DNA, differences in mRNA expression and study of genotype indicating individual sensitivity.
The processes of activation and detoxification of xenobiotics, drugs and environmental carcino­gens involve several enzymes (xenobiotic-metabolizing enzymes – XMEs). Most of the chemi­cals entering our bodies, regardless of whether they have medical, pathogenic or carcinogenic properties, require metabolic activation by phase I enzymes (cytochrome P-450). In the next pro­cess the phase I products are usually detoxified by phase II enzymes, mainly by epoxide hydrola­se, glutathione transferase, N-acetyltransferase or sulfotransferase. PCR techniques allow preci­se study of the effects of xenobiotics on cells and tissues by examining the level of activation of genes coding for phase I and II enzymes, or by testing the activity of other elements of the trans­criptome. Studies of sensitivity of individual cells or tissues based on examination of mutation or gene polymorphism presence are also relevant.
This paper presents the possibility of using various PCR techniques in toxicology and especial­ly in the study of genetically determined sensitivity to xenobiotics. It also covers the possibilities of applying qPCR and qRT-PCR methods in the search for exposure biomarkers with particular emphasis on individual cytochrome P450 isoforms. Furthermore, it provides information about the possibility of implementing the differential display technique in the identification of new ge­nes activated by toxic agents.

Key words:PCR • qRT-PCR • molecular toxicology • toxicity biomarkers

1. Wstęp

Techniki biologii molekularnej wprowadzone do badań tok­sykologicznych zapoczątkowały rozwój toksykologii mole­kularnej. W dzisiejszych czasach, gdy jesteśmy nieustan­nie narażeni na szkodliwe działanie rozmaitych substancji chemicznych, toksykologia molekularna, badając zmiany już na poziomie molekularnym, poszukuje odpowiedzi na pytania: w jakich dawkach dana substancja jest szkodliwa dla indywidualnej jednostki, czy na każdego z nas kseno­biotyk działa w takim samym stopniu, jakie uszkodzenia wywołuje stałe narażenie na dany czynnik. W zakres tok­sykologii molekularnej wchodzą techniki, które być może umożliwią w przyszłości wykrycie, wcześniej niż konwen­cjonalnymi metodami, zmian wywołanych substancjami chemicznymi, czy też pozwolą przewidywać wpływ da­nego czynnika chemicznego na nasz organizm w zależ­ności od zmienności osobniczej.

Ekspresja genów tworzących genom komórkowy podlega zmianom pod wpływem różnych sygnałów pochodzenia wewnętrznego i zewnętrznego. Sygnały te mogą zmieniać zarówno syntezę mRNA (działać na poziomie transkryp­cji), jak i syntezę białka (działać na poziomie translacji) [25], bądź wywoływać zmiany na poziomie DNA (mutacje punktowe). Obecnie toksykolodzy coraz częściej sięgają po metody biologii molekularnej w badaniach nad stopniem toksyczności leków, substancji przyjmowanych z pożywie­niem czy też czynników środowiskowych.

Jedną z technik wykorzystywanych w toksykologii mole­kularnej stała się metoda łańcuchowej reakcji polimerazy PCR (polymerase chain reaction), której niewątpliwymi zaletami są szybkość przeprowadzania analiz, niewielka ilość materiału niezbędnego do wykonania badania, po­wtarzalność wyników, dokładność oraz wysoka czułość.

Możliwe jest, że coraz szerzej stosowane w toksykolo­gii techniki PCR pozwolą nam w przyszłości poznać odpowiedź na pytanie czy praca w określonym narażeniu zawodowym wywoła chorobę. Poznanie wrażliwości osob­niczej pozwoliłoby uniknąć wielu skutków wywołanych substancjami chemicznymi przyjmowanymi z pożywie­niem czy też w postaci leków, a znacznie czulsze metody diagnostyczne umożliwiłyby wykrycie zmian chorobowych na odwracalnym jeszcze poziomie.

Zasada metody PCR

Rewolucją w dziedzinie biologii molekularnej było opra­cowanie w 1983 r. przez Mullisa łańcuchowej reakcji poli­merazy PCR umożliwiającej uzyskanie dużej liczby kopii dowolnego fragmentu DNA. Ten przełomowy wynala­zek, który spowodował szybki rozwój biologii molekular­nej i dziedzin pokrewnych, został w 1993 r. uhonorowany Nagrodą Nobla [4,28].

Metoda PCR pozwala na szybkie powielenie wybrane­go odcinka DNA. Mieszanina substratów: nukleotydów, starterów, matrycy DNA i enzymu – termostabilnej poli­merazy poddana zostaje działaniu cyklicznie zmieniają­cej się temperatury. Do przeprowadzenia reakcji PCR ko­nieczne jest zaprojektowanie dwóch krótkich odcinków DNA, komplementarnych do sekwencji okalających po­wielany przez nas fragment, zwanych starterami (ryc. 1, starter 1, 2). Następnie w pierwszym cyklu reakcji PCR, podczas 3-częściowego procesu (ryc. 1, etap I, II, III) po­wstają 2 cząsteczki powielanego DNA. W każdym kolej­nym cyklu powstaje 2ⁿ cząsteczek DNA (ryc. 1, cykl II), co umożliwia uzyskanie w krótkim czasie wielu kopii ba­danego fragmentu DNA [30].

