Abstrakt

Aneksyna V (An V) jest białkiem należącym do rodziny białek cytoplazmatycznych wiążących wapń, znajdującym się w wielu tkankach organizmu, m.in w komórkach kanalików dystalnych oraz nabłonka kłębuszków nerkowych. Dotychczas poznana biologiczna rola tego białka jest związana z apoptozą. An V jest uznawana za wczesny marker tego procesu i wykorzystywana w jednej z częściej stosowanych technik detekcji apoptozy, przez wykrywanie zmian biochemicznych i morfologicznych zachodzących w komórkach. Oznaczanie jej może być pomocne do wyjaśnienia wielu procesów zachodzących w nerkach. Jej zwiększone stężenie wykazano zarówno w stanach ostrych, jak i przewlekłych. Stosując aneksynę V do identyfikacji komórek będących we wczesnej fazie apoptozy w ostrym odmiedniczkowym zapaleniu nerek o etiologii Escherichia coli wykazano, że hemolizyny patogennych bakterii stymulują śmierć komórek cewkowych, a nasilenie tego procesu zależy od dawki i czasu działania toksyny. W badaniach nad mechanizmem urazu reperfuzyjnego w ostrym uszkodzeniu nerek stwierdzono ochronne działanie syntetycznego homodimeru aneksyny V na komórki cewek nerkowych. W nefropatii cukrzycowej wykorzystano natomiast aneksynę V do badań nad wpływem zaburzeń metabolicznych na nasilenie apoptozy w komórkach cewek nerkowych. Ponadto oceniano przydatność oznaczania tego białka, jako biochemicznego markera miażdżycy u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek oraz wykorzystano w badaniach przyczyn upośledzonej odporności u pacjentów z tym rozpoznaniem. Dotychczas ukazały się nieliczne prace dotyczące znaczenia aneksyny V w chorobach nerek w populacji dziecięcej. U dzieci z zespołem nerczycowym oceniono przydatność prognostyczną aneksyny V, a także apoptozę limfocytów T.

Wprowadzenie

Aneksyna V, należąca do rodziny białek cytoplazmatycznych wiążących wapń, występuje w wielu tkankach organizmu. Jej obecność wykazano m.in w komórkach kanalików dystalnych oraz nabłonka kłębuszków nerkowych [5]. Dotychczas poznana jej biologiczna rola jest związana z apoptozą. Apoptoza będąca zaprogramowaną śmiercią komórki, umożliwia usunięcie z  organizmu szkodliwych, zbytecznych lub uszkodzonych komórek. Warunkuje prawidłowy rozwój i funkcjonowanie organizmu, jednak jej nasilenie obserwowuje się w wielu procesach patologicznych. Oznaczanie AnV, uznawanej za wczesny marker apoptozy, może być pomocne do wyjaśnienia wielu procesów zachodzących w nerkach.

Celem pracy jest przedstawienie dotychczasowych badań dotyczących zastosowania oznaczania aneksyny V w różnych schorzeniach nerek.

Budowa i funkcja aneksyny V

Aneksyny to rodzina białek cytoplazmatycznych wiążących wapń, charakteryzujących się zdolnością interakcji z błoną o ładunku ujemnym Ca2+-zależnie. Ich nazwa pochodzi od greckiego słowa annex oznaczającego „przynosić/trzymać razem” i opisuje podstawową właściwość aneksyn, tzn. wiązanie i utrzymywanie razem w całości biologicznych struktur, a zwłaszcza błony komórkowej. Aneksyny biorą udział w przekazywaniu sygnałów, proliferacji komórki oraz regulacji transportu komórkowego. Typowe cechy każdego białka tej grupy to zdolność do wiązania ujemnie naładowanych fosfolipidów Ca2+-zależnie oraz stały element strukturalny, zbudowany z sekwencji 70 aminokwasów [5,7].

Aneksyny są szeroko rozpowszechnione zarówno w królestwie roślin, jak i zwierząt. U ludzi zidentyfikowano 12 rodzajów tego białka, oznaczonych A1 – A11 i A13.

Cząsteczka aneksyny strukturalnie składa się z dwóch części: z COOH-końcowego rdzenia i NH2-końcowego regionu zmiennego. Rdzeń jest zbudowany z  powtórzeń sekwencji homologicznych aminokwasów i zawiera miejsca wiązania jonów Ca2+ i fosfolipidów błony komórkowej. NH2-końcowy region jest obszarem determinującym oddziaływanie z innymi białkami. Wykazano, że aneksyny tworzą zwarte cząsteczki o kształcie dysku z nieznacznym wgłębieniem w środku [5,9].

Aneksyna V (AnV) jest białkiem o masie cząsteczkowej 32–35 kDa i  punkcie izoelektrycznym 4,8-5,0. Bierze udział w przekazywaniu sygnałów i proliferacji komórki, regulacji transportu pęcherzykowego, w oddziaływaniu z błoną komórkową oraz w homeostazie wapnia. AnV ma silne właściwości antykoagulacyjne, jest inhibitorem fosfolipazy A2 oraz białkowej kinazy C. Jej obecność wykazano w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich naczyń krwionośnych, w płytkach krwi, limfocytach, makrofagach i na powierzchni erytrocytów. Występuje ponadto w dużych ilościach w komórkach kanalików dystalnych oraz nabłonka kłębuszków nerkowych [8]. Dotychczas poznana biologiczna rola tego białka jest związana z apoptozą [7,9].

Aneksyna V a apoptoza

Aneksyna V jest wykorzystywana w jednej z częściej stosowanych technik detekcji apoptozy przez wykrywanie zmian biochemicznych i  morfologicznych zachodzących w komórkach. Wczesnym objawem apoptozy jest utrata asymetrii w rozmieszczeniu lipidów błonowych w warstwie zewnętrznej i wewnętrznej, zachodząca bez naruszenia integralności błony komórkowej. Fosfatydyloseryna obecna w zdrowych komórkach od strony cytoplazmatycznej błony ulega przemieszczeniu do warstwy zewnętrznej, co stanowi sygnał pozwalający na rozpoznanie komórki apoptotycznej i sprawne jej usunięcie przez fagocyty. Aneksyna V wykazuje duże powinowactwo do fosfatydyloseryny, stąd oznaczanie jej umożliwia wykrycie zmian charakterystycznych dla apoptozy [7].

Oznaczanie AnV może być pomocne do wyjaśnienia wielu procesów odbywających się w nerkach. Zachodząca w tym narządzie apoptoza jest procesem będącym elementem ich fizjologicznego rozwoju lub następstwem uszkodzeń.

Aneksyna V w chorobach nerek

Zjawisko zaprogramowanej śmierci komórek badano m.in. w nefropatii cukrzycowej [17]. Zaburzenia metaboliczne w cukrzycy mają wpływ na rozwój patologicznych zmian w nerkach, tj.: ostrej hipertrofii komórek cewek nerkowych, przewlekłej nefropatii kłębuszkowej oraz śródmiąższowego włóknienia [13]. Ortiz i wsp. zasugerowali, że metaboliczne zmiany w cukrzycy wpływają na ekspresję genów regulatorowych apoptozy, indukując śmierć komórek nabłonka cewek nerkowych [14]. Bamri-Ezzine i wsp. ocenili proces apoptozy w nerczycy glikogenowej w przebiegu cukrzycy oraz udział w nim systemu Fas/Fas-L i aktywacji kaskady kaspaz. Badanie przeprowadzono na szczurach, u których wywołano stan hiperglikemii, podając dootrzewnowo streptozotocynę, a następnie pozostawiono przez 12 tygodni bez leczenia insuliną. Do identyfikacji populacji komórek apoptotycznych zastosowano aneksynę V oraz TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling). Po podaniu AnV do tętnicy nerkowej pobrano tkanki narządu i poddano je ocenie w mikroskopie świetlnym i elektronowym, a także wykonano badania immunohistochemiczne oraz immunofluorescencyjne. Wykazano dużą liczbę komórek o mocnym sygnale błonowym dla AnV, jako wczesnego markera apoptozy. Autorzy stwierdzili, że glikogen kumuluje się przede wszystkim w  komórkach cewek nerkowych dystalnych oraz w części grubej wstępującej pętli nefronu i wysunęli wnioski, że kumulacja glikogenu powoduje śmierć komórek cewek nerkowych w wyniku apoptozy, a system Fas/Fas-L odgrywa decydującą rolę w zainicjowaniu tego procesu [1].