Ryc. 1. Schemat powielania fragmentu DNA metodą PCR. Podczas pierwszego etapu reakcji PCR (etap I) następuje rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA w temp. 94-98°C (A). W kolejnym etapie reakcji (etap II), podczas którego następuje obniżenie temperatury (40-70°C), do pojedynczej nici DNA wiążą się startery (komplementarne do sekwencji okalających namnażany fragment). W trzecim, ostatnim etapie (etap III), temperatura zostaje podwyższona do ok. 72°C, co powoduje elongację starterów – syntezę nowej nici DNA na ograniczonym starterami fragmencie z udziałem termostabilnej polimerazy. Proces ten jest powtarzany cyklicznie (C) [4,8,28]

Rodzaje technik PCR

Obecnie 17 lat po odkryciu podstawowej reakcji PCR ist­nieje już wiele odmian tej metody, pozwalających na coraz to nowe jej zastosowania. Najbardziej znane to RT-PCR (reverse transcription – PCR), modyfikacja wykorzystująca mRNA jako matrycę [13], nested-PCR, metoda polegająca na zastosowaniu dwóch par starterów różniących się tem­peraturami topnienia, z których tzw. startery zewnętrzne służą do amplifikacji znacznie dłuższego fragmentu DNA, podczas gdy druga para, tzw. startery wewnętrzne, służy do powielenia znacznie krótszego odcinka znajdującego się w obrębie powielonego wcześniej regionu dłuższego. Metoda ta wykorzystywana powszechnie w diagnostyce po­zwala wyeliminować możliwość kontaminacji. Używając do reakcji kilku par starterów, możliwe jest jednoczesne powielenie kilku regionów genomu, do czego wykorzysty­wany jest tzw. multipleksowy PCR (multiplex – PCR), sto­sowany najczęściej do wykrycia nieswoistych produktów. Kolejną odmianą jest ASA-PCR (allele – specific ampli­fication – PCR), gdzie stosowane są specyficzne startery, za pomocą których możliwe jest wykrycie zarówno alleli zmutowanych, jak i prawidłowych. Metoda ta znajduje za­stosowanie w wykrywaniu mutacji punktowych poza miej­scami restrykcyjnymi. Mutacje punktowe mogą być roz­poznane również za pomocą SSCP-PCR (single strand conformation polymorphism – PCR). Istotą tej techniki jest poddanie produktu reakcji PCR denaturacji do poje­dynczej nici, a następnie przeprowadzenie elektroforezy w żelu akrylamidowym w warunkach niedenaturujących, co pozwala przyjąć cząsteczce jednoniciowego DNA cha­rakterystyczne dla jej sekwencji struktury przestrzenne [31,34]. Różnice w strukturze wywołane nawet pojedyn­czą mutacją spowodują odmienną ruchliwość elektrofore­tyczną. Wykrycie mutacji punktowych w obrębie sekwencji rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne bądź mutacji prowadzących do powstania nowych miejsc restrykcyj­nych umożliwia PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism – PCR) na podstawie analizy fragmentów DNA po cięciu danym enzymem restrykcyjnym. Celem RACE-PCR (rapid amplification of cDNA ends – PCR), czyli szybkiej amplifikacji końców cDNA, jest poznanie sekwencji jednego z końców badanego fragmentu mRNA, w zależności od analizowanego końca stosowana jest me­toda 3’RACE lub 5’RACE [12].

Opisane dotychczas metody służą wyłącznie do analizy ja­kościowej sekwencji DNA, znacznie szersze zastosowanie znajdują techniki PCR pozwalające określić początkową ilość DNA, jak w przypadku konkurującego PCR (compe­titive – PCR) czy też pozwalające na monitorowanie ilości DNA poddawanego amplifikacji w czasie rzeczywistym za pomocą najnowszej i najdoskonalszej dotychczas metody zwanej qPCR (quantitative lub real time – PCR) [32,40].