Oznaczanie AnV zastosowano także w badaniach nad udziałem uropatogennej bakterii Escherichia coli i  jej toksyn w rozwoju apoptozy komórek proksymalnych cewek nerkowych [2]. Wiadomo, że w przebiegu ostrego odmiedniczkowego zapalenia nerek może dochodzić do powstania nieodwracalnych zmian o  charakterze blizn w nerkach, ale molekularne mechanizmy oddziaływania bakterii na tkankę nerkową pozostają niewyjaśnione. W badaniach eksperymentalnych Chen i wsp. poddali komórki cewek proksymalnych ekspozycji na toksyny uropatogennej E. coli O6K13H1 oraz niepatogennej W3110W [2]. Stosując aneksynę V do identyfikacji komórek będących we wczesnej fazie apoptozy stwierdzili, że tylko hemolizyny patogennych bakterii stymulują śmierć komórek cewkowych niezależnie od kaspaz, a  z  udziałem receptorów Fas aktywujących kinazę ERK1/2. Autorzy wykazali również zależność nasilenia procesu apoptozy od dawki i czasu działania toksyny [2]. Zdaniem badaczy toksyny bakteryjne prowadzą do zaburzeń wewnątrzkomórkowej homeostazy wapnia w cewkach proksymalnych, co wywołuje indukcję apoptozy w ich komórkach, a w konsekwencji bliznowacenie tkanki nerkowej.

AnV była również wykorzystana w  badaniach przyczyn upośledzonej odporności u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek (PChN). Główną rolę w zaburzeniach odporności pełnią limfocyty T. Ich obniżoną liczbę oraz nieprawidłową proliferację wykazano u chorych z PChN, zarówno w  okresie przeddializacyjnym, jak i  u  przewlekle dializowanych. Sugeruje się, że u tych pacjentów obwodowe komórki jednojądrzaste oraz monocyty mogą podlegać nasilonemu procesowi apoptozy [3]. Meier i wsp. podjęli próbę wyjaśnienia, w jakim stopniu zaburzenie to dotyczy limfocytów T u chorych na PChN. U ośmiu pacjentów z PChN w stadium przeddializacyjnym, osiemnastu dializowanych przynajmniej przez 6 miesięcy oraz u siedemnastu osób zdrowych stanowią- cych grupę kontrolną, oznaczono markery aktywacji limfocytów T (CD69) i apoptozy, m.in. aneksynę V. Wykazano, że u chorych na PChN jest znacząco więcej komórek o sygnale pozytywnym dla AnV, a więc znajdujących się w wczesnej fazie apoptozy. Ponadto stwierdzono, że jest to bardziej nasilone u pacjentów przewlekle dializowanych niż u leczonych zachowawczo [12].

Rola aneksyny V była także oceniana w ostrym uszkodzeniu nerek wywołanym ich niedokrwieniem oraz w urazie reperfuzyjnym. Zaburzenia te mogą być powikłaniem wstrząsu, przeszczepu nerki oraz operacji kardiologicznych. Największe znaczenie w patogenezie uszkodzenia nerek przypisuje się fazie reperfuzji, w przebiegu której dochodzi do martwicy cewek nerkowych oraz do powstania śródmiąższowych nacieków zapalnych. Wiadomo, że translokacja fosfatydyloseryny na zewnętrzną powierzchnię komórek cewkowych jest ważnym sygnałem prozapalnym w kaskadzie zdarzeń prowadzących do uszkodzenia nerek. Dochodzi wówczas do aktywacji limfocytów (szczególnie limfocytów T), układu komplementu, zwiększenia aktywności prozakrzepowej oraz infiltracji przez monocyty i makrofagi. Wever i wsp. wysunęli hipotezę, że osłonięcie grup fosfatydyloseryny może chronić komórki cewek nerkowych przed uszkodzeniem [16]. Wykorzystano powinowactwo aneksyny V do tych grup, jednak ze względu na szybki klirens tego białka, zastosowano w badaniu syntetyczny homodimer dianeksynę. Jego ochronne działanie oceniono u myszy, u których wywołano 20-minutowe niedokrwienie obu nerek, a następnie 3–8-dniowe zjawisko reperfuzji. Po podaniu dianeksyny zaobserwowano mniejsze uszkodzenie komórek proksymalnych cewek nerkowych, mniejszy napływ limfocytów, zmniejszenie transkrypcji i ekspresji markerów uszkodzenia nerek, takich jak NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin) i KIM-1 (kidney injury molecule-1) oraz poprawę funkcji nerek. Dianeksyna wydaje się zatem obiecującym narzędziem terapeutycznym, chroniącym przed skutkami niedokrwienia i reperfuzji nerek, ale wymaga to jednak dalszych obserwacji i badań klinicznych.

Kaneko i  wsp. ocenili stężenie aneksyny V we krwi chorych na różne schorzenia, w tym u 130 pacjentów z chorobami nerek, płuc i wątroby oraz u 23 z zawałem mięśnia sercowego rozpoznanym w ciągu 6 godzin od pojawienia się bólu w klatce piersiowej. Wyniki oznaczeń porównano z badaniami wykonanymi u 196 zdrowych osób, stanowiących grupę kontrolną. Wykazano, że stężenie aneksyny V w  osoczu gwałtownie rośnie u  91,3% badanych już we wczesnym stadium zawału serca, nawet jeśli aktywność kinazy kreatynowej pozostaje jeszcze w normie. Mogłoby to oznaczać, że aneksyna V jest dobrym markerem diagnostycznym zawału serca. Stwierdzono jednak, że w przypadku przebytych w  przeszłości ostrych zespołów wieńcowych, w  chorobach nerek oraz płuc stężenie aneksyny V w osoczu oscyluje w granicach normy, a u pacjentów po urazach i  z  rozpoznanymi chorobami wątroby jest tylko nieznacznie wyższe od tych w grupie kontrolnej [6].

Mastuda i  wsp. badali umiejscowienie aneksyny V w nerkach szczurów, u których wywołano kłębuszkowe zapalenie nerek. Oznaczono ponadto stężenie tego białka w osoczu i moczu zwierząt, stosując metody immunoenzymatyczne. Obecność aneksyny V wykazano przede wszystkim w cewkach dystalnych, ale również w kłębuszkach i w śródbłonku naczyń wewnątrznerkowych. Po podaniu antygenu nefrytogennego nie zaobserwowano zmian stężenia aneksyny V w osoczu, natomiast wykazano szybki jego wzrost w  moczu korelujący ze wzrostem stężeń dehydrogenazy mleczanowej (lactate aldehydrogenase – LDH) i N-acetylo-beta-D-glukozaminidazy (N-acetyl-β-glucosaminidase –NAG) [11].

Inne badania przeprowadzone przez tych autorów dotyczyły stężeń aneksyny V w moczu pacjentów z różnymi schorzeniami nerek. Stężenie AnV oznaczano metodą ELISA w moczu 25 chorych z zespołem nerczycowym (ZN), 16 z nefropatią toczniową, 25 z nefropatią IgA, 18 z PChN oraz u 105 osób bez nieprawidłowości w badaniu fizykalnym, badaniach biochemicznych krwi i moczu oraz bez hematurii i białkomoczu w wywiadzie. U chorych z pierwszych dwóch grup stwierdzono znacząco wyższe stężenie aneksyny V w moczu w porównaniu do grupy kontrolnej, najwyższe u pacjentów z zespołem nerczycowym. Korelowało ono dodatnio z białkomoczem, natomiast nie stwierdzono związku ze stężeniem w surowicy mocznika i kreatyniny oraz z klirensem kreatyniny endogennej. Na podstawie przedstawionych badań autorzy wysunęli wniosek, że wzrost stężenia aneksyny V w moczu jest wynikiem uwalniania jej z uszkodzonych struktur nerek, zarówno cewek dystalnych, jak i kłębuszków nerkowych. Brak wzrostu stężenia aneksyny V w moczu chorych na PChN wskazuje – zdaniem badaczy – na przydatność oznaczania tego białka jako wskaźnika ostrego uszkodzenia nerek [10].