Jeśli materiałem wyjściowym jest RNA stosowana jest metoda qRT-PCR, której pierwszym etapem jest synteza cDNA komplementarnego do matrycy mRNA za pomo­cą odwrotnej transkryptazy. W przypadku konkurujące­go PCR w mieszaninie reakcyjnej umieszcza się badany DNA oraz DNA genu referencyjnego o znanym stężeniu. Liczba sekwencji badanej w próbie określa się porównu­jąc ilości produktów sekwencji badanej i kontrolnej po­wstałych podczas reakcji PCR. Stosując qPCR możliwa jest stała kontrola ilości amplifikowanego DNA na pod­stawie pomiaru sond lub barwników wprowadzonych do reakcji, które łącząc się z powielanym DNA, emitują flu­orescencję proporcjonalnie do ilości powstającego w każ­dym cyklu produktu (ryc. 2, ilustracja G) [17,18]. Pomiar może zostać dokonany w sposób względny w stosunku do genu o stałej ekspresji w warunkach eksperymentu, tzw. genu referencyjnego (housekeeping gene), którym może być dowolny gen stale i jednolicie ekspresjonowany w róż­nych stadiach życia komórki np. β-aktyna, 18S rRNA, de­hydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa (GADPH) lub cyklofilina [37]. Otrzymany wynik wskazuje wtedy ile razy ekspresja badanego genu jest silniejsza/słabsza od ekspre­sji genu referencyjnego. Zastosowanie analizy względnej pozwala na wyznaczenie wyjściowej ilości materiału gene­tycznego biorącego udział w reakcji w jednostkach rzeczy­wistych, czyli liczbie kopii badanej sekwencji względem określonej liczby ng całkowitego DNA lub RNA w prze­liczeniu na komórkę, mililitr krwi lub gram tkanki [43]. Metoda qPCR służy nie tylko do ilościowej analizy bada­nego fragmentu, jest również wykorzystywana do rozróż­niania alleli genów polimorficznych. W tym przypadku do przeprowadzenia reakcji niezbędne są startery lub sondy swoiste dla genu zmutowanego i dla genu typu dzikiego. Wówczas identyfikacja homozygot allelu zmutowanego i dzikiego oraz heterozygot przeprowadzana jest na pod­stawie krzywej topnienia (ryc. 2, ilustracja E) [22,32,40].

Ryc. 2. Schemat zastosowania technik PCR. Badanie zmian w DNA (szlak I), badanie zmian w ekspresji mRNA (szlak II); M – marker DNA, K_p – kontrola pozytywna, K_n – kontrola negatywna, P1, P2, P3 – próby badane

Rycina 2 przedstawia różne rodzaje technik PCR mogą­cych znaleźć zastosowanie w toksykologii, w badaniach nad oddziaływaniem różnych substancji na poziomie mo­lekularnym. Na schemacie przedstawiono przykładowe wyniki elektroforezy w żelu agarozowym dla różnych od­mian PCR (ryc. 2, ilustracje A-D, F, H). Produkty zgod­ne wielkością z kontrolą pozytywną, świadczą o powsta­niu pożądanego fragmentu DNA w próbie badanej. Brak prążka lub powstanie fragmentów o różnej wielkości (od­miennej od kontroli pozytywnej) spowodowane jest wy­stąpieniem mutacji w badanym fragmencie DNA (ryc. 2, ilustracje A-D). Poziom ekspresji danego białka, można określić na podstawie ilości mRNA w komórce. W tym celu izolowany zostaje mRNA, przepisany za pomocą en­zymu odwrotnej transkryptazy na cDNA i powielony z uży­ciem reakcji PCR. Intensywność prążka jest proporcjonal­na do intensywności ekspresji badanego polipeptydu (ryc. 2, ilustracje F, H). W metodzie qPCR źródłem informacji o badanym materiale jest wykres zmian w czasie rzeczy­wistym (ryc. 2, ilustracje E, G).

Inną metodą opartą o technikę PCR jest metoda pokazu różnicowego (differential display), pozwalająca na bada­nie różnic w ekspresji wielu genów jednocześnie w ba­danej populacji. Technika pokazu różnicowego polega na amplifikacji produktów na matrycy jednoniciowego cDNA przepisanego z mRNA pochodzącego z dwóch różnych po­pulacji komórek za pomocą różnych kombinacji starterów oligonukleotydowych. Produkty amplifikacji, podobnie jak w przypadku pozostałych odmian PCR, są rozdzielane w żelu poliakrylamidowym. Zidentyfikowane różnice pod­dane są dalszej analizie, np. sekwencjonowaniu [3,23,24].

2. Znaczenie technik PCR w toksykologii

W metabolizmie ksenobiotyków uczestniczy wiele enzy­mów (xenobiotic-metabolizing enzymes – XMEs) biorą­cych udział zarówno w procesach aktywacji, jak i detoksy­kacji ksenobiotyków, w tym leków oraz środowiskowych karcynogenów. Większość substancji chemicznych wpro­wadzanych do naszego organizmu, niezależnie czy ma wła­ściwości lecznicze czy kancerogenne wymaga aktywacji metabolicznej przez enzymy I fazy (cytochrom P-450). Kolejny proces to zwykle detoksykacja przez enzymy II fazy, głównie hydrolazy epoksydowe, transferazy gluta­tionowe, N-acetylotransferazy czy sulfotransferazy [43]. Techniki PCR pozwalają m.in. na badanie mutacji genów kodujących te enzymy, czyli podatność organizmu na dzia­łanie ksenobiotyków i ich działanie toksyczne.

Genetycznie uwarunkowana wrażliwość na działanie ksenobiotyków – polimorfizm

Znaczący wpływ na toksyczność związków ma skutecz­ność detoksykacji drugiej fazy, a zwłaszcza uwarunkowa­na genetycznie aktywność enzymów z grupy transferaz. S-transferazy glutationowe (GST) to wielogenowa ro­dzina białek odpowiedzialnych za procesy detoksykacji, w szczególności za sprzęganie z glutationem kancerogen­nych amin lub węglowodorów [15]. Mutacje genów GSTM1 (S-transferaza glutationowa mi 1), GSTT1 (S-transferaza glutationowa theta 1) czy GSTP1 (S-transferaza glutatio­nowa pi), kodujących transferazy, powodują zmniejszenie lub całkowity brak aktywności GST, co zmienia wrażli­wość na niektóre ksenobiotyki. Wykorzystując metodę PCR można określić różnice osobnicze w obrębie genów kodujących enzymy z grupy transferaz warunkujące pre­dyspozycje danych osób na zapadalność na raka, czy też na inne choroby wywołane oddziaływaniem ksenobioty­ków na nasz organizm.