Inni autorzy badali przydatność oznaczania AnV jako biochemicznego markera miażdżycy u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek. U 46 chorych z PChN bez objawów klinicznych miażdżycy oznaczono w krwi stężenie aneksyny V, lipidogram oraz zmierzono grubość kompleksu intima-media tętnicy szyjnej. Stwierdzono, że obniżeniu przesączania kłębuszkowego towarzyszy wzrost stężenia aneksyny V we krwi, co koreluje z zaburzeniami lipidogramu. Zdaniem badaczy wzrost stężenia tego białka u chorych z przewlekłą chorobą nerek może wskazywać na dysfunkcję śródbłonka naczyń i  być wskaźnikiem prognostycznym rozwoju powikłań sercowo-naczyniowych w chorobach nerek [4].

Simsek i wsp. badali przydatność oznaczania aneksyny V jako markera prognostycznego u dzieci z zespołem nerczycowym. Do badania zakwalifikowano 23 dzieci ze steroidowrażliwym zespołem nerczycowym, 22 dzieci ze steroidoopornym zespołem nerczycowym oraz 22 zdrowych (grupa kontrolna). U badanych oznaczono we krwi stężenie aneksyny V, mocznika, kreatyniny, białka całkowitego, albumin i cholesterolu oraz w 24-godzinnej zbiórce moczu stężenie AnV, białka i kreatyniny. Stwierdzono istotnie wyższe stężenie aneksyny V w moczu pacjentów ze steroidoopornym zespołem nerczycowym w porównaniu do pozostałych grup dzieci. Nie wykazano istotnej różnicy między stężeniami tego białka w moczu chorych ze steroidowrażliwym zespołem nerczycowym a grupą kontrolną, zarówno w czasie rzutu, jak i remisji choroby. Stwierdzono, że stężenie aneksyny V w dobowej zbiórce moczu nie koreluje z jej stężeniem we krwi ani z białkomoczem we wszystkich badanych grupach. Według badaczy zwiększone stężenie AnV w  moczu pacjentów ze steroidoopornym zespołem nerczycowym może być skutkiem nasilonej apoptozy w tkance nerkowej w następstwie choroby i stanowić wskaźnik dalszego przebiegu ZN [15].

Zachwieja i wsp. zastosowali AnV w badaniu procesu apoptozy limfocytów T u dzieci z ZN. Wykazali, że liczba komórek limfocytów T we wczesnej fazie apoptozy była znacząco większa w grupie dzieci z pierwszym rzutem zespołu nerczycowego w  porównaniu z  grupą dzieci znajdujących się w remisji i osobami z grupy kontrolnej [18]. Wyniki te wskazują, że zmniejszenie się liczby i zaburzenie funkcji limfocytów T u dzieci z zespołem nerczycowym w czasie rzutu wynika z nasilenia apoptozy tych komórek.

Podsumowanie

Aneksyna V jest białkiem występującym w  dużych ilościach w  komórkach kanalika dystalnego oraz nabłonka kłębuszków nerkowych. Dzięki dużemu powinowactwu do fosfatydyloseryny, oznaczanie jej umożliwia wykrycie wczesnych zmian charakterystycznych dla apoptozy. Oznaczając stężenie aneksyny V w krwi lub moczu wykazano znamienny udział apoptozy w wielu stanach patologicznych nerek. Jej zwiększone stężenie wykazano zarówno w  stanach ostrych, takich jak ostre odmiedniczkowe zapalenie nerek, ostre uszkodzenie nerek, jak i  przewlekłych np. nefropatia cukrzycowa. Być może dalsze badania umożliwią, że w przyszłości białko to będzie mogło być wykorzystywane jako narzędzie diagnostyczne, dzięki czemu możliwe będzie wykrycie zmian na wczesnym etapie rozwoju, a więc odpowiednio wczesne wdrożenie terapii.

Przypisy

• 1. Bamri-Ezzine S., Ao Z.J., Londoño I., Gingras D., Bendayan M.:Apoptosis of tubular epithelial cells in glycogen nephrosis duringdiabetes. Lab. Invest., 2003; 83: 1069-1080
  Google Scholar
• 2. Chen M., Jahnukainen T., Bao W., Daré E., Ceccatelli S., Celsi G.:Uropathogenic Escherichia coli toxins induce caspase-independentapoptosis in renal proximal tubular cells via ERK signaling. Am. J.Nephrol., 2003; 23: 140-151
  Google Scholar
• 3. Cohen G., Hörl W.H.: Immune dysfunction in uremia – an update.Toxins, 2012; 4: 962-990
  Google Scholar
• 4. Emanuel V.L., Mnuskina M.M., Smirnov A.V., Panina I.I., RumiantsevA.S., Vasina E.I., Vasina L.B.: Annexin-5 as a biochemical markerof early vascular disorders under chronic disease of kidneys. Klin.Lab. Diagn., 2013; 4: 9-10
  Google Scholar
• 5. Gerke V., Moss S.E.: Annexins: from structure to function. Physiol.Rev., 2002; 82: 331-371
  Google Scholar
• 6. Kaneko N., Matsuda R., Hosoda S., Kajita T., Ohta Y.: Measurementof plasma annexin V by ELISA in the early detection of acute myocardialinfarction. Clin. Chim. Acta, 1996; 251: 65-80
  Google Scholar
• 7. Lizarbe M.A., Barrasa J.I., Olmo N., Gavilanes F.: Annexin-phospholipidinteractions. Functional implications. Int. J. Mol. Sci., 2013; 14: 2652-2683
  Google Scholar
• 8. Marchewka Z.: Low molecular weight biomarkers in the nephrotoxicity.Adv. Clin. Exp. Med., 2006; 15: 1129-1138
  Google Scholar
• 9. Markoff A., Gerke V.: Expression and functions of annexins in thekidney. Am. J. Physiol. Renal. Physiol., 2005; 289: 949-956
  Google Scholar
• 10. Matsuda R., Kaneko N., Horikawa Y., Chiwaki F., Shinozaki M.,Abe S., Yumura W., Nihei H., Ieiri T.: Measurement of urinary annexinV by ELISA and its significance as a new urinary-marker of kidneydisease. Clin. Chim. Acta, 2000; 298: 29-43
  Google Scholar
• 11. Matsuda R., Kaneko N., Horikawa Y., Chiwaki F., Shinozaki M.,Ieiri T., Suzuki T., Ogawa N.: Localization of annexin V in rat normalkidney and experimental glomerulonephritis. Res. Exp. Med.,2001; 200: 77-92
  Google Scholar
• 12. Meier P., Dayer E., Blanc E., Wauters J.P.: Early T cell activationcorrelates with expression of apoptosis markers in patients withend-stage renal disease. J. Am. Soc. Nephrol., 2002; 13: 204-212
  Google Scholar
• 13. Nyengaard J.R., Flyvbjerg A., Rasch R.: The impact of renalgrowth, regression and regrowth in experimental diabetes mellituson number and size of proximal and distal tubular cells in therat kidney. Diabetologia, 1993; 36: 1126-1131
  Google Scholar
• 14. Ortiz A., Ziyadeh F.Z., Neilson E.G.: Expression of apoptosis-regulatorygenes in renal proximal tubular epithelial cells exposedto high ambient glucose and in diabetic kidneys. J. Invest. Med.,1997; 45: 50-56
  Google Scholar
• 15. Simsek B., Buyukcelik M., Soran M., Bayazit A.K., Noyan A., SeydaogluG., Anarat A.: Urinary annexin V in children with nephroticsyndrome: a new prognostic marker? Pediatr. Nephrol., 2008;23: 79-82
  Google Scholar
• 16. Wever K.A., Wagener F.A., Frielink C., Boerman O.C., Scheffer G.J.,Allison A., Masereeuw R., Rongen G.A.: Diannexin protects againstrenal ischemia reperfusion injury and targets phosphatidylserinesin ischemic tissue. PLoS One, 2011; 6: e24276
  Google Scholar
• 17. Woo D.: Apoptosis and loss of renal tissue in polycystic kidneydiseases. N. Engl. J. Med., 1995; 333: 18-25
  Google Scholar
• 18. Zachwieja J., Dworacki G., Bobkowski W., Dobrowolska-ZachwiejaA., Zaniew M., Maciejewski J.: Increased apoptosis of peripheralblood lymphocytes in children with nephrotic syndrome. Pediatr.Nephrol., 2002; 17: 197-200
  Google Scholar

Pełna treść artykułu