Badania wskazują, że występowanie mutacji w obrębie genu M1 transferazy glutationowej (GSTM1) znacząco wpływa na dzienne pobranie kancerogenów środowiskowych [6]. Gen GSTM1 odpowiada za aktywność S-transferazy glu­tationowej. Potwierdzono to po zbadaniu zależności mię­dzy genotypem a zapadalnością na raka pęcherza moczo­wego u ludzi. Posługując się techniką konkurującego PCR sprawdzono obecność lub brak genu GSTM1 w grupie ba­danej z zaawansowanym rakiem pęcherza oraz w grupie kontrolnej bez zmian nowotworowych. Zaobserwowano, że genotyp GSTM1 0/0 (brak genu GSTM1) warunkuje 70% wzrost zapadalności na raka pęcherza.

GST bierze udział w procesie detoksykacji karcynogenów zawartych w dymie papierosowym, dlatego zbadano za­padalność na raka pęcherza moczowego wśród palaczy. Wyniki wykazały, że wśród osób z genotypem GSTM1 0/0 zapadalność na raka pęcherza była zdecydowanie więk­sza u palących niż niepalących [29]. W innych badaniach, wykazano zależność między zapadalnością na raka płuc wśród biernych palaczy poddanych długotrwałej ekspozycji na dym papierosowy a występowaniem polimorfizmu ge­nów S-transferazy glutationowej. Wśród biernych palaczy, u których stwierdzono występowanie polimorfizmu genu GSTMl, ryzyko zapadalności na raka płuc zwiększyło się 2-3-krotnie [42]. Ponieważ próby pobierano częściowo od nieżyjących już pacjentów bądź z tkanek zakonserwowa­nych w parafinie metoda PCR znana jako nested PCR zo­stała wykorzystana w celu zwiększenia ilości materiału ge­netycznego do wykonywania dalszych analiz. Natomiast za pomocą ilościowego RT-PCR zostały oznaczone mutacje GSTM1. Badania nad zaćmą starczą wśród Egipcjan wy­kazały natomiast, że u osób z genotypem GSTM1 0/0 ry­zyko zachorowań zmalało. Wykorzystując metodę multi­plex PCR, wykazano, że delecja genu GSTM1 ma działanie ochronne, podczas gdy u osób posiadających zarówno gen GSTM1 jak i GSTT1 ryzyko zachorowań na zaćmę starczą istotnie wzrosło [1]. Jedną z głównych przyczyn zaćmy star­czej może być stres oksydacyjny. Enzymy z rodziny GST biorą udział w detoksykacji reaktywnych form tlenu [16]. Wyniki powyższych badań wskazują, że enzymy tej grupy mogą nie tylko być zaangażowane w procesy detoksyka­cji, ale też aktywacji. Badania wśród Włochów wykazały brak związku między zapadalnością na zaćmę a genotypem GSTM1 [2], natomiast wśród Japończyków będących no­sicielami delecji genu GSTM1 stwierdzona została zwięk­szona zapadalność na tę chorobę [33].

Metody PCR wykorzystano także do zbadania acetylotrans­feraz. Stosując techniki PCR-RFLP, wykazano zwiększo­ną zapadalność osób z mutacją alleli N-acetylotransferazy (NAT2) na raka pęcherza indukowanego aminami aro­matycznymi [5]. DNA został wyizolowany z limfocytów krwi obwodowej, poddany reakcji PCR, a następnie stra­wiony enzymami restrykcyjnymi charakterystycznymi dla każdego z alleli. W ten sposób zidentyfikowano trzy alle­le (M1, M2 i M3) odpowiedzialne za wolny fenotyp ace­tylacji amin arylowych, co korelowało z zapadalnością na raka wśród ich nosicieli. Badania wykazały swoistość NAT2 w detoksykacji karcynogennych aryloamin i w bio­aktywacji N-hydroksylowych pochodnych amin heterocy­klicznych obecnych w diecie [5].

Analizując wyniki powyższych doświadczeń można wy­sunąć hipotezę, że ryzyko wystąpienia raka czy też zacho­rowań u osób narażonych na stałe działanie toksycznych czynników środowiskowych jest ściśle związane ze zmien­nością osobniczą. Analiza genomu metodą PCR pozwa­la w takich przypadkach na podział osobniczy ze wzglę­du na podatność na różne choroby.

Badanie wpływu ksenobiotyków na ekspresję białek i poziom mRNA – biomarkery ekspozycji

Metody PCR umożliwiają badanie wpływu toksyn na eks­presję genów, także przez oznaczanie poziomu mRNA. Ze względu na niedokładność podstawowej metody RT-PCR większe znaczenie ma metoda qRT-PCR.

Toksyczne działanie czynników chemicznych można okre­ślić przez badanie różnic w poziomie ekspresji genów ko­dujących białka uczestniczące w ich metabolizmie. Tak zwane biomarkery ekspozycji, czyli białka których eks­presja koreluje ze skutkami toksycznymi [38], wyko­rzystywane są w diagnostyce i badaniach populacyjnych jako markery PCR. Techniką pozwalającą określić zmia­ny w syntezie białek na poziomie transkrypcji genów od­powiedzialnych za ich wytwarzanie jest qRT-PCR. Liczba cząsteczek mRNA powstałych podczas transkrypcji jest określona dla danej komórki, a tym samym dla tkanki, organu i całego organizmu w określonym stanie fizjolo­gicznym. Komórki w odpowiedzi na działanie określone­go czynnika (ksenobiotyku) uruchamiają bądź też zatrzy­mują transkrypcję genów, zmieniając w ten sposób skład transkryptomu. Badania na poziomie mRNA pełnią rolę diagnostyczną oraz umożliwiają badanie zmian aktywno­ści genów wywołanych działaniem toksycznych substan­cji chemicznych [20,41].

Stosując qRT-PCR wykazano zależną od czasu i dawki róż­nicę w ekspresji genów wątrobowych u myszy przyjmują­cych etynyloestradiol [7]. Zidentyfikowano potencjalne swo­iste tkankowo biomarkery ekspozycji na etynyloestradiol, które można wykorzystać w badaniach nad mechanizma­mi zaburzeń endokrynologicznych wywołanych przez kse­nobiotyki i produkty naturalne. Stosując metodę qRT-PCR zbadano estrogenozależną ekspresję zewnątrzkomórkowej oraz mitochondrialnej dysmutazy ponadtlenkowej (ecSOD – extracellular oraz MnSOD – mitochondrial manganese). Wykazano, że wzrost poziomu estrogenu u ludzi powo­duje zwiększoną ekspresję mRNA ecSOD oraz MnSOD w monocytach [36].

Nerki są jednym z głównych narządów wydalania toksyn, niestety wczesne wykrycie uszkodzeń tego organu jest czę­sto bardzo trudne. Najnowsze badania na szczurach [19] wy­kazują jednak, że metoda qRT-PCR umożliwia ich wczesne wykrycie. W badaniach tych szczurom podano substancje nefrotoksyczne w dwóch różnych dawkach przez 1, 3 i 14 dni, a następnie zanalizowano potencjalne markery nefro­toksyczności Kim-1 (kidney injury molecule-1), Lcn-1 (li­pocalin-2), clusterin i Timp-1 (tissue inhibitor of metallo­proteinase-1) w nerkach oraz moczu stosując test ELISA, metody immunohistochemiczne i qRT-PCR. Zmiany na poziomie molekularnym w ekspresji białek wykryte me­todą qRT-PCR korelowały z wynikami badań histopato­logicznych jednak zostały wykryte wcześniej i już po po­daniu znacznie mniejszych dawek.

Izoenzymy zespołu CYP

Cytochromy P450 (CYP) należą do grupy enzymów biorą­cych udział prawie w 80% reakcji metabolizmu fazy I le­ków. Dotychczas u ludzi zidentyfikowano około 39 aktyw­nych izoform enzymów CYP w jelitach, wątrobie, płucach, mózgu i nerkach. Enzymy te należą do głównych składo­wych systemu obrony organizmu przeciw wielu ksenobio­tykom. Ekspozycja na związki chemiczne często objawia się indukcją enzymów CYP. Ponieważ wzrost aktywno­ści enzymów P450 następuje w odpowiedzi na ksenobio­tyk, badanie poziomu ekspresji poszczególnych izoform P450 w tkankach, umożliwia rozpoznanie szkodliwego wpływu danej substancji na organizm [13,21]. Jeszcze do niedawna pomiar stopnia indukcji cytochromu P450 wy­magał zastosowania technik Northern i Western blotting, testów z immunosorbentami (ELISA), albo testów aktyw­ności enzymatycznej. Metody te wprawdzie pozwalają na rozróżnienie izoform genu P450, jednak nie jest możliwe precyzyjne oznaczenie ilościowe. Obecnie, ilościowe ba­danie ekspresji poszczególnych genów P450 możliwe jest przez zastosowanie metody qRT-PCR [18,39].

Większość wielopierścieniowych węglowodorów aroma­tycznych (WWA) powszechnie obecnych w dymie z pieców koksowniczych, w dymie papierosowym, w spalinach silni­ków wysokoprężnych oraz w przypalonym mięsie jest po­tencjalnymi karcynogenami [16]. Jednym z nich jest 3-me­tylocholantren (MC). Metabolizm MC przez enzymy CYP prowadzi do powstania wysoce reaktywnych półproduktów, które łącząc się kowalencyjnie z DNA często prowadzą do karcynogenezy [13]. Najnowsze badania in vitro [10] do­wiodły, że MC wywołuje trwałą indukcję ekspresji CYP1A1 w ludzkich komórkach raka wątroby HepG2 (human hepa­toma cells). Wykorzystując technikę qRT-PCR oznaczono poziom ekspresji mRNA CYP1A1 wyizolowanego z komó­rek HepG2 wystawionych na działanie MC. Zaobserwowano 8-20-krotny wzrost ekspresji w porównaniu z komórkami kontrolnymi (komórki HepG2 poddane działaniu DMSO), utrzymujący się na stałym poziomie przez 96 h.

Wykrywanie genów aktywowanych przez określone czynniki chemiczne

Reakcja PCR jest również niezawodną metodą w poszuki­waniach nowych genów, których ekspresja wywoływana jest substancjami chemicznymi. Metoda pokazu różnicowe­go (differential display) mRNA służy do identyfikacji no­wych genów bądź też wykazania różnic w ekspresji mRNA przez porównanie wyników ekspresji w dwóch próbach, tj. badanej, wystawionej na działanie danego czynnika tok­sycznego i kontrolnej [23,27]. Analiza zmian w ekspresji genów (pobudzenie, zahamowanie bądź utrzymywanie na stałym poziomie) w komórkach eksponowanych na dzia­łanie różnych czynników chemicznych jest ważnym zada­niem toksykologii molekularnej.

Metodą pokazu różnicowego zbadano ekspresję genów w mózgu szczurów po zażyciu kokainy lub amfetaminy [9]. Wyizolowano RNA z móżdżku, prążkowia i hipokam­pa szczurów godzinę po iniekcji dootrzewnowej, jednora­zowej dawki amfetaminy, kokainy i roztworu soli jako kon­troli, a następnie przeprowadzono pokaz różnicowy PCR. Otrzymano 12000 produktów PCR z czego 0,05% wykazy­wało różnice w ekspresji po zastosowaniu amfetaminy lub kokainy. Wyniki wskazują, że metoda pokazu różnicowego PCR może być wykorzystywana w celu wykazania swoistych zmian na poziomie transkryptomu wywołanych działaniem substancji chemicznej. Tą metodą wykryto również zmia­ny w ekspresji genów u ludzi chorych na raka mózgu [35].

Wykorzystując qRT-PCR zbadano ekspresję genów wy­wołaną oksydowanymi fosfolipidami (OxPAPC) in vitro i in vivo w porównaniu do ekspresji wywołanej przez li­popolisacharydy (LPS) [22]. W badaniach nad wpływem OxPAPC na ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowino­wej (human umbilical vein endothelial cells – HUVEC) oraz na myszy wykazano przydatność metody qRT-PCR zarówno w analizie in vitro jak i in vivo. Wykazano, że obydwa związki zarówno OxPAPC and LPS już po trzech godzinach po podaniu indukują ekspresję EGR-1 (ear­ly growth response factor 1) oraz MCP-1 (monocyte che­moattractant protein 1) w komórkach HUVEC, natomiast u myszy ekspresję homologu MCP-1 w wątrobie i sercu.

Znaleziono również różnice w ekspresji oksygenazy he­mowej 1 (HO-1). Tylko OxPAPC, ale nie LPS, wywoły­wał indukcję ekspresji oksygenazy w komórkach HUVEC, aorcie, sercu, wątrobie oraz w wyizolowanych krwinkach. Zastosowanie metody qRT-PCR pozwoliło na wykazanie znaczących różnic w ekspresji genów w różnych komór­kach i narządach mysich poddanych działaniu oksydowa­nych fosfolipidów oraz LPS.

Bardzo czułą metodą qRT-PCR zbadano ekspresję mRNA enzymów I i II fazy biotransformacji oraz białkowych transporterów błonowych pod wpływem rifampicyny i omeprazolu w ludzkich hepatocytach. Wykazano, że indukują one odmienne izoenzymy i białka, których stężenia wracają do normy po usunięciu induktora [30].

Te badania przedstawiają korzyści wynikające ze stosowa­nia ilościowego RT-PCR do analizy różnic w ekspresji ge­nów wywołanej różnymi bodźcami chemicznymi.

3. Podsumowanie

Od wynalezienia przez K.B Mullisa metody PCR upłynę­ło już wiele lat, a metoda ta wciąż jest rozwijana, ulepsza­na i wykorzystywana w coraz to innych dziedzinach nauki. Rozwój technik PCR pozwala na odkrywanie coraz to no­wych zastosowań tej metody, a co za tym idzie rozwój wie­lu dziedzin nauki, w tym także toksykologii. Dzięki zasto­sowaniu metody PCR, a przede wszystkim bardzo czułej qPCR w toksykologii możliwe staje się wykrycie zmian wywołanych przez daną substancję chemiczną w bardzo krótkim czasie, we wczesnym, jeszcze uleczalnym stadium. Techniki PCR pozwalają na wykrycie zmian chorobowych wywołanych już niewielkimi dawkami danej substancji, co ułatwi badania nad dawkowaniem leków. Być może praw­dopodobne stanie się w przyszłości określenie czy dana wrażliwość osobnicza w połączeniu z ekspozycją na dany ksenobiotyk warunkuje zachorowalność na raka bądź inne zmiany chorobowe. Badanie nowych biomarkerów ekspo­zycji technikami PCR pozwoliłoby na usprawnienie dia­gnostyki toksykologicznej. Wykrycie nowych białek indu­kowanych narażeniem na dany czynnik chemiczny pozwoli być może uzyskać informacje na temat mechanizmu dzia­łania danego ksenobiotyku w całej populacji bądź, bada­jąc jednocześnie uwarunkowania genetyczne, na indywi­dualną jednostkę.

PIŚMIENNICTWO

[1] Abdel Azeem A.A., Mahmoud A.A., Salaheldine M.M., Amr K.: Implication of glutathione S-transferase M1 and T1 polymorphisms in the development of senile cataract among Egyptians. Bratisl. Lek. Listy, 2009; 110: 678-683
[PubMed]  

[2] Alberti G., Oguni M., Podgor M.: Glutathione S-transferase M1 genotype and age-related cataracts. Lack of association in an Italian population. Invest. Ophthalmol. Vic. Sci., 1996; 37: 1167-1173
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[3] Bauer D., Muller H., Reich J., Riedel H., Ahrenkiel V., Warthoe P., Strauss M.: Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display technique (DDRT-PCR). Nucleic Acids Res., 1993; 21: 4272-4280
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[4] Bej A.K., Mahbubani M.H., Atlas R.M.: Amplification of nucleic acids by polymerase chain reaction (PCR) and other methods and their applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 1991; 26: 301-334
[PubMed]  

[5] Bell D.A., Taylor J.A., Butler M.A., Stephens E.A., Wiest J., Brubaker L.H., Kadlubar F.F., Lucier G.W.: Genotype/phenotype discordance for human arylamine N acetyltransferase (NAT2) reveals a new slow-acetylator allele common in African-Americans. Carcinogenesis, 1993; 14: 1689-1692
[PubMed]  

[6] Bell D.A., Taylor J.A., Paulson D.F., Robertson C.N., Mohler J.L., Lucier G.W.: Genetic risk and carcinogen exposure: A common inherited defect of the carcinogen-metabolism gene glutathione S-transferase M1 (GSTM1) that increases susceptibility to bladder cancer. J. Natl. Cancer Inst., 1993; 85: 1159-1164
[PubMed]  

[7] Boverhof D.R., Fertuck K.C., Burgoon L.D., Eckel J.E., Gennings C., Zacharewski T.R.: Temporal- and dose-dependent hepatic gene expression changes in immature ovariectomized mice following exposure to ethynyl estradiol. Carcinogenesis, 2004; 25: 1277-1291
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[8] Cotter F.E.: The role of polymerase chain reaction in pathology. J. Histotechnol., 1994; 17: 253-259

[9] Douglass J., McKinzie A.A., Couceyro P.: PCR differential display identifies a rat brain mRNA that is transcriptionally regulated by cocaine and amphetamine. J. Neurosci., 1996; 15: 2471-2481
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[10] Fazili I.S., Jiang W., Wang L., Felix E.A., Khatlani T., Coumoul X., Barouki R., Moorthy B.: Persistent induction of cytochrome P4501A1 in human hepatoma cells by 3-methylcholanthrene: Evidence for sustained transcriptional activation of the CYP1A1 promoter. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2010; 333: 99-109
[PubMed]  

[11] Felley-Bosco E., Pourzand C., Zijlstra J., Amstad P., Cerutti P.: A genotypic mutation system measuring mutations in restriction recognition sequences. Nucleic Acids Res., 1991; 19: 2913-2919
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[12] Fromont-Racine M., Bertrand E., Pictet R., Grange T.: A highly sensitive method for mapping the 5′ termini of mRNAs. Nucleic Acids Res., 1993; 7: 1683-1684
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[13] Guengerich F.P.: Roles of cytochrome P-450 enzymes in chemical carcinogenesis and cancer chemotherapy. Cancer Res., 1988; 48: 2946-2954
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[14] Hayashi K.: PCR-SSCP: A simple and sensitive method for detection of mutations in the genomic DNA. PCR Methods Appl., 1991; 1: 34-38
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[15] Hayes J.D., Flangan J.U., Jowsey I.R.: Glutathione transferases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2005; 45: 51-88
[PubMed]  

[16] Hemminki K.: Environmental carcinogens. W: Handbook of Experimental Pharmacology (red.: Cooper C.S., Grover P.L.), 33-61, Springer Verlag

[17] Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S., Griffith R.: Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology, 1992; 10: 413-417
[PubMed]  

[18] Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R.: Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993; 11: 1026-1030
[PubMed]  

[19] Hoffmann D., Adler M., Vaidya V., Rached E., Mulrane L., Gallagher W.M., Callanan J.J., Gautier J.C., Matheis K., Staedtler F., Dieterle F., Brandenburg A., Sposny A., Hewitt P., Ellinger-Ziegelbauer H., Bonventre J.V., Dekant W., Mally A.: Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol. Sci., 2010; 116: 8-22
[PubMed]  

[20] Ingelman-Sundberg M.: Polymorphism of cytochrome P450 and xenobiotic toxicity. Toxicology, 2002; 181-182: 447-452
[PubMed]  

[21] Ingelman-Sundberg M.: Pharmacogenetics of cytochrome P450 and its applications in drug therapy: the past, present and future. Trends Pharmacol. Sci., 2004; 25: 193-200
[PubMed]  

[22] Kadl A., Huber J., Gruber F., Bochkov V.N., Binder B.R., Leitinger N.: Analysis of inflammatory gene induction by oxidized phospholipids in vivo by quantitative real-time RT-PCR in comparison with effects of LPS. Vascular Pharmacology, 2002; 38: 219-227
[PubMed]  

[23] Liang P., Pardee A.B.: Differennal display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992; 257: 967-971
[PubMed]  

[24] Liang P., Pardee A.B.: Differential display. A general protocol. Mol. Biotechnol., 1998; 10: 261-267
[PubMed]  

[25] Lutz W., Kur B.: Toksykogenomika. Nowe perspektywy toksykologii molekularnej. Medycyna Pracy, 2004; 55: 193-202
[Full Text PDF]  

[26] Malarkey D.E., Maronpot R.R.: Polymerase chain reaction and in situ hybridization: applications in toxicological pathology. Toxicol. Pathol., 1996; 24: 13-23
[PubMed]  

[27] Mou L., Miller H., Li J., Wang E., Chalifour L.: Improvements to the differential display method for gene analysis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994; 199: 564-569
[PubMed]  

[28] Mullis K.B., Faloona F.A.: Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol., 1987; 155: 335-350
[PubMed]  

[29] Muscat J.E., Pittman B., Kleinman W., Lazarus P., Stellman S.D., Richie J.P.Jr.: Comparison of CYP1A2 and NAT2 phenotypes between black and white smokers. Biochem. Pharmacol., 2008; 76: 929-937
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[30] Nishimura M., Yoshitsugu H., Naito S., Hiraoka I.: Evaluation of gene induction of drug-metabolizing enzymes and transporters in primary culture of human hepatocytes using high-sensitivity real-time reverse transcription PCR. Yakugaku Zasshi, 2002; 122: 339-361
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[31] Papp A.C., Pinsonneault J.K., Cooke G., Sadée W.: Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques, 2003; 34: 1068-1072
[PubMed]  

[32] Riedy M.C., Timm E.A. Jr, Stewart C.C.: Quantitative RT-PCR for measuring gene expression. Biotechniques, 1995; 18: 70-74
[PubMed]  

[33] Sekine Y., Hommura S., Harada S.: Frequency of glutathione S-transferase 1 gene deletion and its possible correlation with cataract formation. Exp. Eye Res., 1995; 60: 159-163
[PubMed]  

[34] Sheffield V.C., Beck J.S., Kwitek A.E., Sandstrom D.W., Stone E.M.: The sensitivity of single-strand conformation polymorphism analysis for the detection of single base substitutions. Genomics, 1993; 16: 325-332
[PubMed]  

[35] Shinoura N., Shamraj O.I., Hugenholz H., Zhu J.G., McBlack P., Warnick R., Tew J.J., Wani M.A., Menon A.G.: Identification and partial sequence of a cDNA that is differentially expressed in human brain tumors. Cancer Lett., 1995; 89: 215-221
[PubMed]  

[36] Strehlow K., Rotter S., Wassmann S., Adam O., Grohé C., Laufs K., Böhm M., Nickenig G.: Modulation of antioxidant enzyme expression and function by estrogen. Circ. Res., 2003; 93: 170-177
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[37] Thellin O., Zorzi W., Lakaye B., De Borman B., Coumans B., Hennen G., Grisar T., Igout A., Heinen E.: Housekeeping genes as internal standards: use and limits. J. Biotechnol., 1999; 75: 291-295
[PubMed]  

[38] Timbrell J.A.: Biomarkers in toxicology. Toxicology, 1998; 129: 1-12
[PubMed]  

[39] Vanden Heuvel J.P., Clark G.C., Kohn M.C., Tritscher A.M., Greenlee W.F., Lucier G.W., Bell D.A.: Dioxin-responsive genes: Examination of dose-response relationships using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Cancer Res., 1994; 54: 62-68
[PubMed]  [Full Text PDF]  

[40] Walker N.J.: Real-time and quantitative PCR: Applications to mechanism-based toxicology. J. Biochem. Molecular Toxicology, 2001; 15: 121-127
[PubMed]  

[41] Wang E.J., Snyder R.D., Fielden M.R., Smith R.J., Gu Y.Z.: Validation of putative genomic biomarkers of nephrotoxicity in rats. Toxicology, 2008; 246: 91-100
[PubMed]  

[42] Wenzlaff A.S., Cote M.L., Bock C.H., Land S.J., Schwartz A.G.: GSTM1, GSTT1 and GSTP1 polymorphisms, environmental tobacco smoke exposure and risk of lung cancer among never smokers: a population-based study. Carcinogenesis, 2005; 26: 395-401
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

[43] Wyska E., Rosiak M.: Zastosowanie łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (real-time PCR) w badaniach farmakokinetycznych. Postepy Hig. Med. Dośw., 2006; 60: 660-666
[PubMed]  [Full Text HTML]  [Full Text PDF]  

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Pełna treść artykułu